氨濃度升高對CHO細(xì)胞維持期抗體融合蛋白的表達(dá)及N-糖基化的影響

陳欣寧 趙亮 范里 劉旭平 譚文松

（華東理工大學(xué) 生物反應(yīng)器工程國家重點(diǎn)實驗室，上海 200237）

抗體類藥物是近年來研發(fā)數(shù)量最多、銷售增長速度最快的治療性重組蛋白藥物，它具有靶向明確、安全性高和循環(huán)半衰期長等優(yōu)點(diǎn)，已被批準(zhǔn)用于癌癥、免疫性疾病、病毒感染等多種疾病的治療［1］?？贵w類藥物生產(chǎn)用最主要的宿主細(xì)胞是CHO細(xì)胞，這是因為由CHO細(xì)胞表達(dá)的重組蛋白具有與人體血清蛋白高度相似的糖鏈結(jié)構(gòu)［2］。而抗體類藥物的糖鏈結(jié)構(gòu)（如唾液酸化、半乳糖化、巖藻糖化和高甘露糖比例等）與蛋白分子的電荷分布、穩(wěn)定性和溶解性等理化性質(zhì)以及藥物的藥代動力學(xué)和生物學(xué)活性等體內(nèi)藥效密切相關(guān)［3-4］，因此糖基化是抗體類藥物的關(guān)鍵質(zhì)量屬性之一。隨著動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)的不斷進(jìn)步，細(xì)胞生長和產(chǎn)物表達(dá)水平明顯提高。目前在優(yōu)化的CHO細(xì)胞流加培養(yǎng)過程中，最高活細(xì)胞密度和產(chǎn)物表達(dá)量分別能達(dá)到1-2×107cells/ml和g/L級［5］。然而在產(chǎn)物大量合成的高密度細(xì)胞培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)環(huán)境更為復(fù)雜，較易發(fā)生過程參數(shù)滲透壓和二氧化碳分壓累積以及代謝副產(chǎn)物氨的濃度升高的情況，會對細(xì)胞生長與維持和產(chǎn)物表達(dá)與糖基化過程產(chǎn)生不利影響［6-8］。

氨是動物細(xì)胞培養(yǎng)過程中的主要代謝副產(chǎn)物之一，它主要是由細(xì)胞代謝谷氨酰胺和天冬酰胺生成，少部分是谷氨酰胺自發(fā)降解產(chǎn)生［9］。在高密度細(xì)胞流加培養(yǎng)過程中氨的濃度往往不斷升高，細(xì)胞維持期（產(chǎn)物表達(dá)期）的氨濃度通常達(dá)到6-10 mmol/L［5，10］， 有 些 培 養(yǎng) 過 程 中 甚 至 超 過10 mmol/L［11］。高濃度的氨通過擴(kuò)散作用進(jìn)入胞漿以及線粒體、高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器，導(dǎo)致胞漿和這些細(xì)胞器內(nèi)的pH升高，進(jìn)而影響了正常的胞內(nèi)生化反應(yīng)，如物質(zhì)和能量代謝、糖鏈加工、蛋白質(zhì)翻譯等［9，12］。研究表明，在初始培養(yǎng)時提高氨的濃度會影響產(chǎn)物表達(dá)和糖基化過程［13-15］，由于在初始培養(yǎng)時提高氨的濃度會同時影響細(xì)胞生長和代謝水平，而產(chǎn)物表達(dá)和糖基化過程與培養(yǎng)前期的細(xì)胞生長和代謝水平密切相關(guān)［16-17］，導(dǎo)致在這些研究中氨本身對產(chǎn)物表達(dá)和糖基化過程的影響更為復(fù)雜?？紤]到在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，細(xì)胞生長期的氨濃度和產(chǎn)物表達(dá)量較低，而在產(chǎn)物大量合成的細(xì)胞維持期氨濃度較高。因此，細(xì)胞維持期氨對產(chǎn)物的表達(dá)和糖鏈結(jié)構(gòu)的影響更應(yīng)該被關(guān)注。

為此，本研究考察了在表達(dá)抗體融合蛋白的CHO細(xì)胞流加培養(yǎng)過程中，不同的氨濃度在細(xì)胞維持期對細(xì)胞維持與代謝、抗體融合蛋白表達(dá)以及N-糖基化的作用，認(rèn)識氨濃度升高對抗體融合蛋白的表達(dá)和N-糖鏈結(jié)構(gòu)的影響，從而對表達(dá)抗體類藥物以及其它治療性重組蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)過程開發(fā)與控制奠定部分基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用的細(xì)胞為表達(dá)抗體融合蛋白的重組CHO細(xì)胞株。種子細(xì)胞傳代培養(yǎng)基和基礎(chǔ)培養(yǎng)基相同，為本實驗室自主開發(fā)的無血清無蛋白培養(yǎng)基［18］。流加培養(yǎng)基為葡萄糖和氨基酸的濃縮液。用于配制培養(yǎng)基的所有試劑和原料均從Sigma-Aldrich公司購買。配制完的培養(yǎng)基經(jīng)0.22 μm濾膜（Millipore）過濾除菌后使用。

1.2 方法

1.2.1 種子細(xì)胞培養(yǎng) 從液氮罐中取出凍存的CHO種子細(xì)胞，加入至含有10 mL種子傳代培養(yǎng)基的離心管中，經(jīng)1 000 r/min離心5 min后棄去培養(yǎng)上清。用適量種子傳代培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，控制活細(xì)胞密度為5.0-8.0×105cells/mL。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至125 mL搖瓶中（美國Corning公司），置于培養(yǎng)箱中的搖床上（杭州奧盛儀器有限公司）進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃、5% CO2和120 r/min。每天對種子細(xì)胞進(jìn)行傳代，控制傳代后種子細(xì)胞的活細(xì)胞密度為5.0-8.0×105cells/mL。

1.2.2 流加培養(yǎng) 取處于對數(shù)生長期的種子細(xì)胞，經(jīng)1 000 r/min離心5 min后棄去培養(yǎng)上清，用基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，控制活細(xì)胞密度為1.0×106cells/mL，接種體積為80 mL。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至250 mL搖瓶中（美國Corning公司），置于培養(yǎng)箱中的搖床上進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃、5% CO2和120 r/min。每天添加3%（V/V）的流加培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞生長至最大活細(xì)胞密度時（培養(yǎng)第5天），一次性添加不同濃度的氯化銨濃縮液，分別使培養(yǎng)液中的氨濃度升高0（不添加）、2、4和6 mmol/L后繼續(xù)培養(yǎng)。每組實驗設(shè)置3個重復(fù)。每天取樣1 mL進(jìn)行細(xì)胞密度和活率檢測，培養(yǎng)液經(jīng)10 000 r/min離心5 min后取上清液于-80℃保存，用于主要代謝物和副產(chǎn)物濃度、抗體融合蛋白表達(dá)量和純化后的糖基化檢測。

1.2.3 細(xì)胞密度和活率檢測 細(xì)胞培養(yǎng)液用磷酸緩沖液和0.4%（W/V）臺盼藍(lán)染色液稀釋后，加到血球計數(shù)板中計錄活細(xì)胞數(shù)和死細(xì)胞數(shù)，活細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比即為活率。同時采用Countstar細(xì)胞計數(shù)儀（上海睿鈺生物科技有限公司）記錄細(xì)胞形態(tài)。

1.2.4 細(xì)胞凋亡檢測 使用Dead Cell Apoptosis Kit（美國Thermo Fisher公司）對凋亡細(xì)胞比例進(jìn)行檢測。首先取細(xì)胞1.0×106cells/mL，離心除去培養(yǎng)液并用PBS緩沖液清洗細(xì)胞兩次。將細(xì)胞沉淀重懸于100 μL 1×Annexin binding buffer中，檢測樣本添加1 μL PI溶液和 5 μl Annexin V-FITC 溶液，同時設(shè)置不添加PI和Annexin V-FITC溶液的檢測對照組，室溫避光放置15 min后加入400 μL 1×Annexin binding buffer并充分混勻。采用流式細(xì)胞儀（美國BD公司）檢測結(jié)果，用Flowjo軟件（美國BD公司）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.5 主要代謝物和副產(chǎn)物濃度檢測 培養(yǎng)上清中的主要代謝物葡萄糖和谷氨酰胺、代謝副產(chǎn)物乳酸和氨的濃度采用生化分析儀Nova BioProfile 400（Nova Biomedical）測定。

1.2.6 抗體融合蛋白表達(dá)量檢測 培養(yǎng)上清中抗體融合蛋白的表達(dá)量采用尺寸排阻色譜的方法進(jìn)行檢測，色譜柱為G3000SWXL，7.8×300 mm（TOSOH）。具體步驟見參考文獻(xiàn)［19］。

1.2.7 抗體融合蛋白純化 抗體融合蛋白的純化采用Protein A親和層析的方法，純化柱為Mab Select SuRe（GE Healthcare）。具體步驟見參考文獻(xiàn)［19］。

1.2.8 抗體融合蛋白唾液酸含量檢測 按照2015年版《中國藥典》（三部）中間苯二酚顯色法檢測抗體融合蛋白的唾液酸含量。

1.2.9 抗體融合蛋白N-糖鏈結(jié)構(gòu)檢測 抗體融合蛋白的N-糖鏈結(jié)構(gòu)采用2-對氨基苯甲酰胺標(biāo)記法進(jìn)行檢測［20］。首先用糖苷酶PNGase F（New England BioLabs）將N端糖鏈從抗體融合蛋白上切除，隨后加入-20℃的乙醇，12 000 r/min離心10 min后吸取上清，置于真空離心濃縮儀（Thermo）中揮發(fā)溶液。然后使用2-對氨基苯甲酰胺熒光標(biāo)記物（Prozyme）按照試劑盒說明書要求與糖鏈反應(yīng)，最后通過TSKGEL Amide-80，4.6×250 mm（TOSOH）色譜柱檢測樣品的N-糖鏈結(jié)構(gòu)，流動相A為50 mmol/L 甲酸銨（pH4.4），流動相B為乙腈，梯度條件為在140 min內(nèi)由30%-55%流動相A 的線性梯度洗脫，流速為0.4 mL/min。檢測器為熒光檢測器（Waters），激發(fā)波長為330 nm，發(fā)射波長為420 nm。

圖1 抗體融合蛋白的N-糖鏈結(jié)構(gòu)譜圖

1.2.10 數(shù)據(jù)分析 抗體融合蛋白的比生成速率qp（pg/cell/day）的計算公式如下：

其中Titer為抗體抗體融合蛋白的表達(dá)量（mg/L）；IVCC（Integrated viable cell concentraion）為活細(xì)胞密度對培養(yǎng)時間的積分（109cells·day/L）。

培養(yǎng)上清中主要代謝物和副產(chǎn)物的比生成/消耗速率qm（pmol/cell/day）的計算公式如下：

其中Concentration為代謝物或副產(chǎn)物的濃度（mmol/L）。

抗體融合蛋白的唾液酸化（Sialylation）、半乳糖化（Galactosylation）、巖藻糖化（Fuosylation）程度的計算公式如下：

Sialylation=［0.5×（A1+A1F）+A2+A2F］×100%

Galactosylation=［0.5×（G1+G1F）+G2+G2F+A1+A1F+A2+A2F］×100%

Fucosylation=（G0F+G1F+G2F+A1F+A2F）×100%

其中抗體融合蛋白的G0、G2、A2F等糖鏈的具體結(jié)構(gòu)參考圖1。

2 結(jié)果

2.1 氨濃度升高對CHO細(xì)胞維持以及抗體融合蛋白表達(dá)的影響

為了排除維持期細(xì)胞密度對抗體融合蛋白的表達(dá)以及N-糖鏈結(jié)構(gòu)的影響，在細(xì)胞生長至最高活細(xì)胞密度時（培養(yǎng)第5天），往培養(yǎng)液中一次性加入不同濃度的氯化銨濃縮液使氨濃度分別上升0（對照組）、2、4和6 mmol/L，以營造只有氨濃度不同的細(xì)胞維持期培養(yǎng)環(huán)境。同時，為了避免因細(xì)胞后期死亡而釋放至培養(yǎng)液的宿主蛋白酶和糖苷酶對抗體融合蛋白及其糖鏈的降解，在培養(yǎng)第11天時（細(xì)胞活率＞90%）結(jié)束培養(yǎng)。

圖2 不同氨濃度條件下的CHO細(xì)胞維持（A）、細(xì)胞活率（B）、抗體融合蛋白表達(dá)（C）及氨濃度（D）情況

圖2是不同氨濃度條件下的CHO細(xì)胞生長、細(xì)胞活率、抗體融合蛋白表達(dá)以及維持期氨濃度的情況。首先由圖2-A可知，培養(yǎng)前期細(xì)胞快速生長，至培養(yǎng)第5天時達(dá)到最高活細(xì)胞密度為（7.88±0.32）×106cells/mL。此后細(xì)胞進(jìn)入維持期，培養(yǎng)第5-9天活細(xì)胞密度不變。培養(yǎng)第9天以后活細(xì)胞密度開始緩慢下降，至培養(yǎng)結(jié)束時，對照組的活細(xì)胞密度為（7.02±0.11）×106cells/mL。由圖2-B可知，在細(xì)胞生長期以及維持期的前3天（培養(yǎng)第0-8天），細(xì)胞活率較高（＞98%）。培養(yǎng)第8天以后細(xì)胞活率開始緩慢下降，至培養(yǎng)結(jié)束時，對照組的細(xì)胞活率為90.96±0.95%。盡管通過氯化銨的添加使細(xì)胞維持期的氨濃度分別升高了2、4和6 mmol/L，氨濃度最高達(dá)到 12.08±0.28 mmol/L（圖2-D），但培養(yǎng)結(jié)束時的活細(xì)胞密度和細(xì)胞活率與對照組相比均沒有顯著差別。由此可見，細(xì)胞維持期氨濃度升高（＜12 mmol/L）對細(xì)胞維持和最終活率沒有影響，至培養(yǎng)結(jié)束時4個條件下的細(xì)胞活率均大于90%。

圖3是不同氨濃度條件下培養(yǎng)結(jié)束時的細(xì)胞形態(tài)，由圖可知，4組條件下細(xì)胞形態(tài)較為接近。表1總結(jié)了培養(yǎng)結(jié)束時的平均細(xì)胞直徑，由表可知，4組條件下均沒有顯著差異，可見維持期氨濃度在5-12 mmol/L范圍內(nèi)對細(xì)胞大小沒有影響。此外，本研究進(jìn)一步分析了培養(yǎng)結(jié)束時的凋亡細(xì)胞比例，圖4為不同氨濃度條件下培養(yǎng)結(jié)束時凋亡細(xì)胞比例的流式檢測圖，圖譜的右上方和右下方分別為晚期凋亡和早期凋亡的細(xì)胞及其占總細(xì)胞的比例，由圖可知，4組條件下培養(yǎng)結(jié)束時的晚期凋亡細(xì)胞和早期凋亡細(xì)胞分布較為接近，總凋亡比例較低（＜3%）。經(jīng)計算，4組條件下的凋亡細(xì)胞比例沒有顯著差異（表1），可見維持期氨濃度在5-12 mmol/L范圍內(nèi)對細(xì)胞凋亡也沒有影響。

圖3 不同氨濃度條件下培養(yǎng)結(jié)束時的細(xì)胞形態(tài)（白圈標(biāo)記為死細(xì)胞）

表1 不同氨濃度條件下培養(yǎng)結(jié)束時的平均細(xì)胞直徑和凋亡比例

抗體融合蛋白表達(dá)方面，由圖2C可知在細(xì)胞生長期，抗體融合蛋白的表達(dá)量只有130.50±23.35 mg/L。進(jìn)入細(xì)胞維持期后，抗體融合蛋白開始大量表達(dá)，至培養(yǎng)結(jié)束時對照組抗體融合蛋白的表達(dá)量達(dá)到1 152.31±22.23 mg/L。其中細(xì)胞維持期抗體融合蛋白的表達(dá)量為1 021.81±22.67 mg/L，占培養(yǎng)過程中總表達(dá)量的比例高達(dá)88.67%，因此這一培養(yǎng)階段也稱為產(chǎn)物表達(dá)期。培養(yǎng)結(jié)束時氨濃度升高2 mmol/L條件下的抗體融合蛋白表達(dá)量不變，而升高4和6 mmol/L條件下的抗體融合蛋白表達(dá)量分別只有對照組的 90.22%（P＜0.05）和 82.65%（P＜0.05）?？梢婋S著氨濃度的升高（＞9 mmol/L），抗體融合蛋白的表達(dá)量逐漸降低。由于培養(yǎng)過程的最終產(chǎn)物表達(dá)量是IVCC和產(chǎn)物比生成速率的乘積，而4個條件下的IVCC沒有差異（表2），因此抗體融合蛋白表達(dá)量的降低是比生成速率的減少導(dǎo)致的。經(jīng)計算，在氨濃度升高4和6 mmol/L條件下，抗體融合蛋白的比生成速率比對照組顯著減少了9.88%和17.72%（P＜0.05）。

圖4 不同氨濃度條件下培養(yǎng)結(jié)束時凋亡細(xì)胞比例的流式檢測圖

表2 不同氨濃度條件下的IVCC和抗體融合蛋白的比生成速率

以上結(jié)果表明，細(xì)胞維持期氨濃度在5-12 mmol/L范圍內(nèi)對CHO細(xì)胞的維持、培養(yǎng)結(jié)束時的細(xì)胞活率、形態(tài)以及凋亡比例沒有影響，但當(dāng)氨濃度超過9 mmol/L時，抗體融合蛋白的表達(dá)能力開始下降。

2.2 氨濃度升高對CHO細(xì)胞代謝的影響

圖5是不同氨濃度條件下細(xì)胞維持期主要營養(yǎng)物葡萄糖和谷氨酰胺的消耗以及主要代謝副產(chǎn)物乳酸和氨的累積情況。由圖5-A可知，細(xì)胞維持期對照組的葡萄糖和谷氨酰胺比消耗速率分別為0.66±0.03 pmol/cell/day 和 0.10±0.01 pmol/cell/day，其它3組氨濃度升高條件下的葡萄糖和谷氨酰胺比消耗速率與對照組相比沒有顯著差異。

乳酸是葡萄糖代謝的主要副產(chǎn)物。由圖5-B可知，在細(xì)胞生長期（培養(yǎng)0-5 d），乳酸濃度累積至24.21±0.60 mmol/L。細(xì)胞維持期細(xì)胞繼續(xù)分泌乳酸，至培養(yǎng)結(jié)束時對照組的乳酸濃度達(dá)到29.34±0.41 mmol/L，共生成了5.13±0.86 mmol/L（圖5-C），這一階段的乳酸比生成速率為0.11±0.02 pmol/cell/day（圖5-D）。氨是細(xì)胞消耗谷氨酰胺所產(chǎn)生的主要代謝副產(chǎn)物，由圖2-D可知，細(xì)胞維持期氨持續(xù)生成，對照組的氨生成量為1.70±0.18 mmol/L（圖5-C），這一階段的氨比生成速率為0.036±0.004 pmol/cell/day（圖5-D）。與對照組相比，其它3組氨濃度升高條件下無論是乳酸和氨的總生成量，還是兩者的比生成速率均沒有顯著變化。

以上結(jié)果表明，細(xì)胞維持期氨濃度升高（＜12 mmol/L）對CHO細(xì)胞的葡萄糖和谷氨酰胺的消耗以及乳酸和氨的生成均沒有產(chǎn)生影響。

2.3 氨濃度升高對抗體融合蛋白的N-糖鏈結(jié)構(gòu)以及唾液酸含量的影響

糖基化是抗體類藥物的關(guān)鍵質(zhì)量屬性之一，糖基化的有效控制與最終藥物的臨床安全性和有效性密切相關(guān)。圖6為不同氨濃度下培養(yǎng)結(jié)束時抗體融合蛋白的4種主要N-糖鏈結(jié)構(gòu)（唾液酸化、半乳糖化、巖藻糖化和高甘露糖）的比例。唾液酸（Sialic acid）位于N-糖鏈的末端，唾液酸化比例是指N-糖鏈中所有含唾液酸的糖鏈所占的比例（圖1）。由圖6-A可知，氨濃度升高導(dǎo)致培養(yǎng)結(jié)束時抗體融合蛋白的唾液酸化比例顯著降低。其中，氨濃度僅升高2 mmol/L就能導(dǎo)致唾液酸化比例從15.49±1.21%顯著降低到12.30±0.65%（P＜0.05），且隨著氨濃度的升高，抗體融合蛋白的唾液酸化比例會繼續(xù)降低。

半乳糖化比例是指N-糖鏈中所有含半乳糖（Galactose）的糖鏈所占的比例（圖1）。由于半乳糖的連接是唾液酸加工至N-糖鏈上的前提，半乳糖化程度會直接影響最終N-糖鏈的唾液酸化程度。由圖6-B可知，對照組培養(yǎng)結(jié)束時抗體融合蛋白的半乳糖化比例為51.41±0.67%，在氨濃度升高2、4和6 mmol/L條件下，抗體融合蛋白的半乳糖化比例分別只有46.50±1.15%、42.59±0.85%和41.04±0.41%。可見隨著氨濃度的升高，抗體融合蛋白的半乳糖化比例也在不斷降低。

巖藻糖化比例是指N-糖鏈中所有含巖藻糖（Fucose）的糖鏈所占的比例（圖1）。高甘露糖是N-糖基化過程早期形成的末端含有多個甘露糖（Mannose）的不完整糖型，在圖1所示的抗體融合蛋白的N-糖鏈結(jié)構(gòu)中，高甘露糖比例特指Man5糖型的比例。由圖6-C可知，培養(yǎng)結(jié)束時抗體融合蛋白的大部分N-糖鏈（＞70%）含有巖藻糖，氨濃度升高對巖藻糖化比例沒有明顯影響。而圖6-D顯示，培養(yǎng)結(jié)束時抗體融合蛋白的Man5比例較低（＜3%），氨濃度升高條件下Man5比例沒有發(fā)生改變。

圖5 不同氨濃度條件下細(xì)胞維持期的葡萄糖和谷氨酰胺的比消耗速率（A）、乳酸濃度（B）、乳酸和氨的生成（C）以及乳酸和氨的比生成速率（D）情況

抗體融合蛋白的唾液酸含量是指導(dǎo)最終產(chǎn)品放行的關(guān)鍵質(zhì)量指標(biāo)之一。圖7為不同氨濃度下培養(yǎng)結(jié)束時抗體融合蛋白的唾液酸含量。可以看出，隨著氨濃度的升高，培養(yǎng)結(jié)束時抗體融合蛋白的唾液酸含量不斷降低。在氨濃度升高2、4和6 mmol/L條件下，抗體融合蛋白的唾液酸含量分別只有對照組的92.06%，86.64%和83.97%。氨濃度的升高量與最終抗體融合蛋白的唾液酸含量具有較好的負(fù)相關(guān)性（R2=0.953 6）。

3 討論

運(yùn)用動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)抗體類藥物已成為當(dāng)今生物制藥行業(yè)的主流趨勢。隨著細(xì)胞株構(gòu)建、培養(yǎng)基開發(fā)以及過程優(yōu)化技術(shù)的不斷進(jìn)步，細(xì)胞生長和產(chǎn)物表達(dá)水平明顯提高，同時培養(yǎng)環(huán)境也更為復(fù)雜。其中代謝副產(chǎn)物氨的累積會對細(xì)胞產(chǎn)生毒副作用，導(dǎo)致細(xì)胞生長與代謝、產(chǎn)物表達(dá)和糖基化過程受到影響［13-15］。由于細(xì)胞密度和代謝水平的不同也會影響產(chǎn)物表達(dá)和糖基化過程［16-17］，因此本研究系統(tǒng)考察了在培養(yǎng)前期細(xì)胞密度和代謝水平相同的條件下，氨濃度升高對細(xì)胞維持期CHO細(xì)胞維持、細(xì)胞代謝、抗體融合蛋白的表達(dá)以及N-糖鏈結(jié)構(gòu)的影響。

細(xì)胞的諸多生理代謝反應(yīng)如糖酵解和磷酸戊糖途徑在胞漿進(jìn)行，氨能通過擴(kuò)散作用進(jìn)入細(xì)胞，使胞漿pH異常升高，導(dǎo)致細(xì)胞的代謝反應(yīng)受到影響，進(jìn)而影響細(xì)胞的生理狀態(tài)［9，14］。研究表明，在初始細(xì)胞培養(yǎng)時提高氨濃度至超過5 mmol/L后，細(xì)胞的比生長速率和最高活細(xì)胞密度減少［13，21］。由于在實際培養(yǎng)過程中氨是持續(xù)生成的，培養(yǎng)前期的氨濃度往往較低，而在產(chǎn)物大量合成的細(xì)胞維持期氨濃度才會較高。因此，細(xì)胞維持期氨對過程結(jié)果的影響更應(yīng)該被關(guān)注。本研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞維持期氨濃度在5-12 mmol/L范圍內(nèi)對CHO細(xì)胞的維持、培養(yǎng)結(jié)束時的細(xì)胞活率、形態(tài)以及凋亡比例沒有影響?？梢姲睂Σ煌囵B(yǎng)階段細(xì)胞的影響是不同的。

圖6 不同氨濃度條件下培養(yǎng)結(jié)束時抗體融合蛋白的唾液酸化比例（A）、半乳糖化比例（B）、巖藻糖化比例（C）以及高甘露糖比例（D）

圖7 不同氨濃度條件下培養(yǎng)結(jié)束時抗體融合蛋白的唾液酸含量

產(chǎn)物的最終表達(dá)量是IVCC和產(chǎn)物比生成速率共同決定的［22］。在維持細(xì)胞密度相同的情況下，細(xì)胞的最終活率將直接影響IVCC。此外，細(xì)胞需要消耗大量葡萄糖和谷氨酰胺為產(chǎn)物合成提供能量［23］。因此在維持細(xì)胞密度相同的條件下，抗體融合蛋白的最終表達(dá)量與細(xì)胞的維持情況和代謝水平密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞維持期氨濃度維持在5-12 mmol/L時，雖然CHO細(xì)胞的維持情況、葡萄糖和谷氨酰胺的消耗以及副產(chǎn)物乳酸和氨的生成沒有受到影響，但當(dāng)氨濃度超過9 mmol/L時，抗體融合蛋白的比生成速率顯著減少，導(dǎo)致最終表達(dá)量顯著降低。此外，有文獻(xiàn)報道［13，15］，當(dāng)氨濃度超過10 mmol/L后，最終產(chǎn)物的表達(dá)量降低。由于這些研究是在初始細(xì)胞培養(yǎng)時提高氨的濃度，對培養(yǎng)前期的細(xì)胞生長也造成影響，導(dǎo)致IVCC下降。在本研究中，相同的IVCC更能體現(xiàn)氨對細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物能力的負(fù)作用。

抗體類藥物的唾液酸化程度、高甘露糖糖型比例、半乳糖化程度和巖藻糖化程度分別與藥物的循環(huán)半衰期、補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性（Complementdependent cytotoxicity，CDC）和抗體依賴的細(xì)胞毒性（Antibody dependent cell cytotoxicity，ADCC） 等臨床表現(xiàn)相關(guān)［24］。產(chǎn)物的糖基化過程控制是生物制藥界面臨的難題之一。研究表明，氨能通過擴(kuò)散作用進(jìn)入高爾基體，擾亂其正常的pH環(huán)境，使重要的功能酶（如糖基轉(zhuǎn)移酶）的作用受到影響，最終導(dǎo)致產(chǎn)物的糖鏈結(jié)構(gòu)發(fā)生變化［12，25］。本研究發(fā)現(xiàn)隨著細(xì)胞維持期氨濃度的升高，抗體融合蛋白的半乳糖化程度和唾液酸化程度均不斷降低，而巖藻糖化程度和高甘露糖糖型比例則沒有發(fā)生變化，明確了氨影響糖基化過程的作用位點(diǎn)。與蛋白表達(dá)過程相比，糖基化過程對氨更為敏感，氨濃度超過5 mmol/L就能導(dǎo)致抗體融合蛋白的糖基化過程受到影響。此外，Yang等［13］發(fā)現(xiàn)，當(dāng)氨濃度超過5 mmol/L后，最終產(chǎn)物的糖基化程度降低。Hoog等［21］同樣發(fā)現(xiàn)，當(dāng)氨濃度超過5 mmol/L后，最終產(chǎn)物的半乳糖化程度降低，但其它糖鏈結(jié)構(gòu)的比例則沒有變化。然而，這些研究仍是在初始培養(yǎng)時提高氨的濃度，導(dǎo)致培養(yǎng)前期的細(xì)胞生長、細(xì)胞對營養(yǎng)物的消耗以及代謝副產(chǎn)物的生成情況改變，而細(xì)胞密度以及代謝水平的差異也可能會影響糖基化加工。在本研究中，由于實驗排除了維持細(xì)胞密度和細(xì)胞代謝水平對糖基化過程的影響，結(jié)果更直觀地體現(xiàn)了氨對糖基化過程的作用。

產(chǎn)物的高效表達(dá)是細(xì)胞培養(yǎng)過程建立的首要目標(biāo)。而糖基化是抗體類藥物的關(guān)鍵質(zhì)量屬性之一，各國藥品監(jiān)管機(jī)構(gòu)均要求對抗體類藥物的糖鏈結(jié)構(gòu)進(jìn)行嚴(yán)密的控制［2］。氨作為高密度細(xì)胞流加培養(yǎng)過程中累積的主要代謝副產(chǎn)物之一，會直接影響產(chǎn)物表達(dá)和糖基化過程。因此，正確認(rèn)識氨對產(chǎn)物表達(dá)和糖基化過程的作用，同時結(jié)合藥物的作用機(jī)制和具體的糖基化控制要求設(shè)定合理的氨濃度控制區(qū)間，對運(yùn)用質(zhì)量源于設(shè)計（Quality by design，QbD）方法建立高效的細(xì)胞培養(yǎng)過程及其后續(xù)的過程放大策略具有重要的指導(dǎo)意義。

4 結(jié)論

本研究考察了細(xì)胞維持期氨濃度升高對CHO細(xì)胞維持、細(xì)胞代謝、抗體融合蛋白表達(dá)和N-糖基化的影響。結(jié)果表明，氨濃度升高（5-12 mmol/L）對CHO細(xì)胞的維持、葡萄糖和谷氨酰胺的消耗以及副產(chǎn)物乳酸和氨的生成情況沒有明顯影響，但不利于抗體融合蛋白的表達(dá)和N-糖基化過程。氨濃度大于5 mmol/L即可對抗體融合蛋白的半乳糖化程度和唾液酸化程度產(chǎn)生不利影響，但氨濃度升高對巖藻糖化程度和高甘露糖糖型比例沒有作用。而當(dāng)氨濃度升高至大于9 mmol/L后，抗體融合蛋白的比生成速率開始顯著減少，導(dǎo)致最終表達(dá)量顯著降低。