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    仿刺參膠原蛋白多肽對Ⅱ型糖尿病小鼠腎臟的保護機制

    2019-05-18 06:55:12韓姣姣李妍妍蘆晨陽張凌芷蘇秀榕寧波大學(xué)海洋學(xué)院浙江寧波5寧波大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院浙江寧波5阿卜杜拉國王科技大學(xué)吉達(dá)沙特阿拉伯王國
    中國食品學(xué)報 2019年3期
    關(guān)鍵詞:刺參多肽通路

    韓姣姣 李妍妍 周 君 蘆晨陽 李 曄 張凌芷 蘇秀榕*( 寧波大學(xué)海洋學(xué)院 浙江寧波5 寧波大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院 浙江寧波5 阿卜杜拉國王科技大學(xué) 吉達(dá),沙特阿拉伯王國)

    仿刺參(Apostichopus joponicus),屬棘皮動物門(Echinodermata)、海參綱(Holothuriodea)、盾手目動物(Aspidochirota)、刺參科(Stichopodidae)、仿刺參屬(Apostichopus)[1]。近代科學(xué)研究表明,刺參體內(nèi)含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì),如膠原蛋白、多肽、皂苷以及微量元素等,具有多種生理功能[2-7]。仿刺參膠原蛋白和多糖主要存在于體壁中,對調(diào)控人的生理功能具有重要的意義,其主要的生理活性表現(xiàn)在抗氧化、抗腫瘤、抗血脂、抗血栓等。

    糖尿病腎?。―iabeticnephropathy,DN)是糖尿病常見的慢性并發(fā)癥之一,在糖尿病患者中20%~40%會發(fā)生腎病[8]。近年來,許多國內(nèi)外的學(xué)者研究從海洋生物中提取活性成分來治療糖尿病,如蔣鑫等[9]研究海參多糖降血脂功能,王霞等[10]研究金槍魚胰臟酶解液對糖尿病大鼠血糖和血脂的作用。有關(guān)仿刺參多肽作為預(yù)防Ⅱ型糖尿病的研究,國內(nèi)外未見報道。本文以糖尿病小鼠為對象,研究仿刺參多肽對小鼠腎臟的保護機制。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    仿刺參取自寧波奉化博望水產(chǎn)養(yǎng)殖公司。瘦素基因敲除雄性db/db 小鼠【(36±2.0)g】30 只,雄性Db/m【(25±1.0)g】10 只,購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司。合格證號:SCXK (滬)2007-0005(編號2007000528007),仿刺參多肽為實驗室自制??偰懝檀迹═C)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、胰島素濃度試劑盒,寧波美康生物科技有限公司;兩性電解質(zhì)、四甲基乙二胺(TEMED)、IPG 干膠條(pH 4-7)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、超純脲,美國Bio-Rad 公司;CHAPS、30%丙烯酰胺、二硫蘇糖醇(DTT)、碘乙酰胺、過硫酸銨(AP)、礦物油、非干擾型蛋白濃度試劑盒,索萊寶生物科技有限公司;2-D Clean-Up Kit,美國GE 公司。其它試劑為國產(chǎn)分析純級。

    1.2 方法

    1.2.1 動物分組與飼養(yǎng) 10 只雄性Db/m 小鼠為空白對照組(C);雄性db/db 小鼠30 只,按體重隨機分成模型組(M),陽性藥組(甲基巴多索隆CDDO-Me,9.75 mg·kg-1·d-1,ig),仿刺參多肽試驗組(S,50 mg·kg-1·d-1,ig),每組10 只??瞻讓φ战M與模型組灌以等量去離子水。在試驗期間,所有動物自由進食、進水,室溫保持23~25 ℃,光照晝夜間隔12 h,給藥時間為10 周。每天觀察和記錄動物的行為活動,體重變化情況每隔3 d 測定1 次。

    1.2.2 生理生化指標(biāo)檢測 試驗期10 周后停食,將小鼠麻醉后進行腹主動脈取血,分離血清,采用微板法測定血清中TC,TG,HDL-C,LDL-C 含量。試驗數(shù)據(jù)用SPSS 13.0 軟件進行單因素方差分析。

    1.2.3 差異表達(dá)蛋白的篩選及其功能分析

    1.2.3.1 蛋白質(zhì)的提取及純化 取1.0g 小鼠腎臟組織剪碎后放在預(yù)冷的研缽中加入液氮研磨成粉末,加入LB 裂解液(Alklysis buffer),使用前加入蛋白酶抑制劑(PMSF)充分溶解粉末后轉(zhuǎn)移到EP管中,600 W 超聲10~15 min,12 000 r/min,4 ℃離心20 min。在上清液中加入丙酮,-20 ℃沉淀過夜,12 000 r/min,4 ℃離心20 min,棄上清液,沉淀采用非干擾型蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒進行蛋白定量。

    1.2.3.2 雙向電泳 選擇蛋白總量在200~250 μg之間,加水化上樣緩沖液(7 mol/L 尿素,3 mol/L硫脲,4% w/v CHAPS,64 mmol/L DTT,0.5% v/v Bio-lyte)定容至150 μL。先將膠條從-20 ℃冰箱取出并在室溫下放置1 h,將處理好的樣品加入泡脹槽中,膠條輕輕覆與其上并滴加礦物油覆蓋。20 ℃水化和等電聚焦12 h,平衡15 min,進行SDS-PAGE 垂直電泳??捡R斯亮藍(lán)R-250 染色、脫色、掃描,圖像用PDQuest 軟件進行分析以及數(shù)據(jù)處理。選擇差異倍數(shù)大于1.5 倍且P<0.05 的斑點為差異蛋白,胰蛋白酶酶切后利用Autoflex speedTMMALDI-TOF-TOF(Bruker Dalton)質(zhì)譜儀進行分析。利用BioTools(Bruker Dalton)軟件搜索NCBI 數(shù)據(jù)庫,尋找匹配的相關(guān)蛋白質(zhì)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 對糖尿病小鼠血脂的影響

    同空白對照組比較,模型組血清TC、TG 含量顯著升高 (P<0.01),LDL-C 含量升高 (P<0.05),HDL-C 含量降低(P<0.05),胰島素濃度顯著升高(P<0.01),說明本試驗造模成功。相比于糖尿病模型組,陽性藥組能夠降低血清TC(P<0.01)、TG(P<0.01)、LDL-C 水平 (P<0.05),提高HDL-C 水平(P<0.05),胰島素濃度顯著降低(P<0.01)。試驗組能降低血清TG(P<0.05)、LDL-C(P<0.05)水平,提高HDL-C 水平(P<0.05),胰島素濃度降低(P<0.05),對TC 有降低的趨勢,但無顯著性差異。相比于糖尿病模型組,陽性藥組和試驗組均能顯著降低LDL-C/HDL-C 比值(P<0.01)。

    2.2 差異蛋白表達(dá)的篩選及功能分析

    利用雙向電泳技術(shù),分別對模型組、陽性藥組和試驗組的db/db 糖尿病小鼠的蛋白質(zhì)表達(dá)進行了比較,其蛋白圖譜如圖1所示。

    經(jīng)雙向電泳分析,共有472 個蛋白斑點可以匹配,其中對照組有150 個蛋白斑點,模型組有182 個蛋白斑點,試驗組中也檢測出140 個蛋白斑點。這些蛋白等電點主要集中在4~7,分子質(zhì)量在10~130 ku 之間。將差異倍數(shù)大于1.5 倍以上(P<0.05)的蛋白點作為顯著差異蛋白(見表2)。

    表2 仿刺參多肽調(diào)控II 型糖尿病鼠腎的差異蛋白質(zhì)分析Table 2 The different expression proteins on kidney of type II diabetic mice by Apostichopus joponicus polypeptide

    2.3 差異蛋白的功能分析

    GO 分析發(fā)現(xiàn),試驗組中差異表達(dá)基因富集顯著的生物過程主要與蛋白轉(zhuǎn)運、 激酶活性以及電子傳遞有關(guān),蛋白轉(zhuǎn)運過程與糖尿病之間存在某些作用,這些過程往往可以控制生物過程中關(guān)鍵蛋白的作用,從而影響整個生物過程。差異基因富集的分子功能過程主要與能量代謝以及激酶活性有關(guān)。糖尿病與許多基因之間存在廣泛的作用,這些基因中包含一些關(guān)鍵代謝酶的編碼序列,可以控制新陳代謝途徑中關(guān)鍵酶的表達(dá),從而影響整個新陳代謝[11]。差異基因富集的細(xì)胞組分中與非膜結(jié)合細(xì)胞器、大分子復(fù)合物、包外區(qū)組分相關(guān)。

    2.4 差異蛋白的代謝通路分析

    差異蛋白的KEGG 分析發(fā)現(xiàn):這些蛋白共涉及12 條代謝通路,主要包括代謝途徑、藥物代謝及胰島素抵抗等。糖尿病是一種全身代謝紊亂性疾病,一方面影響糖類代謝,導(dǎo)致高血糖,一方面影響脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的代謝。胰島素抵抗是導(dǎo)致糖尿病的重要因素,胰島素信號通路也和糖尿病息息相關(guān)。

    3 討論

    3.1 調(diào)節(jié)糖代謝

    自20 世紀(jì)70年代以來,人們從海洋生物中分離出多種新型化合物,包括蛋白質(zhì)類、肽類、多糖類、生物堿類等等。生物活性肽治療效果好、副作用小,比蛋白質(zhì)穩(wěn)定,因此受到越來越多的關(guān)注[12]。生物活性肽不僅能為機體提供營養(yǎng)物質(zhì),還具有多種功能,如抗氧化、抗輻射、抗衰老、降血糖、抗菌消炎、參與機體的免疫調(diào)節(jié)等[13],還可以降低體內(nèi)血壓和血糖水平[14]。徐軍等[15]研究苦瓜多肽降血糖的功能。王茵等[16]研究從魚皮中提取膠原蛋白降壓肽。顧偉等[17]從大海馬蛋白中提取降壓肽。多肽調(diào)節(jié)血糖和血壓的作用主要表現(xiàn)在以下幾個方面,通過抗氧化、受體調(diào)節(jié)酶活性和糖代謝激素水平以及提高機體免疫力等增加糖的利用,抑制糖異生,以此來改善糖代謝和胰島素紊亂的癥狀。本文的研究結(jié)果顯示:仿刺參多肽能夠調(diào)節(jié)糖尿病小鼠胰島素信號通路中關(guān)鍵蛋白-視黃醇結(jié)合蛋白4 的表達(dá),它一方面影響肝臟中肝糖的合成和輸出,調(diào)節(jié)機體的糖代謝,一方面調(diào)節(jié)胰島素信號通路中激酶活性和受體底物磷酸化,從而達(dá)到改善糖代謝和胰島素紊亂的癥狀。

    圖2 試驗組(S)與模型組(M)差異蛋白GO 分析Fig.2 The GO cluster analysis of different expression proteins in S:M group

    圖3 差異蛋白的KEGG 代謝通路分析Fig.3 The KEGG pathway analysis of the different expression proteins

    圖4 試驗組差異蛋白參與的通路Fig.4 Differential protein pathway in experimental group

    3.2 調(diào)節(jié)脂代謝

    研究表明,糖尿病與血脂代謝紊亂密切相關(guān),一般會導(dǎo)致血清TG、TC、LDL-C 升高同時HDL-C降低[18],由此可引發(fā)高血壓、動脈粥樣化和冠心病等多種并發(fā)癥[19]。本論文中的糖尿病模型組小鼠的脂代謝紊亂現(xiàn)象,其TC、TG、LDL-C 含量均明顯高于正常對照組,HDL-C 水平顯著降低。而試驗組TG、LDL-C 水平均顯著降低,HDL-C 水平顯著升高,說明仿刺參多肽對糖尿病小鼠有調(diào)節(jié)血脂紊亂的作用。

    3.3 調(diào)節(jié)胰島素信號通路

    胰島素是調(diào)節(jié)能量代謝、 糖代謝和脂代謝的重要激素,當(dāng)體內(nèi)葡萄糖多余時,胰島素通過抑制肝臟葡萄糖生成,并且促進葡萄糖分解成非糖物質(zhì),這種特異性反應(yīng)使得血糖水平降低、體內(nèi)葡萄糖水平保持在一個狹窄的范圍內(nèi)。這種穩(wěn)態(tài)的機制遭到破壞后就可能導(dǎo)致胰島素抵抗(IR)[20]。為了調(diào)節(jié)血糖的正常水平,機體分泌過多胰島素,從而導(dǎo)致機體一系列病理變化[21]。自2005年視黃醇結(jié)合蛋白4(RBP4)被哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院發(fā)現(xiàn)以來,許多人就開始研究RBP4 在機體內(nèi)的作用機制,它是一種單一肽鏈的蛋白質(zhì),屬于Lipocalin 超家族成員,相對分子質(zhì)量約為21 ku,包括181 個氨基酸殘基。人類RBP4 基因為單拷貝,大小約10 kb,位于與糖尿病發(fā)生有著密切聯(lián)系的染色體10 q23.3 上[22]。梁琳瑯等[23]發(fā)現(xiàn)代謝綜合征患者血清RBP4 的含量較高;Choi S[24]等研究發(fā)現(xiàn)妊娠期糖尿?。╬GDM)婦女產(chǎn)后糖耐量減低的嚴(yán)重程度與高RBP4 水平和低脂聯(lián)素水平有關(guān)。Frey S K 等[25]證實慢性腎臟疾病者血清RBP4 明顯高于正常對照者。近年來研究發(fā)現(xiàn)RBP4 是一種新型的、特殊的循環(huán)性脂肪因子,對于胰島素的合成與聚集具有重要作用[26]。它能夠抑制肌肉組織中胰島信號通路,并且能夠促進糖異生的進行,肝糖原輸出增加,導(dǎo)致胰島素抵抗,進而導(dǎo)致糖尿病的發(fā)生[27]。本文研究結(jié)果顯示,喂養(yǎng)仿刺參多肽的糖尿病體內(nèi)葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白表達(dá)增加,視黃醇結(jié)合蛋白4的表達(dá)下調(diào),磷脂酰肌醇3 激酶的活性和胰島素受體底物的酪氨酸磷酸化恢復(fù)正常,血糖水平也恢復(fù)正常,胰島素通路正常,改善糖尿病的癥狀。

    4 結(jié)論

    仿刺參多肽可以降低糖尿病小鼠血清TC、TG、LDL-C 水平和胰島素濃度,提高HDL-C 水平,改善糖尿病小鼠血脂紊亂的現(xiàn)象。同時仿刺參多肽可以使糖尿病小鼠體內(nèi)視黃醇結(jié)合蛋白4 表達(dá)下調(diào),使胰島素信號通路恢復(fù)正常,從而達(dá)到改善糖尿病的癥狀。

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