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    基于原生質(zhì)體法保加利亞乳桿菌電轉(zhuǎn)化條件的研究

    2019-05-18 06:55:34王莎莎盧海強(qiáng)田洪濤羅云波
    中國(guó)食品學(xué)報(bào) 2019年3期
    關(guān)鍵詞:原生質(zhì)溶菌酶保加利亞

    郭 鑫 王莎莎 李 晨 盧海強(qiáng) 田洪濤* 羅云波

    (1 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院 河北保定071001 2 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院 北京100083)

    乳酸菌是正常人腸道中重要的生理菌群,具有維持人體中微生態(tài)平衡的作用,與人體健康息息相關(guān)。目前,乳酸菌轉(zhuǎn)化載體DNA 的方法主要有電轉(zhuǎn)化法和原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法。與電轉(zhuǎn)化法相比,原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法的設(shè)備條件要求較低、方法簡(jiǎn)單、結(jié)果可靠,具有明顯的技術(shù)優(yōu)勢(shì),而實(shí)現(xiàn)乳酸菌原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵步驟是原生質(zhì)體的制備與再生[1]。近年來(lái),已有關(guān)于嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌、保加利亞乳桿菌、 干酪乳桿菌及瑞士乳桿菌等乳酸菌原生質(zhì)體制備、再生及融合方面的研究報(bào)道[2-6]。

    保加利亞乳桿菌屬于化能異養(yǎng)型微生物,是酸奶及發(fā)酵乳飲料在儲(chǔ)藏期間發(fā)生后酸化的主要菌株,其具有非常強(qiáng)的產(chǎn)酸能力和耐酸性,同時(shí)具有產(chǎn)香的特性使酸奶具有特殊的香氣。鑒于保加利亞乳桿菌的重要益生作用與特點(diǎn),對(duì)其進(jìn)行深入研究至關(guān)重要。

    本研究以質(zhì)粒pMG36e 為載體,保加利亞乳桿菌Lb-MH 為受體,采用原生質(zhì)體電轉(zhuǎn)化方法研究溶菌酶濃度、質(zhì)粒濃度、電轉(zhuǎn)化參數(shù)、復(fù)蘇培養(yǎng)基組成對(duì)電轉(zhuǎn)化效率的影響,建立最佳的轉(zhuǎn)化條件,提高電轉(zhuǎn)化效率,為進(jìn)一步乳桿菌的改造和基因功能探究奠定了基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    1.1.1 菌株與質(zhì)粒 保加利亞乳桿菌MH(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus,MH)來(lái)自本試驗(yàn)分離的優(yōu)良菌種。質(zhì)粒pMG36e,由中國(guó)科學(xué)院微生物研究所贈(zèng)送;大腸桿菌-乳酸乳球菌穿梭組成型表達(dá)載體,保存于大腸桿菌DH5α 中;乳酸乳球菌復(fù)制子pWV01,滾環(huán)型復(fù)制(RCR),大小3.6 kb;啟動(dòng)子P32;紅霉素抗性標(biāo)記(Emr);多克隆位點(diǎn)(MCS)。

    1.1.2 培養(yǎng)基及緩沖液

    1)MRS 培養(yǎng)基:參照文獻(xiàn)[7]配制MRS 液體或固體培養(yǎng)基,調(diào)節(jié)pH 6.4~6.8,115 ℃滅菌20 min,室溫冷卻備用。

    2)SMRS 培養(yǎng)基:含有0.5 mol/L 蔗糖的MRS培養(yǎng)基。

    3)含2%甘氨酸的SMRS 培養(yǎng)基:用蒸餾水配成40%的甘氨酸母液,115 ℃20 min 滅菌,使用時(shí)取0.5 mL 加入SMRS 培養(yǎng)基中。用來(lái)培養(yǎng)受體細(xì)胞,制成原生質(zhì)體。

    4)再生培養(yǎng)基RM1:液體MRS 培養(yǎng)基。5)再生培養(yǎng)基RM2:液體SMRS 培養(yǎng)基。

    6)再生培養(yǎng)基RM3[8-9]:在不含Tween 80 的MRS 培養(yǎng)基中添加CaCl22.8 g/L,MgCl25.0 g/L,蔗糖171.2 g/L,胎牛血清(BSA)5.0 mL/L。

    7)再生培養(yǎng)基RM4[10]:以甘露醇91.0 g/L 代替RM3 中的蔗糖,其它成分和配制方法相同。

    8)原生質(zhì)體制備液[11](SMM):0.5 mol/L 蔗糖,順丁烯二酸0.019 mol/L,MgCl20.02 mol/L,用1 mol/L NaOH 調(diào)pH 值至7.8。

    9)電擊緩沖液 (PB):0.5 mol/L 蔗糖,10%的甘油,調(diào)pH 值至7.0。

    1.1.3 酶和試劑 紅霉素用無(wú)水乙醇配成質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL 的母液,0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾,于-20 ℃保存?zhèn)溆?;Taq DNA 聚合酶為大連寶生物公司產(chǎn)品;溶菌酶(20.000 U/mg):購(gòu)自上海生工。

    1.1.4 主要儀器 PC Module & Gene Pulser X cell:BIO RAD;0.1 cm 規(guī)格電轉(zhuǎn)杯;BiometraTprofessional PCR 儀,德國(guó)Biometra;高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)(型號(hào)20G),上海安亭科學(xué)儀器廠。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 大腸桿菌DH5α 中質(zhì)粒(pMG36e)的提取及定量檢測(cè)

    1)大腸桿菌DH5α 中質(zhì)粒(pMG36e)的提?。翰捎肧DS 堿裂解小量分離大腸桿菌質(zhì)粒的方法。

    2)質(zhì)粒(pMG36e)的定量檢測(cè):質(zhì)粒 DNA(μg/mL)=OD260×50(μg/mL)×稀釋倍數(shù)

    1.2.2 篩選轉(zhuǎn)化子的紅霉素濃度的確定 配制不同 含 量0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0,3.5,4.0,4.5,5.0,6.0,7.0,8.0,9.0,10.0 μg/mL 紅霉素的MRS 平板,進(jìn)行涂布生長(zhǎng),到達(dá)對(duì)數(shù)期的保加利亞乳桿菌05-20 在37 ℃靜止培養(yǎng)2~3 d 觀察結(jié)果,根據(jù)抗生素平板上保加利亞乳桿菌菌落的生長(zhǎng)情況確定篩選轉(zhuǎn)化子的紅霉素濃度。

    1.2.3 原生質(zhì)體的制備 將保加利亞乳桿菌菌粉活化3 次,鏡檢,平板劃線挑取單菌落,37 ℃培養(yǎng)16~18 h,以1%接種量轉(zhuǎn)接到含2%甘氨酸的10 mL SMRS 培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)16 h,4 ℃,12 000 r/min,離心2 min 收集菌體,加預(yù)冷的SMM 緩沖液洗滌3 次離心去上清,用質(zhì)量濃度為10,20,30,40 mg/mL 的溶菌酶重懸,37 ℃酶解。0.5 h 后每10 min 取樣進(jìn)行革蘭氏染色后用光學(xué)顯微鏡觀察原生質(zhì)體形成情況,待視野內(nèi)原生質(zhì)體的形成率達(dá)60%~70%即可終止酶解反應(yīng)。酶解結(jié)束后以加入1 mL 冰冷的電擊緩沖液PB,3 500 r/min,10 min,4 ℃離心收集原生質(zhì)體。再用電擊緩沖液洗滌3 次后重懸于電擊緩沖液中,以50 μL 每支分裝于預(yù)冷的無(wú)菌EP 管中,-80 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.4 電轉(zhuǎn)化 分別取1 μL 質(zhì)量濃度為0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2,1.4 μg/μL 的質(zhì)粒pMG36e(大腸桿菌中提?。┘尤?0 μL 原生質(zhì)體,混合后冰浴5 min。另取一支50 μL 原生質(zhì)體不加入質(zhì)粒作為對(duì)照。將混合液加入預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯中(0.1 cm),使用BIO-RAD 電轉(zhuǎn)儀,設(shè)置相應(yīng)的電轉(zhuǎn)化參數(shù),進(jìn)行電擊。電擊后立即向電轉(zhuǎn)杯中加入950 μL 再生培養(yǎng)基,混勻后倒入無(wú)菌EP 管中。于37 ℃水浴復(fù)蘇培養(yǎng),取用復(fù)蘇培養(yǎng)基梯度稀釋后的電擊轉(zhuǎn)化細(xì)胞液100 μL,涂布到含相應(yīng)濃度紅霉素的MRS 平板上,于37 ℃倒置培養(yǎng)2~3 d 后,對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行計(jì)數(shù)并計(jì)算轉(zhuǎn)化效率。

    轉(zhuǎn)化效率:即每微克外源DNA 所能產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化子數(shù)。轉(zhuǎn)化效率=轉(zhuǎn)化子數(shù)/加入的DNA 量(μg)×稀釋倍數(shù)

    1.2.5 正交試驗(yàn)確定影響電轉(zhuǎn)化效率的因素 用不同的溶菌酶濃度、質(zhì)粒濃度、電場(chǎng)強(qiáng)度、再生培養(yǎng)基進(jìn)行四因素四水平的正交試驗(yàn),篩選電轉(zhuǎn)化保加利亞乳桿菌Lb-MH 的最優(yōu)條件(表1)。

    1.2.6 保加利亞乳桿菌MH 陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的鑒定隨機(jī)挑取紅霉素篩選平板上的單菌落于含紅霉素的10 mL 液體MRS 培養(yǎng)基中,37 ℃置培養(yǎng)16~18 h,進(jìn)行菌液PCR。根據(jù)pMG36e 的紅霉素抗性和終止子相關(guān)基因序列分別設(shè)計(jì)引物,即:pMG36e1:5’-CAATTCCTGCATGTTTTAAGG-3’;pMG36e2:5’-GAGGATGAGGAGGCAGATTG-3’,采用常規(guī)方法進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,預(yù)期PCR 產(chǎn)物為800 bp。然后采用乳酸菌提質(zhì)粒方法[12]對(duì)陽(yáng)性菌株進(jìn)行提質(zhì)粒驗(yàn)證。

    表1 保加利亞乳桿菌正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test on the Lb-MH

    2 結(jié)果

    2.1 溶菌酶濃度對(duì)電轉(zhuǎn)化效率的影響

    將保加利亞乳桿菌MH 在一定培養(yǎng)條件下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中期經(jīng)洗滌緩沖液Ⅰ洗滌,并配成質(zhì)量濃度分別為10,20,30 和40 mg/mL 的溶菌酶酶液在37 ℃酶解,至鏡檢時(shí)視野內(nèi)出現(xiàn)60%左右原生質(zhì)體,加入1 μL 質(zhì)量濃度為1 μg/uL 的從大腸桿菌中提取的質(zhì)粒pMG36e,用2 mm 電轉(zhuǎn)杯按電阻200 Ω,電容25 μF,電場(chǎng)強(qiáng)度7.5 kV/cm 進(jìn)行電擊,之后用RM3 作為再生培養(yǎng)基進(jìn)行復(fù)蘇培養(yǎng),最終獲得的電轉(zhuǎn)化效率如圖1。

    2.2 質(zhì)粒濃度對(duì)電轉(zhuǎn)化效率的影響

    將保加利亞乳桿菌MH 在MRS 培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中期接至含甘氨酸濃度最適的SMRS(即分別含甘氨酸2%)中繼續(xù)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中期,收獲菌體后以洗滌緩沖液Ⅰ處理,采用溶菌酶進(jìn)行酶解,制成原生質(zhì)體后加入1 μL 不同濃度的質(zhì)粒進(jìn)行電轉(zhuǎn)化結(jié)果見(jiàn)圖2。

    2.3 電場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)電轉(zhuǎn)化效率的影響

    圖1 不同溶菌酶濃度對(duì)保加利亞乳桿菌MH 電轉(zhuǎn)化效率的影響Fig.1 Effects of different Lysozyme concentrations on electrotransformation efficiency with Lb-MH

    電轉(zhuǎn)化過(guò)程中每個(gè)因素都可能對(duì)電轉(zhuǎn)化效率造成影響,相對(duì)來(lái)說(shuō)電場(chǎng)強(qiáng)度是對(duì)其影響較大的因素。本試驗(yàn)采用0.1 cm 的電轉(zhuǎn)杯,在電容為25 μF,電阻為200 Ω 固定不變的條件下。選取6.0,6.5,7.0,7.5,8.0,8.5,9.0,9.5 和10.0 kV/cm 等幾個(gè)不同的電場(chǎng)強(qiáng)度,研究電場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)保加利亞乳桿菌MH 電轉(zhuǎn)化效率的影響。

    由圖3可知,在固定電阻為200 Ω,電容為25 μF 時(shí),開(kāi)始電轉(zhuǎn)化效率隨電場(chǎng)強(qiáng)度的增加而提高,當(dāng)電場(chǎng)強(qiáng)度達(dá)到8.0 kV/cm 時(shí),轉(zhuǎn)化效率達(dá)到最高,隨后隨著電場(chǎng)強(qiáng)度的增加電轉(zhuǎn)化效率反而下降。造成這種現(xiàn)象的原因可能是,當(dāng)電場(chǎng)強(qiáng)度過(guò)低時(shí)不能使細(xì)胞膜形成孔洞,致使外源DNA 分子不容易進(jìn)入細(xì)胞[13],而電場(chǎng)強(qiáng)度過(guò)高時(shí)細(xì)胞死亡率會(huì)增大。所以在一定范圍內(nèi)電場(chǎng)強(qiáng)度越強(qiáng)時(shí),細(xì)胞膜上產(chǎn)生的孔洞越多,通透性越好,外源DNA分子越易進(jìn)入細(xì)胞,電場(chǎng)強(qiáng)度過(guò)高或過(guò)低都會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率。

    2.4 復(fù)蘇培養(yǎng)基對(duì)電轉(zhuǎn)化效率的影響

    圖2 質(zhì)粒濃度對(duì)保加利亞乳桿菌MH 電轉(zhuǎn)化效率的影響Fig.2 Effects of plasmid concentrations on electrotransformation efficiency with Lb-MH

    將保加利亞乳桿菌MH 在MRS 培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中期后分別轉(zhuǎn)接至含甘氨酸濃度最適的SMRS(即分別含甘氨酸2%)中繼續(xù)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中期,收獲菌體后以洗滌緩沖液Ⅰ處理,用30 mg/mL 溶菌酶進(jìn)行酶解,制成原生質(zhì)體后加入1 μL 質(zhì)量濃度為1 μg/μL 的質(zhì)粒,用2 mm 電轉(zhuǎn)杯按電阻200 Ω,電容25 μF,電場(chǎng)強(qiáng)度7.5 kV/cm 進(jìn)行電轉(zhuǎn)化,分別以RM1、RM2、RM3 和RM4作為再生培養(yǎng)基,測(cè)得其對(duì)應(yīng)電轉(zhuǎn)化效率見(jiàn)圖4。

    由于電擊使細(xì)胞膜產(chǎn)生孔洞,致使細(xì)胞在非高滲液中容易破裂,因此細(xì)胞在電擊后必須在高滲的培養(yǎng)基中進(jìn)行復(fù)蘇。本試驗(yàn)在電擊完畢后分別向電轉(zhuǎn)杯中加入950 μL 的RM1、RM2、RM3、RM4 液體培養(yǎng)基,混勻后倒入無(wú)菌EP 管中,37℃培養(yǎng)。探究復(fù)蘇培養(yǎng)基對(duì)電轉(zhuǎn)化效率的影響。

    在其它條件相同的情況下,用RM3 作為再生培養(yǎng)基比使用RM1、RM2、RM4 獲得的電轉(zhuǎn)化效率有大幅度的提高。方差分析顯示:RM1、RM2 和RM3 復(fù)蘇培養(yǎng)基對(duì)電轉(zhuǎn)化效率的影響差異極顯著(P<0.01),RM3 再生培養(yǎng)基的效果最好。因此后續(xù)研究選RM3 作為復(fù)蘇培養(yǎng)基。

    圖3 電場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)保加利亞乳桿菌MH 電轉(zhuǎn)化效率的影響Fig.3 Effects of electric filed strength on electrotransformation efficiency with Lb-MH

    圖4 再生培養(yǎng)基對(duì)保加利亞乳桿菌MH 電轉(zhuǎn)化效率影響Fig.4 Effects of incubation medium components on electrotransformation efficiency with Lb-MH

    2.5 正交試驗(yàn)優(yōu)化

    分析結(jié)果表明,影響保加利亞乳桿菌MH 電轉(zhuǎn)化效率的4 個(gè)因素主次順序?yàn)椋弘妶?chǎng)強(qiáng)度>復(fù)蘇培養(yǎng)基>質(zhì)粒濃度>溶菌酶濃度(表2),而保加利亞乳桿菌電轉(zhuǎn)化的最適條件為C2D3B3A2,即場(chǎng)強(qiáng)為7.5 kV/cm,復(fù)蘇培養(yǎng)基Ⅲ,質(zhì)粒質(zhì)量濃度1.2 μg/μL、溶菌酶質(zhì)量濃度30 mg/mL。按此最優(yōu)條件進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證,重復(fù)3 次取平均數(shù),電轉(zhuǎn)化效率達(dá)到1.42×105CFU/μg DNA。對(duì)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR 及提質(zhì)粒驗(yàn)證。

    表2 正交試驗(yàn)優(yōu)化電轉(zhuǎn)化保加利亞乳桿菌的條件Table 2 Results of orthogonal tests for optimizing electro transformation of Lb-MH

    2.6 轉(zhuǎn)化子的鑒定

    2.6.1 陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子PCR 鑒定 從紅霉素篩選平板上隨機(jī)挑取10 個(gè)單菌落,接入新鮮的含紅霉素質(zhì)量濃度為0.5 μg/mL 的MRS 液體培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)16 h。經(jīng)菌液PCR 后,電泳檢測(cè)結(jié)果表明,在800 bp 左右均出現(xiàn)了與目的條帶大小吻合的條帶。表明含有Emr 的PMG36e 質(zhì)粒已成功電轉(zhuǎn)化到保加利亞乳桿菌MH 中。

    2.6.2 提質(zhì)粒鑒定 保加利亞乳桿菌MH 轉(zhuǎn)化子進(jìn)行質(zhì)粒提取,經(jīng)電泳檢測(cè)結(jié)果可知,保加利亞乳桿菌MH 轉(zhuǎn)化子中提取的質(zhì)粒分子質(zhì)量大小與從大腸桿菌DH5α 中提取的質(zhì)粒大小一致(3 610 bp),即證明質(zhì)粒pMG36e 成功轉(zhuǎn)入保加利亞乳桿菌MH 中。

    圖5 保加利亞乳桿菌MH 轉(zhuǎn)化子菌液PCR 圖Fig.5 The detection of plasmid in Lb-MH by colony PCR

    圖6 保加利亞乳桿菌MH 質(zhì)粒圖Fig.6 Agarose gel electrophoresis of plasmid Lb-MH

    3 討論

    電轉(zhuǎn)化方法是細(xì)菌、 真菌等微生物體內(nèi)導(dǎo)入外源基因的常見(jiàn)方法之一,該方法操作簡(jiǎn)單方便,近年來(lái)已廣泛應(yīng)用于乳酸菌的轉(zhuǎn)化中。電轉(zhuǎn)化的原理是利用高壓電脈沖使細(xì)胞膜發(fā)生瞬間的可逆穿孔,從而使游離的外源DNA 穿過(guò)細(xì)胞膜轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中。然而由于其存在轉(zhuǎn)化率低、重復(fù)性差等缺點(diǎn),已成為制約乳酸菌分子生物學(xué)研究和基因工程技術(shù)發(fā)展的關(guān)鍵因素。本研究針對(duì)影響電轉(zhuǎn)化效率的幾個(gè)主要因素——溶菌酶濃度、 質(zhì)粒濃度、電場(chǎng)強(qiáng)度、復(fù)蘇培養(yǎng)基組成等進(jìn)行了研究,探明電轉(zhuǎn)化的最適條件,成功實(shí)現(xiàn)了保加利亞乳桿菌的高效遺傳轉(zhuǎn)化。

    本研究發(fā)現(xiàn),在其他條件一定的情況下,保加利亞乳桿菌在7.5 kV/cm 時(shí)達(dá)到最高的電轉(zhuǎn)化效率,這可能跟乳酸菌細(xì)胞璧厚度有關(guān)。有文獻(xiàn)表明變?nèi)芫貙?duì)于弱化細(xì)胞壁制備原生質(zhì)體效果更佳,但其成本較高。因此本試驗(yàn)通過(guò)適當(dāng)提高溶菌酶濃度,并配合最適洗滌緩沖液,在保證適宜的pH 和離子條件下也可實(shí)現(xiàn)較高的原生質(zhì)體制備率,因?yàn)樵谠|(zhì)體制備過(guò)程中,緩沖液通過(guò)洗滌細(xì)胞使其處于理想的離子環(huán)境中。本研究結(jié)果表明溶菌酶質(zhì)量濃度為30 mg/mL 可提高轉(zhuǎn)化效率。外源質(zhì)粒的濃度對(duì)電轉(zhuǎn)化效率也有影響。1989年Mcintyre 研究發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞濃度不變的情況下,添加不同濃度的外源質(zhì)粒,得到的轉(zhuǎn)化子數(shù)目也會(huì)發(fā)生變化[15]。質(zhì)粒DNA 濃度過(guò)低或過(guò)高時(shí)轉(zhuǎn)化效率都有所下降。本研究發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞濃度一定,DNA質(zhì)量濃度為1.2 μg/μL 時(shí)電轉(zhuǎn)化效率最高。細(xì)胞在經(jīng)過(guò)電擊后,可直接涂布在含有抗生素的平板上,或在不含抗生素的液體培養(yǎng)基中復(fù)蘇一段時(shí)間,再涂布于含抗性的固體平板上,兩種方法對(duì)轉(zhuǎn)化效率有很大的影響[15]。Wei 等[16]研究發(fā)現(xiàn)后者比前者轉(zhuǎn)化效率高60~80 倍。除此之外,對(duì)于電擊后菌體復(fù)蘇來(lái)說(shuō),除去復(fù)蘇時(shí)間的影響,復(fù)蘇培養(yǎng)基中的成分也起著很大作用,如蔗糖有利于細(xì)胞膜的恢復(fù),并且可使細(xì)胞在滲透壓突然改變的情況下不致死亡。只有復(fù)蘇培養(yǎng)基中含有的穩(wěn)定劑能夠提供菌體所需要的營(yíng)養(yǎng)成分和滲透壓,才會(huì)提高細(xì)胞的存活率,從而提高轉(zhuǎn)化效率。

    綜上所述,本試驗(yàn)中確定了質(zhì)粒pMG36e 電轉(zhuǎn)化保加利亞乳桿菌Lb-MH 的最適參數(shù),為外源基因電轉(zhuǎn)化保加利亞乳桿菌提供了可靠的參考數(shù)據(jù)。同時(shí)為乳桿菌進(jìn)一步改造和基因功能探究以及遺傳育種、菌種改良奠定了基礎(chǔ)。

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