田建軍 張開屏 景智波 楊明陽 靳 燁*
(1 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 呼和浩特010018 2 內(nèi)蒙古商貿(mào)職業(yè)學(xué)院食品工程系 呼和浩特010070)
低pH 香腸是在我國傳統(tǒng)自然發(fā)酵肉制品的基礎(chǔ)上,通過添加微生物發(fā)酵劑使其快速產(chǎn)酸,降低香腸的pH 值,在發(fā)酵結(jié)束時香腸的pH 值達(dá)到規(guī)定安全酸度5.3 以下,香腸成品色澤呈玫瑰紅色,風(fēng)味獨(dú)特,貨架期變長[1-3]。pH 值、風(fēng)味物質(zhì)等變化離不開糖類、 脂肪、 蛋白質(zhì)等物質(zhì)的分解氧化,pH 值的變化主要是由乳酸菌對糖類物質(zhì)分解產(chǎn)生乳酸等小分子有機(jī)酸所致,通過添加乳酸菌發(fā)酵劑可縮短香腸發(fā)酵周期,并且低酸度有利于抑制香腸中腐敗菌和致病菌的生長,影響營養(yǎng)物質(zhì)與水分子結(jié)合能力和亞硝酸鹽等酶類活性,因此添加乳酸菌發(fā)酵劑對發(fā)酵肉制品加工具有重大益處[4-5]。香腸干燥成熟過程為游離脂肪酸釋放的關(guān)鍵時期,游離脂肪酸進(jìn)一步被氧化分解為醇、醛、酮等風(fēng)味物質(zhì),脂肪氧化分解是香腸風(fēng)味物質(zhì)的主要來源[6-7]。蛋白質(zhì)主要被分解為核苷、核苷酸及游離氨基酸等,這些小分子物質(zhì)被稱為非蛋白質(zhì)。有研究表明,香腸中蛋白質(zhì)水解反應(yīng)主要由內(nèi)源蛋白酶催化,這些酶包括組織蛋白酶與鈣激活蛋白酶,多數(shù)情況下微生物產(chǎn)生的酶類對蛋白質(zhì)不起作用[8]。在干燥成熟期間,蛋白質(zhì)和脂肪進(jìn)入氧化分解高峰期。本試驗(yàn)設(shè)置3 個試驗(yàn)組,分別為自然發(fā)酵對照組、 單一組瑞士乳桿菌組和瑞士乳桿菌與木糖葡萄球菌復(fù)配組,通過這3 組對比說明微生物發(fā)酵劑和內(nèi)源組織酶對蛋白質(zhì)和游離脂肪酸釋放的影響。
1.1.1 主要原輔料 原料肉:羊肉(內(nèi)蒙古蒙羊公司提供,肥瘦比為1∶4)。腸衣:25 mm 羊小腸。輔料:食鹽、抗壞血酸。發(fā)酵劑:瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)和木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus),由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院肉品科學(xué)技術(shù)團(tuán)隊(duì)提供。
1.1.2 主要藥品 葡萄糖、蔗糖、硝酸鈉、亞硝酸鈉、正己烷、三氟化硼-乙醚、氯化鈉、氫氧化鈉均為分析純;甲醇、三氯甲烷、丙酮、37 種游離脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品。
1.1.3 主要儀器 F-11 pH 計(jì),香港興萬電子儀器有限公司;HD-3A 智能水分活度測量儀,上海精密儀器儀表公司;LRH-250-HS 恒溫恒濕培養(yǎng)箱,天津市福元銘儀器設(shè)備有限公司;SXT-02 索氏抽提器,上海洪紀(jì)儀器設(shè)備有限公司;GZX-9246MBE 數(shù)顯式鼓風(fēng)干燥箱,上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器,上海亞榮生化儀器廠;GC2014 島津氣相色譜儀,日本島津公司。
1.2.1 香腸工藝 配方:瘦肉80%、肥膘20%、蔗糖0.5%、葡萄糖0.5%、食鹽2.5%、硝酸鈉100 mg/kg、亞硝酸鈉70 mg/kg、抗壞血酸0.05%、發(fā)酵劑108CFU/g。
工藝流程:原料肉→瘦肉絞碎,肥肉切丁→攪拌腌制(4 ℃,12 h)→灌腸→排氣→發(fā)酵 (25 ℃,RH=90%~95%,60 h)→干燥→成熟→成品。
工藝條件:
表1 發(fā)酵香腸工藝條件Table 1 Fermented sausage processing conditions
1.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在采用預(yù)試驗(yàn)以及單因素模擬試驗(yàn)基礎(chǔ)上,發(fā)酵劑瑞士乳桿菌與木糖葡萄球菌最佳復(fù)配比為1 ∶2。本試驗(yàn)共分3 組,第1 組為對照組 (即不添加發(fā)酵劑),第2 組為瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)單一組,第3 組為瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)和木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus)發(fā)酵劑復(fù)配組(1 ∶2)。分別于灌腸后(0 d)、腌制(0.5 d)、發(fā)酵結(jié)束(3 d)、干燥中期(6 d)、干燥結(jié)束即成熟(9 d)、后熟24 d、37 d 等工藝點(diǎn)測定香腸理化指標(biāo)。
1.2.3 理化指標(biāo)測定
1.2.3.1 pH 的測定 參照GB9695.5-2008 的方法,將25 g 樣品粉碎后加入225 mL 蒸餾水錐形瓶中,磁力攪拌0.5 h,待穩(wěn)定用pH 計(jì)測定。
1.2.3.2 Aw 的測定 采用TESTO650 水分活度儀,將樣品切碎并平鋪放于稱放皿中,測定10min,記錄結(jié)果,重復(fù)3 次。
1.2.3.3 亞硝酸鹽測定 依據(jù)GB 5009-33-2010測定。
1.2.3.4 蛋白質(zhì)分解指數(shù)測定 將2 g 肉樣加到盛18 mL 蒸餾水的50 mL 離心管中,用組織破碎機(jī)均質(zhì)2 min,然后在5 ℃條件下100 r/min 離心15 min,用whatman1# 過濾上清液,重復(fù)一次,稱量濾液體積 (V)。取15 mL 濾液和15 mL 10%TCA,在室溫下靜置30 min,與上述同樣條件下離心,用whatman4# 過濾上清液,取5 mL 用凱氏定氮的方法測定氮含量N1,通過N0(0.2V×N1)計(jì)算非蛋白氮含量,總氮含量為N。蛋白水解指數(shù)PI=N0/N。
1.2.3.5 脂肪酸測定 脂肪酸提?。簩悠返蜏叵路鬯椋缓蠓Q取10 g 樣品于250 mL 三角瓶中,加入135 mL Folch 液(三氯甲烷∶色譜級甲醇=2∶1),振搖3 h,浸泡8 h 后用G3 漏斗過濾,移取5 mL、20%的NaCl 溶液于濾液中。待靜止分層后,吸取下層液體,在下層液體中加入適量無水Na2SO4脫水。稍等片刻,將液體吸入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶,在40 ℃的水浴條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā),濃縮即得脂肪。加入0.5 mol/L 的NaOH/CH3OH 溶液5 mL,70 ℃下回流5 min。加入5 mL 三氟化硼-乙醚和甲醇混合液(1∶3),70 ℃下回流2 min,進(jìn)行甲酯化。再加3 mL 正己烷,70 ℃下回流1 min。接著加入5 mL 飽和NaCl溶液,靜置10 min,移取1 mL 上層液體于1.5 mL 離心管中,放入-80 ℃冰箱中待測。
氣相色譜條件:升溫程序:初溫為120 ℃,保持5 min,然后以4 ℃/min 的速率升至250 ℃,250℃保持28 min;進(jìn)樣口溫度250 ℃,檢測器溫度280 ℃;載氣為高純氮?dú)猓?9.99%),氫氣流速為40 mL/min,恒定柱流速為1.1 mL/min,分流比20 ∶1;進(jìn)樣量1.0 μL。
脂肪酸含量計(jì)算:
脂肪酸含量計(jì)算公式(1):
式中:Xi——100g 脂肪中各脂肪酸含量,mg/100g;Asi——試樣溶液中各脂肪酸甲酯的峰面積;Cstdi——脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)液中各脂肪酸甲酯的質(zhì)量濃度,mg/mL;V——加入正己烷的體積,mL;Fi——各脂肪酸甲酯轉(zhuǎn)化為脂肪酸的換算系數(shù);Astdi——標(biāo)準(zhǔn)液中各脂肪酸甲酯的峰面積;m——10 g 香腸中的脂肪含量。
采用Excel 和SAS9.0 對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
發(fā)酵肉制品pH 下降主要由于原料肉中微生物及外加乳酸菌分解糖類物質(zhì)生成乳酸所致,添加乳酸菌和葡萄球菌可以產(chǎn)生脂肪酶與蛋白酶,對脂肪和蛋白分解會產(chǎn)生游離脂肪酸和氨基酸,但也伴隨著脫氨等分解反應(yīng)的進(jìn)行,因而當(dāng)產(chǎn)酸速率低于產(chǎn)氨等堿性物質(zhì)生成速率時,或隨著干燥成熟進(jìn)行,水分含量逐漸下降及蛋白質(zhì)緩沖作用等,又會使pH 逐漸回升[9-10]。
圖1 不同發(fā)酵劑產(chǎn)酸能力對比Fig.1 Comparison of acid production capacity of different fermentation agents
如圖1所示,發(fā)酵香腸在0~0.5 d 腌制期間由于溫度(4 ℃)較低致使原料肉中微生物生命活動被抑制,pH 基本沒有變化;腌制結(jié)束,將原料肉進(jìn)行灌腸排氣,然后在25 ℃、90% RH 條件下發(fā)酵,在發(fā)酵過程中3 個試驗(yàn)組pH 分別快速下降,發(fā)酵結(jié)束時(3 d)對照組、單一組、復(fù)配組pH 分別為5.25,5.1,4.95,對照組>單一組>復(fù)配組,3 組差異顯著(P<0.05),由此可知添加復(fù)配發(fā)酵劑產(chǎn)酸速率>單一發(fā)酵劑>對照組,說明植物乳酸菌與木糖葡萄球菌復(fù)配可加速乳酸含量增加,也可能促使游離脂肪酸和游離氨基酸生成;在3~6 d 干燥過程中,加工環(huán)境溫度和濕度(RH)急劇下降到15℃、85%,香腸水分含量也不斷降低,致使乳酸菌等活性被抑制,蛋白質(zhì)被分解產(chǎn)生堿性物質(zhì)可能相對加快,促使整體pH 出現(xiàn)回升現(xiàn)象,6 d 末干燥結(jié)束時對照組、單一組、復(fù)配組3 組pH 分別為5.45,5.46,5.35;在6~9 d 成熟過程中,溫度降到13 ℃、RH 降為75%,此時環(huán)境濕度急劇降低,導(dǎo)致香腸Aw 低于0.85,大部分微生物生命活動被抑制,酶活性也受到影響,因而氨類物質(zhì)產(chǎn)生速率下降,成熟過程中pH 變化也變緩,最后分別升到5.73,5.56,5.60;成品在一周和兩周貯藏情況下,與成熟期結(jié)束時pH 差異不顯著(P>0.05)。
水分活度(Aw)已經(jīng)成為衡量食品保藏期長短的一個重要指標(biāo),可以說Aw 是控制食品腐敗變質(zhì)的重要因素。從微生物與Aw 關(guān)系來說,當(dāng)Aw 大于某個臨界值時,特定微生物才能得以生長,如絕大多數(shù)細(xì)菌要求Aw 大于0.9、霉菌要求Aw 大于0.8,而耐鹽菌要求最低Aw 為0.75,當(dāng)Aw 低于0.6 時絕大多數(shù)微生物無法生長;從酶與水分活度關(guān)系來看,Aw 高低影響酶促反應(yīng)底物流動性以及酶的構(gòu)象,當(dāng)食品中Aw<0.85 時,酶活性大幅下降[11]。因此Aw 成為衡量食品品質(zhì)和貨架期的一個重要影響因素。
圖2 不同發(fā)酵劑對低酸發(fā)酵香腸Aw 影響Fig.2 Effects of different starter cultures on Aw of low acid fermented sausages
由圖2中3 組Aw 變化趨勢可知,原料肉、腌制、 發(fā)酵結(jié)束3 個階段Aw 變化微小,3 組Aw 均在0.98±0.5 范圍內(nèi),且3 組差異不顯著(P>0.05);3d 發(fā)酵結(jié)束香腸環(huán)境溫度和濕度都隨之降低,進(jìn)入干燥初期,在3~6 d 干燥過程中,環(huán)境溫度和RH 均低于香腸內(nèi)部值,因而形成溫度和濕度降低梯度,干燥初期結(jié)束時對照組、單一組、復(fù)配組Aw分別降低到0.91,0.90,0.89,與發(fā)酵結(jié)束時0.98(Aw)相比,下降速率復(fù)配組>單一組>對照組,說明添加混合發(fā)酵劑可能較單一發(fā)酵劑更有助于Aw 下降,這一現(xiàn)象與吳滿剛等[12]研究結(jié)果相似;6~9 d 成熟過程中,各組Aw 仍急劇下降,在9 d 末對照組、單一組、復(fù)配組分別為0.85,0.84,0.83;在9~37 d 過程中,Aw 下降緩慢,在37 d 末對照組和單一組均為0.83、復(fù)配組降到組中最低0.82。
亞硝酸鹽是肉制品重要的發(fā)色劑,此外還具有抑菌防腐作用,并可消除原料肉不適風(fēng)味,提高產(chǎn)品質(zhì)量[13]。亞硝酸鹽作為強(qiáng)氧化劑可氧化亞鐵為高鐵,失去攜帶氧氣能力,產(chǎn)生中毒現(xiàn)象;當(dāng)亞硝酸鹽過量時,會與食品中胺類物質(zhì)結(jié)合生成亞硝胺強(qiáng)致癌物質(zhì)[14]。
圖3 不同發(fā)酵劑對低酸發(fā)酵香腸亞硝酸鹽變化的影響Fig.3 Effects of different starter culture on nitrite changes of low acid fermented sausages
由圖3可知,原來肉中也含有一定量亞硝酸鹽,但含量符合國家規(guī)定安全合格標(biāo)準(zhǔn),小于30 mg/kg[15];在腌制結(jié)束時相比原料肉含量有所上升,是因?yàn)樵陔缰七^程中加入硝酸鹽和亞硝酸鹽;3 d末發(fā)酵結(jié)束,3 組亞硝酸鹽含量急劇上升,對照組、 單一組、 復(fù)配組含量分別為36.8,40.2,42.5 mg/kg,相比腌制結(jié)束,復(fù)配組亞硝酸鹽增加速率顯著快于單一組(P<0.05),與含量最低對照組差異極顯著(P<0.01),這一現(xiàn)象可能是由于復(fù)合發(fā)酵劑產(chǎn)生硝酸鹽還原酶含量高于其他兩組,加速亞硝酸鹽含量上升;隨著香腸進(jìn)入干燥初期,環(huán)境溫度和RH 的降低,Aw 下降,硝酸鹽還原酶活性可能被抑制或發(fā)酵劑對亞硝酸鹽分解速率加快,促使整體亞硝酸鹽含量急劇下降[16];6~9 d 成熟過程,對照組和復(fù)配組含量變化差異微?。辉诔墒旖Y(jié)束時復(fù)配組急劇下降,在37 d 末3 組均下降到整個過程最低值,對照組、單一組、復(fù)配組含量分別為24.8,22.3,11.330 mg/kg,低于國標(biāo)規(guī)定30 mg/kg[15]。說明添加復(fù)合發(fā)酵劑可有效降低成品香腸中亞硝酸鹽含量,提高產(chǎn)品安全性。
蛋白質(zhì)分解指數(shù)代表香腸中蛋白質(zhì)被分解程度,分解產(chǎn)物被稱為非蛋白氮,主要為核苷、核苷酸以及游離氨基酸等。這些物質(zhì)在肉制品風(fēng)味貢獻(xiàn)方面起著相當(dāng)重要的作用。原料肉中蛋白質(zhì)分?jǐn)?shù)指數(shù)PI 為20%,腌制期間PI 降為16%;在發(fā)酵結(jié)束時,對照組PI 仍為16%,單一組上升至19%,復(fù)配組卻下降到13%,可能復(fù)配組較低pH 抑制蛋白質(zhì)分解酶的活性;隨著發(fā)酵結(jié)束干燥過程開始,各組pH 均急劇上升,表明蛋白分解酶活性逐漸增強(qiáng),在6 d 末干燥結(jié)束時3 組PI 均上升至25%;在6~9 d 時,復(fù)配組PI 以平均25%速率急劇上升,9 d 末即成熟結(jié)束時復(fù)配組PI 高達(dá)33%,高于對照組30%和單一組29%,且對照組>單一組,說明蛋白質(zhì)分解主要依賴于原料肉中蛋白酶而非乳酸菌,并且加入的木糖葡萄球菌對游離氨基酸等非蛋白氮物質(zhì)產(chǎn)生也貢獻(xiàn)一定力量;9~23 d 的成品貯藏兩周過程中PI 略有上升,但在23~37 d貯藏過程中各組PI 基本保持不變。
圖4 腸乳中蛋白質(zhì)分解指數(shù)PIFig.4 Protein decomposing index of fermented sausages
游離脂肪酸是由脂肪氧化分解形成,此過程受到加工工藝溫度、發(fā)酵pH、濕度等條件影響[17]。所添加的發(fā)酵劑乳酸菌等具有分解有機(jī)酸、 脂肪酸等酶系,可分解生成有機(jī)酸降低肉制品pH,同時也可將產(chǎn)品中脂肪分解為短鏈揮發(fā)性脂肪酸、醛、酯等賦予發(fā)酵肉制品特有風(fēng)味[18],還可促進(jìn)飽和脂肪降解、 加速單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸的釋放[19]。
圖5表明,飽和脂肪酸在原料肉中含量較高,可能原料肉中脂肪酶及微生物數(shù)量較少,已生成的飽和脂肪酸沒有被及時轉(zhuǎn)化或分解;隨著發(fā)酵開始,接種發(fā)酵劑的單一組和復(fù)配組飽和脂肪酸含量均降低,相比單一組,復(fù)配組下降幅度較大,由原料肉中18.98 mg/kg 降至發(fā)酵結(jié)束時的6.13 mg/kg,而對照卻大幅上升,發(fā)酵結(jié)束時對照組SFA 含量24.97 mg/kg 顯著高于原料肉中15.13 mg/kg,可能添加的瑞士乳桿菌和木糖葡萄球菌發(fā)酵劑在發(fā)酵期間大量繁殖促使飽和脂肪酸轉(zhuǎn)化或分解[20],導(dǎo)致復(fù)配組SFA 含量快速下降,根據(jù)飽和脂肪酸可引起高血壓、高血脂和血膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇升高等疾病,因而添加復(fù)配發(fā)酵劑可能降低這些富貴病發(fā)生機(jī)率;在3~9 d 干燥成熟過程中,各組飽和脂肪酸含量均下降,成熟結(jié)束時復(fù)配組含量顯著低于單一組(P<0.01);成品貯藏14 d 后SFA 含量與成熟結(jié)束時成品相比,各組飽和脂肪酸變化不顯著;但香腸被貯藏28 d 后與貯藏14 d 后的SFA 含量相比,復(fù)配組仍有小幅下降,單一組含量減少較多。
圖6表明,對照組MUFA 含量呈先上升后下降趨勢,在9 d 末成熟結(jié)束時含量達(dá)到最高,為52.77 mg/kg,顯著高于此時單一組33.6 mg/kg 和復(fù)配組31.6 mg/kg;整個過程單一組和復(fù)配組MUFA 含量一直呈現(xiàn)上升趨勢,與對照組成熟后期貯藏過程中MUFA 含量變化規(guī)律恰好相反;通過比較3 組MUFA 含量變化,可知在0~23 d 對照組含量一直高于單一組和復(fù)配組,且單一組和復(fù)配組MUFA 含量差異不顯著(P>0.05),可能是由于內(nèi)源脂肪酶對MUFA 的釋放起到主要作用,這一現(xiàn)象與沈清武[19]研究相一致。
圖5 不同發(fā)酵劑對低酸香腸SFA 含量影響Fig.5 Effects of different fermentation agents on the SFA of the low acid sausages
圖6 不同發(fā)酵劑對低酸香腸MUFA 含量影響Fig.6 Effects of different fermentation agents on the MUFA of the low acid sausages
圖7 不同發(fā)酵劑對低酸香腸PUFA 含量影響Fig.7 Effects of different fermentation agents on the PUFA of the low acid sausages
由圖7可知,在干燥結(jié)束之前,PUFA 釋放速率:對照組>復(fù)配組>單一組,說明香腸在干燥前脂肪的水解主要由內(nèi)源酶引起;在成熟和后期貯藏過程中,復(fù)配組MUFA 釋放速率>對照組和單一組,說明木糖葡萄球菌對脂肪水解主要發(fā)生在香腸成熟后期。由圖6和圖7可知,單不飽和脂肪酸(MUFA)釋放速率>多不飽和脂肪酸(PUFA)。通過圖5、圖6和圖7可知,復(fù)配組香腸在成熟后期:單不飽和脂肪酸(MUFA)含量>多不飽和脂肪酸(PUFA)>飽和脂肪酸 (SFA);單一組與對照組:MUFA 含量>SFA>PUFA。
通過添加瑞士乳桿菌及木糖葡萄球菌,將本試驗(yàn)分為對照組、 瑞士乳桿菌單一發(fā)酵劑組以及瑞士乳桿菌與木糖葡萄球菌復(fù)配發(fā)酵劑組:在60 h 發(fā)酵過程中,復(fù)配組pH 快速下達(dá)到香腸安全控制范圍,且復(fù)配組pH<單一組<對照組,說明添加復(fù)配發(fā)酵劑可迅速降低香腸pH、縮短香腸發(fā)酵周期;由于復(fù)配組pH 快速下降,減小蛋白質(zhì)等物質(zhì)對水分子的束縛能力,促使水分Aw 下降速率快于單一組和對照組;pH 下降也抑制硝酸鹽還原酶活性,在香腸成熟及貯藏期降低亞硝酸鹽含量,降到國標(biāo)規(guī)定安全值30 mg/kg 以下。
通過探究內(nèi)源酶和微生物發(fā)酵劑對蛋白質(zhì)分解和游離脂肪酸釋放速率可知:對照組、單一組、復(fù)配組3 組蛋白質(zhì)分解指數(shù)PI 在發(fā)酵結(jié)束后呈現(xiàn)逐漸上升趨勢,且復(fù)配組蛋白質(zhì)分解指數(shù)PI>對照組>單一組,說明內(nèi)源組織蛋白酶對香腸中蛋白質(zhì)分解起到主要作用,木糖葡萄球菌對蛋白質(zhì)分解能力>瑞士乳桿菌。添加瑞士乳桿菌與木糖葡萄球菌可有效降低香腸中飽和脂肪酸SFA 含量,在3~37d,復(fù)配組SFA 含量<單一組<對照組;對于單不飽和脂肪酸MUFA,0~23 d 對照組含量高于單一組和復(fù)配組,說明原料肉中內(nèi)源脂酶對MUFA釋放速率>瑞士乳桿菌和木糖葡糖球菌;在0~6 d內(nèi)源脂酶對PUFA 釋放速率,對照組>復(fù)配發(fā)酵劑>單一瑞士乳桿菌,在6~37 d 復(fù)配發(fā)酵劑釋放PUFA 速率>對照組,說明在干燥結(jié)束后微生物脂肪對PUFA 的釋放起到主要作用。成品香腸中不飽和脂肪(UFA)含量>飽和脂肪酸(SFA),且復(fù)配組香腸中不飽和脂肪酸含量顯著高于對照組(P<0.05),飽和脂肪酸含量<對照組。