miRNA-198靶向調(diào)控表皮干細(xì)胞內(nèi)FGFR1表達(dá)誘導(dǎo)慢性創(chuàng)面形成的機(jī)制研究

馮歡 劉仕勇 周燕

[摘要]目的：研究miR-198對(duì)慢性創(chuàng)面形成的影響，探討miR-198靶向調(diào)控表皮干細(xì)胞內(nèi)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體1 （FGFR1）表達(dá)的可能機(jī)制與相關(guān)性。方法：所有大鼠以表皮干細(xì)胞培養(yǎng)劃分為三組，對(duì)照組20只，采用基礎(chǔ)飼料，40只復(fù)制糖尿病模型大鼠組，共32只建糖尿病大鼠慢性創(chuàng)面模型成功，其中16只為慢性創(chuàng)面組，另外16只通過(guò)快速尾靜脈注射miR-198抑制劑轉(zhuǎn)染系統(tǒng)溶液，命名為轉(zhuǎn)染抑制載體組，通過(guò)免疫組織化學(xué)檢測(cè)表皮干細(xì)胞表達(dá)，計(jì)算慢性創(chuàng)面的愈合率。通過(guò)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線測(cè)試和細(xì)胞周期分析miR-198對(duì)表皮干細(xì)胞的影響，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)各組表皮干細(xì)胞中FGFR1表達(dá)。用Western-blot法檢測(cè)各組細(xì)胞中FGFR1及下游Ras和MAPK蛋白的表達(dá)。結(jié)果：與對(duì)照組比較，慢性創(chuàng)面組miR-198表達(dá)量明顯增高（P<0.01），轉(zhuǎn)染抑制載體miR-198后，表皮干細(xì)胞中表達(dá)顯著性下調(diào)（P<0.01），細(xì)胞周期分析發(fā)現(xiàn)慢性創(chuàng)面組會(huì)抑制表皮干細(xì)胞增殖，轉(zhuǎn)染抑制載體（Anti-miR-198）阻斷miR-198后表皮干細(xì)胞增殖得到恢復(fù)。免疫組化檢測(cè)顯示，慢性創(chuàng)面培養(yǎng)組FGFR1陽(yáng)性表達(dá)數(shù)量增加，隨著轉(zhuǎn)染抑制miR-198載體的影響，F(xiàn)GFR1在轉(zhuǎn)染抑制載體組表達(dá)增加更明顯（P<0.01）。Western blot檢測(cè)顯示，在慢性創(chuàng)面模型中，轉(zhuǎn)染抑制載體（Anti-miR-198）后，F(xiàn)GFR1的蛋白表達(dá)明顯增加，轉(zhuǎn)染抑制載體組Ras和MAPK的蛋白表達(dá)明顯降低。結(jié)論：miR-198可能負(fù)向調(diào)控表皮干細(xì)胞FGFR1，抑制miR-198可以增強(qiáng)表皮干細(xì)胞FGFR1表達(dá)，加快表皮干細(xì)胞增殖和分化，從而能促進(jìn)慢性創(chuàng)面愈合。

[關(guān)鍵詞]miRNA-198;慢性創(chuàng)面;成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體1;表皮干細(xì)胞;愈合;修復(fù)

[中圖分類號(hào)]R329.2 ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A ? ?[文章編號(hào)]1008-6455（2019）05-0076-05

The Study of miRNA-198 Targeted Regulation of FGFR1 Expression in Epidermal Stem Cells to Induce the Mechanism of Chronic Wound

FENG Huan1，LIU Shi-yong2，ZHOU Yan3，KANG Hua-li4，HUANG Xiao-bing3

[the Second Affiliated Hospital of Army Medical University（Third Military Medical University）1.Wound Treatment Room;

2.Neurosurgery;3.Hepatobiliary Surgery;4.Laboratory，Chongqing 400037，China]

Abstract： Objective ?To investigate the effect of microRNA-198 （miR-198） on chronic wound formation， and the potential regulation mechanism of miR-198 via targeting fibroblast growth factor receptor 1 （FGFR1） in epidermal stem cells. Methods ?Sixty rats were included and divided into three groups according to the cultured epidermal stem cells. Twenty rats fed with basic diet were set into the control group. The others were in the diabetic model group， and of which， 32 rats were successfully established as the chronic wounds models. Next， these 32 rats were divided into chronic wound group （n=16） and transfection inhibitor vector group （n=16， this model were established by rapidly injecting miR-198 inhibitor transfection system solution via tail vein）. In order to calculate the healing rate of chronic wounds， the expression of epidermal stem cells was detected by immunohistochemistry. In addition， the effect of miR-198 on epidermal stem cells was further analyzed by cell growth curve test and cell cycle analysis， and the expression of fibroblast growth factor receptor-1 （FGFR1） in epidermal stem cells was detected by real-time quantitative polymerase chain reaction （PCR） test. Besides， the Western-blot method was used to detect the FGFR1 expression， and the corresponding downstream Ras and mitogen-activated protein kinase （MAPK） proteins were also detected. Results ?By comparing with control group， the miR-198 expression in the chronic wound group increased significantly （P<0.01）， and the expression of epidermal stem cells was significantly decreased in transfection inhibitor vector group （P<0.01）. In addition， cell cycle analysis showed that the proliferation of epidermal stem cells was inhibited in chronic wound group， which can be repaired after blocking miRNA-198 proliferation by transfection inhibition vector （Anti-miR-198）. Immunohistochemical results showed that the FGFR1 expression increased in the chronic wound group， and increased more significantly in the transfection inhibition vector group （P<0.01） underlying the influence of the transfection inhibition vector of miR-198. Western blot analysis showed that in the transfection inhibition vector group， FGFR1 increased significantly， and Ras and MAPK decreased significantly. Conclusions ?miR-198 may negatively regulate epidermal stem cell FGFR1. Inhibition of miR-198 can enhance the expression of FGFR1 in epidermal stem cells， accelerate the proliferation and differentiation of epidermal stem cells， and thus promote the healing of chronic wounds.

Key words： miRNA-198; chronic wound; fibroblast growth factor receptor 1; epidermal stem cells; heal; repair

慢性創(chuàng)面的治療是老年化社會(huì)面臨的醫(yī)學(xué)難題之一。文獻(xiàn)表明[1]，全球每年有超過(guò)150萬(wàn)的住院患者會(huì)出現(xiàn)糖尿病足潰瘍或壓瘡等慢性創(chuàng)面，加大患者感染等并發(fā)癥發(fā)生的可能，也給患者和社會(huì)帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)和醫(yī)療負(fù)擔(dān)。因此，研究其機(jī)制具有重要的科學(xué)和現(xiàn)實(shí)意義。既往研究發(fā)現(xiàn)，炎癥反應(yīng)異?？赡苁窃斐陕詣?chuàng)面愈合修復(fù)延遲的重要原因，而各種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，局部組織干細(xì)胞和循環(huán)來(lái)源的干細(xì)胞均參與了這一過(guò)程。miRNA在創(chuàng)面愈合中發(fā)揮重要的調(diào)控作用：Wang等研究發(fā)現(xiàn)，在創(chuàng)面愈合過(guò)程中miR-21可調(diào)控表皮層的上皮細(xì)胞和真皮間充質(zhì)細(xì)胞的活化和遷移[2];Xu等發(fā)現(xiàn)在糖尿病患者慢性創(chuàng)面中miR-146a可能調(diào)控炎癥反應(yīng)途徑，參與調(diào)節(jié)間充質(zhì)干細(xì)胞，從而促進(jìn)創(chuàng)面愈合[3]。此外，miRNA尚可通過(guò)調(diào)控干細(xì)胞自我更新、定向分化等過(guò)程影響創(chuàng)面愈合[4-5]。筆者研究也發(fā)現(xiàn)，慢性創(chuàng)面環(huán)境中存在miR-198異常高的表達(dá)，可能造成了創(chuàng)面難愈合現(xiàn)象。因此，研究miR-198對(duì)慢性創(chuàng)面中表皮干細(xì)胞增殖和分化產(chǎn)生影響的作用機(jī)制，將有望闡明慢性創(chuàng)面發(fā)病機(jī)制，也為尋找新的治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

1 ?材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：3月齡雄性普通級(jí)Wistar大鼠60只，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，體重200～250g，實(shí)驗(yàn)前測(cè)定基礎(chǔ)血糖與尿糖。

1.2 試劑：四氧嘧啶（上海鼓臣生物公司，批號(hào)：GC8748）、中性蛋白酶（北京索萊寶公司，批號(hào)：Z8030）、胰蛋白酶（北京瑞達(dá)恒輝科技發(fā)展有限公司，批號(hào)：HB-0103-01）、β1-integrin和角質(zhì)蛋白K19試劑盒（美國(guó)賽默飛世爾科技，批號(hào)：4366594和4798695）、FGFR1抗體（美國(guó)賽默飛世爾科技，批號(hào)：822255）、Annexin-V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（上海前塵生物科技有限公司，批號(hào)：40302ES20）、小牛血清（北京索萊寶公司，批號(hào)：01-045），RPMI-1640培養(yǎng)基（美國(guó)GIBCO公司，批號(hào)：11875-093）等。

1.3 方法

1.3.1 造模及分組：60只雄性普通級(jí)Wistar大鼠，在進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，取20只用基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，其余40只造模組按體重150mg/kg腹腔注射3%四氧嘧啶，1周后當(dāng)動(dòng)物血糖濃度大于11?mmol/l即為糖尿病模型復(fù)制成功。創(chuàng)面模型制作取上述60只大鼠，麻醉后在無(wú)菌條件下用打孔器在鼠背中部脊柱兩側(cè)各打一圓孔，深至皮下，直徑1.8cm，創(chuàng)面面積為2.54cm2。止血后包扎，確定創(chuàng)面造模成功，其中40只糖尿病大鼠共有32只造模成功，其中16只命名為慢性創(chuàng)面組，另外16只在創(chuàng)面組織處運(yùn)用脂質(zhì)體Lipofectamine 2 000轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染，根據(jù)鼠源pGC-FU-anti-miR198序列，設(shè)計(jì)并合成其雙鏈模擬物，轉(zhuǎn)染FAM標(biāo)記pGC-FU-anti-miR198模擬物（n=5）。轉(zhuǎn)染72h后在倒置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染情況，命名為轉(zhuǎn)染抑制載體組，制作后定時(shí)測(cè)血糖，采用補(bǔ)充注射四氧嘧啶或胰島素（2?/只）方式維持糖尿病動(dòng)物血糖在11～16.5mmol/l，其余20只非糖尿病大鼠命名為對(duì)照組，隔天觀察創(chuàng)面變化，用透明膜描記和照像法記錄創(chuàng)面大小，計(jì)算機(jī)圖象分析系統(tǒng)進(jìn)行處理、校定，計(jì)算創(chuàng)面愈合。

1.3.2 miR-198對(duì)慢性創(chuàng)面愈合的影響：在確定anti-miR198載體轉(zhuǎn)染慢性創(chuàng)面動(dòng)物模型構(gòu)建好之后，觀察3、5、7、10、14d各組創(chuàng)面的變化，計(jì)算創(chuàng)面愈合率，動(dòng)物致傷后立即測(cè)定面積為傷口原始面積，愈合指數(shù)=（1-現(xiàn)創(chuàng)面面積/原創(chuàng)面面積）×100%。

1.3.3 創(chuàng)面表皮干細(xì)胞的體外培養(yǎng)：取正常組、慢性創(chuàng)面組和轉(zhuǎn)染抑制載體組72h后的大鼠創(chuàng)面處皮膚，標(biāo)本用0.01M PBS和青/鏈霉素雙抗液反復(fù)沖洗5次，徹底清除血污。無(wú)菌條件下用眼科剪修剪標(biāo)本，去除皮下軟組織，將標(biāo)本剪成約0.3cm×0.5cm皮膚碎片。將皮膚碎片浸入0.25% DispaseⅡ溶液，4℃，靜置12～16h后取出皮片，棄去0.25% Dispase Ⅱ溶液，在培養(yǎng)皿中用0.01M PBS反復(fù)沖洗3次，用眼科鑷分離表皮與真皮，收集表皮組織，將表皮組織浸入0.25%胰蛋白酶溶液，37℃消化15min左右后加入適量含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液終止消化。用200目濾網(wǎng)過(guò)濾得到的混懸液，收集濾液，1 000rpm/min離心5min。棄上清，0.01M PBS重懸細(xì)胞，PBS重懸洗滌的細(xì)胞1 000rpm/min離心5min。棄上清，加入DK-SFM培養(yǎng)基，制成懸液，將細(xì)胞接種于包被好Ⅳ型膠原的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置10min。小心棄去細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的液體，用PBS輕輕漂洗后，加入DK-SFM培養(yǎng)基。鏡下觀察，培養(yǎng)瓶底部有貼壁的小圓形細(xì)胞，即為分離培養(yǎng)的原代大鼠ESCs。置于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第2天更換細(xì)胞培養(yǎng)基，以后每2d更換一次培養(yǎng)基。采用克隆形成率和生長(zhǎng)曲線方法測(cè)試干細(xì)胞的增殖情況，同時(shí)免疫組化方法檢測(cè)β1-integrin和角質(zhì)蛋白K19的表達(dá)，鑒定其為表皮干細(xì)胞。

1.3.4 RT-PCR檢測(cè)各組大鼠創(chuàng)面表皮干細(xì)胞miR-198表達(dá)：取對(duì)照組、慢性創(chuàng)面組及轉(zhuǎn)染抑制載體組72h后的創(chuàng)面表皮干細(xì)胞，采用Trizol一步法對(duì)各組大鼠創(chuàng)面表皮干細(xì)胞RNA進(jìn)行提取，利用分光光度法檢測(cè)總RNA的濃度，甲醛變性膠電泳質(zhì)檢總RNA的質(zhì)量，使用mirVanaTM miRNA純化試劑盒對(duì)總RNA進(jìn)行純化，純化后重新定量，miRNA-198的mRNA表達(dá)檢測(cè)：每個(gè)樣本各取2μg總RNA，采用互補(bǔ)DNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成總互補(bǔ)DNA，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物采用SYBR Green熒光定量試劑盒和熒光定量RT-PCR儀行PCR，PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10min，95℃變性15s，60℃退火1min，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本重復(fù)PCR反應(yīng)3次。采用Δ循環(huán)閾值（Ct）法處理結(jié)果，計(jì)算相對(duì)表達(dá)量2-ΔΔCt。

1.3.5 miR-198對(duì)創(chuàng)面表皮干細(xì)胞生長(zhǎng)周期的影響：在培養(yǎng)基中，取第2代表皮干細(xì)胞，以1.3×104cells/cm2的密度接種于六孔板中，接種后12h，胰酶消化六孔內(nèi)細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液。細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到60%～70%融合時(shí)，0.25%胰蛋白酶消化制成單細(xì)胞懸液，加小鼠抗大鼠α6-integrin單克隆抗體，室溫孵育30min，Buffer緩沖液洗滌2遍。加抗小鼠PE，室溫避光15min，Buffer緩沖液洗滌2遍，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，觀察miR-198高表達(dá)和抑制miR-198后對(duì)慢性創(chuàng)面表皮干細(xì)胞生長(zhǎng)周期的影響。

1.3.6 miR-198調(diào)控創(chuàng)面表皮干細(xì)胞的作用靶點(diǎn)分析

1.3.6.1 SP法檢測(cè)創(chuàng)面表皮干細(xì)胞FGFR1及其下游Ras和MAPK的陽(yáng)性表達(dá)變化情況：各實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選取一張切片，采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶法，將樣本依次采用二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水處理，滴加雙氧水后進(jìn)行抗原修復(fù)，依次加入一抗、二抗進(jìn)行孵育，并嚴(yán)格按照說(shuō)明書操作，最后DAB/雙氧水顯色后，再用蘇木精復(fù)染，常規(guī)脫水、透明封片后進(jìn)行觀察。每組隨機(jī)取5個(gè)視野，重復(fù)6次，每片于200倍鏡下讀取陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，取平均值，用PBS代替一抗作陰性對(duì)照。在無(wú)背景著色的情況下，以細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)黃色顆粒為陽(yáng)性，對(duì)染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行綜合考慮。

1.3.6.2 Western blot法檢測(cè)各組創(chuàng)面表皮干細(xì)胞FGFR1及其下游Ras和MAPK蛋白的變化：表皮干細(xì)胞經(jīng)過(guò)研磨、裂解后，通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定蛋白濃度。上樣總蛋白質(zhì)量為80μg，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分離后，將蛋白質(zhì)通過(guò)電印跡轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)至PVDF膜，采用麗春紅S染色，并根據(jù)所需要的目標(biāo)條帶進(jìn)行剪膜。用含有脫脂奶粉（質(zhì)量濃度為5%）的TBS-T溶液在室溫下封閉2h，分別加入I抗（FGFR1抗工作液濃度為1：2 000，Ras和MAPK抗工作液濃度為1：300，GAPDH I抗工作液濃度為1：500），4℃過(guò)夜。TTBS洗膜后加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔或小鼠II抗（1：18 000稀釋），用TBS-T溶液洗膜后與ECL試劑進(jìn)行反應(yīng)，膠片曝光，掃描膠片，用Image J軟件計(jì)算條帶光密度（OD）值，以GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行系統(tǒng)軟件分析條帶的OD比值，評(píng)定蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x?±s）表示，重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)比較采用多元方差分析方法，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05、P<0.01表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 ?結(jié)果

2.1 miR-198對(duì)創(chuàng)面愈合的影響：與對(duì)照組比較，在第3、5、7、10、14天，慢性創(chuàng)面組的創(chuàng)面愈合率明顯低于對(duì)照組（P<0.01），與慢性創(chuàng)面組比較，轉(zhuǎn)染抑制載體組在第3、5、7、10、14天的創(chuàng)面愈合率明顯高于慢性創(chuàng)面組 （P<0.05，P<0.01），見表1。

2.2 表皮干細(xì)胞的分離培養(yǎng)和鑒定：采用血清角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基KSFM（Gibco），添加表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子和牛垂體提取物培養(yǎng)。發(fā)現(xiàn)其能在體外擴(kuò)增，長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)，具有自我更新和多分化潛能。同時(shí)，筆者采用免疫組化方法證實(shí)了β1-integrin在培養(yǎng)細(xì)胞中的表達(dá)，誘導(dǎo)分化后表達(dá)角質(zhì)蛋白K19，鑒定其為表皮干細(xì)胞，見圖1。

2.3 各組創(chuàng)面表皮干細(xì)胞中miR-198表達(dá)的檢測(cè)：研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，慢性創(chuàng)面組的miR-198表達(dá)量明顯增高（P<0.01），而在轉(zhuǎn)染抑制載體組中，表皮干細(xì)胞中的miR-198表達(dá)顯著性下調(diào)（P<0.01），見圖2。

2.4 miR-198對(duì)表皮干細(xì)胞增殖的影響：采用細(xì)胞周期分析發(fā)現(xiàn)，慢性創(chuàng)面組抑制了表皮干細(xì)胞的增殖，而轉(zhuǎn)染抑制載體（Anti-miR-198）阻斷miR-198后表皮干細(xì)胞的增殖得到恢復(fù)，提示miR-198可能作用于慢性創(chuàng)面表皮干細(xì)胞而發(fā)揮其抑制作用，見圖3。

2.5 miR-198對(duì)創(chuàng)面表皮干細(xì)胞FGFR1的影響：免疫組化檢測(cè)顯示，與對(duì)照組比較，慢性創(chuàng)面培養(yǎng)組的創(chuàng)面表皮干細(xì)胞FGFR1陽(yáng)性表達(dá)數(shù)量減少，隨著轉(zhuǎn)染抑制miR-198載體的影響，創(chuàng)面表皮干細(xì)胞FGFR1在轉(zhuǎn)染抑制載體組的表達(dá)增加明顯。見圖4。

2.6 免疫組織化學(xué)檢測(cè)各組表皮干細(xì)胞中FGFR1及其下游Ras和MAPK的表達(dá)：與對(duì)照組相比，慢性創(chuàng)面組表皮干細(xì)胞中的FGFR1的表達(dá)明顯降低（P<0.01），Ras和MAPK的表達(dá)明顯增加;與慢性創(chuàng)面組比較，轉(zhuǎn)染抑制miR-198載體后，表皮干細(xì)胞中FGFR1的表達(dá)明顯增加（P<0.01），Ras和MAPK的表達(dá)均明顯下降（P<0.01），見表2。

2.7 miR-198對(duì)創(chuàng)面表皮干細(xì)胞下游Ras和MAPK蛋白的影響：Western blot檢測(cè)顯示，在慢性創(chuàng)面模型中，轉(zhuǎn)染抑制miR-198載體后，創(chuàng)面表皮干細(xì)胞中FGFR1的蛋白表達(dá)明顯增加，初步提示FGFR1可能是miR-198作用于表皮干細(xì)胞的靶點(diǎn)，在慢性創(chuàng)面組中，表皮干細(xì)胞中Ras和MAPK的蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組和轉(zhuǎn)染抑制載體組，見圖5。

3 ?討論

創(chuàng)面愈合是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程[6]：可以分為炎癥反應(yīng)，肉芽組織形成、再上皮化及創(chuàng)面閉合后的塑形三個(gè)階段。創(chuàng)傷的愈合過(guò)程是在炎癥反應(yīng)啟動(dòng)下，趨化干細(xì)胞和相應(yīng)效應(yīng)細(xì)胞到達(dá)受傷部位，在各種細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子協(xié)同作用下，干細(xì)胞和相關(guān)細(xì)胞轉(zhuǎn)化修復(fù)。已經(jīng)證實(shí)[4-5]，在創(chuàng)面愈合過(guò)程中miRNA可通過(guò)干擾皮膚形態(tài)形成，抑制炎性細(xì)胞的粘附，調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能，影響組織血管生成等環(huán)節(jié)，進(jìn)而影響創(chuàng)面愈合。

已有研究顯示，表皮干細(xì)胞等多種干細(xì)胞在創(chuàng)傷修復(fù)中發(fā)揮重要作用[7-9]，是影響創(chuàng)面肉芽形成和再上皮化的重要細(xì)胞，而上皮化延遲或停頓被認(rèn)為是慢性創(chuàng)面形成的關(guān)鍵因素[10-11]。基于miRNA在慢性創(chuàng)面愈合中的重要作用，慢性創(chuàng)面組能夠抑制表皮干細(xì)胞的增殖，而采用轉(zhuǎn)染抑制載體（Anti-miR-198）阻斷miR-198后表皮干細(xì)胞的增殖得到恢復(fù)，提示miR-198可能作用于慢性創(chuàng)面表皮干細(xì)胞而發(fā)揮其抑制作用。Koenen P等[12]也發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象，急性創(chuàng)面分泌物促進(jìn)干細(xì)胞增殖，采用慢性分泌物作用于干細(xì)胞后則抑制其增殖。Sundaram[13]發(fā)現(xiàn)正常愈合創(chuàng)面中上皮角化細(xì)胞低表達(dá)miR-198，而在糖尿病足潰瘍等患者慢性創(chuàng)面中則為異常高表達(dá)。皮膚角化細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-198后，發(fā)現(xiàn)其遷移、增殖分化的能力明顯下降，再上皮化和愈合能力相應(yīng)下降。本研究發(fā)現(xiàn)，在慢性創(chuàng)面組表皮干細(xì)胞中miR-198的相對(duì)表達(dá)量增加，表明miR-198是慢性創(chuàng)面形成的重要因素。

筆者采用生物信息學(xué)分析方法，運(yùn)用Targetscan、miRanda、PicTar預(yù)測(cè)軟件在Targetscan、miRDB等數(shù)據(jù)庫(kù)中分析3 UTR結(jié)合位點(diǎn)以篩選出miR-198的作用靶點(diǎn)，結(jié)果顯示包括成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體1（FGFR1）可能是其作用靶點(diǎn)，為此筆者采用免疫組化和Western blot方法檢測(cè)了FGFR1基因在表皮干細(xì)胞（體外培養(yǎng)）中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)FGFR1的表達(dá)隨著轉(zhuǎn)染抑制載體的加入明顯增加，而其下游的Ras和MAPK的蛋白表達(dá)明顯降低，這更有利于慢性創(chuàng)面的愈合，初步提示FGFR1可能是miR-198作用于表皮干細(xì)胞的靶點(diǎn)。此外有研究發(fā)現(xiàn)[14]，F(xiàn)GFR1可使間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為成纖維細(xì)胞，這可能為創(chuàng)面愈合提供有效的組織細(xì)胞。筆者在研究中也發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染抑制載體組的創(chuàng)面愈合率明顯增加，而在慢性創(chuàng)面組中，慢性創(chuàng)面愈合明顯低于轉(zhuǎn)染抑制載體組，因此miR-198作用于表皮干細(xì)胞FGFR1具有一定理論基礎(chǔ)，即miR-198可能通過(guò)負(fù)相調(diào)控表皮干細(xì)胞FGFR1，抑制表皮干細(xì)胞的增殖和分化而影響慢性創(chuàng)面愈合。

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[收稿日期]2018-10-11

本文引用格式：馮歡，劉仕勇，周燕，等.miRNA-198靶向調(diào)控表皮干細(xì)胞內(nèi)FGFR1表達(dá)誘導(dǎo)慢性創(chuàng)面形成的機(jī)制研究[J].中國(guó)美容醫(yī)學(xué)，2019，28（5）：76-80.