基于油菜籽碳量子點熒光恢復(fù)測定鹽酸米諾環(huán)素的研究

武文波，張越誠，馬紅燕，田 銳，劉曉莉

(延安大學 化學與化工學院，延安市分析技術(shù)與檢測重點實驗室，陜西 延安 716000)

碳量子點(CQDs)作為新型、綠色的納米級熒光材料，具有發(fā)光特性穩(wěn)定、水溶性良好以及成本低廉、合成簡便等優(yōu)點[1]，近年來引起了人們的廣泛關(guān)注[2-3]。目前，合成CQDs所用碳源材料的選取及其發(fā)光性能表征與分析應(yīng)用方面的研究日趨活躍[4-5]。CQDs在分析化學領(lǐng)域的應(yīng)用大多集中在金屬離子測定方面[6-7]，而以CQDs為熒光探針開展藥物分析的工作較少。

鹽酸米諾環(huán)素(Minocycline hydrochloride，MINO)屬于廣譜類抗生素，廣泛用于臨床，抗菌作用顯著。目前，定量檢測MINO的方法較少，有化學發(fā)光分析法[8]、高效液相色譜法[9]、濁度法[10]和分光光度法[11]等，這些方法存在線性范圍窄、檢出限高，甚至需要特殊合成的顯色劑等不足，因而，開展MINO的簡單、快速、靈敏的檢測方法的研究顯得尤為必要。

本文以天然油菜籽為碳源，只加入水，無需其他試劑，利用水熱法一步合成了綠色熒光CQDs。實驗發(fā)現(xiàn)，KMnO4可以有效地猝滅該CQDs的熒光；而當有MINO存在時，由于MINO與KMnO4的氧化還原作用，使KMnO4從CQDs的表面移除下來，CQDs的熒光恢復(fù)，且在一定濃度范圍內(nèi)，CQDs的熒光恢復(fù)值與MINO的濃度呈良好的線性關(guān)系?；诖?，首次構(gòu)建了檢測MINO的“關(guān)-開”型熒光探針，該方法操作簡單、響應(yīng)快速靈敏。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

FLSP920型瞬態(tài)穩(wěn)態(tài)熒光光譜儀(英國愛丁堡儀器有限公司)；Agilent-8453型紫外-可見分光光度計(美國安捷倫儀器有限公司)；F-4500型熒光分光光度計(日本日立儀器有限公司)；IR Prestige-21型傅立葉變換紅外光譜儀(日本島津儀器有限公司)。

BR緩沖溶液(pH 2.78)、KMnO4(5.0×10-4mol/L)。實驗用水為超純水，所用試劑均為分析純。油菜籽(市售)。

1.2 實驗方法

1.2.1 CQDs的合成取30.00 mL超純水加入到25.00 g粉碎的油菜籽中，將其密封于50 mL有聚四氟乙烯內(nèi)襯的高壓反應(yīng)釜中，180 ℃加熱20 h，待高壓反應(yīng)釜冷卻至室溫后，得到深褐色的液體，即CQDs的粗產(chǎn)品。粗產(chǎn)品經(jīng)濾紙過濾后用0.22 μm的微孔濾膜再次過濾，最后移至100 mL容量瓶中定容，稀釋100倍即得CQDs工作液，備用。

1.2.2 MINO的檢測向一系列10 mL比色管中依次加入2.00 mL CQDs溶液、2.00 mL pH 2.78的BR緩沖溶液、1.00 mL 5.0×10-4mol/L的KMnO4溶液以及不同濃度的MINO溶液，用超純水定容，搖勻，于室溫下反應(yīng)30 min后，測定λex/λem=331 nm/409 nm下的熒光強度IF和試劑空白的熒光強度IF0，計算體系熒光強度變化ΔIF(IF-IF0)與MINO濃度之間的關(guān)系，狹縫寬度均為5 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 油菜籽CQDs的表征

2.1.1 CQDs的形貌表征實驗對油菜籽CQDs進行了透射電鏡表征，如圖1所示，得到的CQDs呈單球狀或類球狀，平均粒徑大小為9 nm左右。

圖1 CQDs的透射電鏡圖(A)和粒徑分布圖(B)Fig.1 TEM image(A)and size distribution(B)of CQDs

圖2 CQDs在不同激發(fā)波長下的發(fā)射光譜(A)、傅立葉變換紅外光譜(B)和XRD圖譜(C)Fig.2 Emission spectra of CQDs at different excitation wavelengths(A)，F(xiàn)TIR(B)and XRD spectrum(C) of CQDs

圖3 不同體系的熒光光譜(λex=331 nm)Fig.3 Fluorescence spectra of different systems(λex=331 nm)

2.1.2 CQDs的光譜特性掃描油菜籽CQDs在不同激發(fā)波長下的熒光光譜，由圖2A可知，該CQDs的激發(fā)波長λex影響發(fā)射峰的強度和位置，當激發(fā)波長從301 nm增加到361 nm時，發(fā)射波長從405 nm逐漸紅移至427 nm；熒光信號強度先增大后減小，當激發(fā)波長為331 nm時發(fā)光強度達最大，此時的發(fā)射波長為409 nm。

CQDs的晶格形態(tài)可用XRD圖譜來表征，由圖2C可以看出，CQDs在2θ為22.52°處有一個衍射寬峰，該峰為無定形態(tài)碳的特征峰[12]，因此該CQDs的晶型為無定型碳。

相反，芳子作為“新女性的代表”，追求自由戀愛，與封建思想抗爭，最后為了戀人的成功拋棄了自己的文學夢想，回到了老家。她的愛是更純粹的，但在日本當時的封建思想很強，不得不犧牲自己。她是這個新的西洋思想和封建思想之爭的“犧牲品”。我認為這個“犧牲”的“悲壯性”是更嚴重的。

2.1.3 CQDs熒光量子產(chǎn)率在λex=313 nm激發(fā)波長下，硫酸介質(zhì)中硫酸奎寧的熒光產(chǎn)率為55%，以硫酸奎寧為標準溶液，采用參比法[13]計算得CQDs的熒光量子產(chǎn)率為4.9%。

2.1.4 KMnO4對CQDs的猝滅作用與MINO對CQDs-KMnO4體系熒光的恢復(fù)室溫下，掃描體系在激發(fā)波長331 nm下的熒光光譜，結(jié)果見圖3。由圖可知，在該激發(fā)波長下，MINO無熒光，MINO與KMnO4反應(yīng)的產(chǎn)物也無熒光。KMnO4的加入對CQDs熒光有強烈的猝滅作用(曲線2)，將MINO加入CQDs-KMnO4體系后，CQDs熒光得到恢復(fù)(曲線3)。實驗發(fā)現(xiàn)，隨MINO加入量的增大，CQDs- KMnO4體系的熒光信號恢復(fù)值逐漸增強，因此，CQDs- KMnO4體系有望用于MINO的測定。

2.2 MINO測定條件的優(yōu)化

2.2.1 酸度、緩沖溶液種類及用量考察了不同pH值對測定體系熒光強度的影響，結(jié)果表明，pH 2.78時，CQDs的熒光恢復(fù)效率最大，且熒光強度穩(wěn)定?？疾炝烁拾彼?鹽酸、BR、鄰苯二甲酸-鹽酸、磷酸氫二鈉-檸檬酸等不同種類緩沖溶液(pH 2.78)及其用量(0.5～3.0 mL)對體系熒光強度的影響，結(jié)果表明：使用2.00 mL pH 2.78的BR緩沖溶液時體系熒光恢復(fù)值ΔIF最大。

2.2.2 KMnO4用量的選擇KMnO4的用量影響MINO檢測的背景值和線性范圍。實驗發(fā)現(xiàn)，KMnO4用量小，CQDs猝滅效率低，檢測的線性范圍窄；但是若KMnO4用量過大，加入的MINO會首先與游離的KMnO4反應(yīng)，影響熒光效率的恢復(fù)。綜合考慮，選擇加入KMnO4溶液1.00 mL。

2.2.3 CQDs的用量考察了CQDs用量的影響，實驗表明：當CQDs的加入量為2.00 mL時，CQDs的熒光恢復(fù)效率ΔIF最大。

2.3 體系的穩(wěn)定性

KMnO4對油菜籽CQDs熒光的猝滅是一個快速過程，猝滅效率在5 min內(nèi)即達到最大，猝滅程度在24 h內(nèi)基本保持不變。加入MINO后，MINO對CQDs-KMnO4體系的熒光恢復(fù)值ΔIF在反應(yīng)0.5 h后趨于最大，且其熒光強度在4.0 h內(nèi)基本不變。

2.4 干擾物質(zhì)的影響

在選定的實驗條件下，當MINO溶液濃度為5.0×10-6mol/L，相對誤差在±5%范圍內(nèi)時，考察了MINO制劑相關(guān)輔料和常見物質(zhì)[14]的干擾情況。結(jié)果表明，1 000倍的淀粉、蔗糖、果糖、葡萄糖、Mg2+，100倍的Ag+、Co2+、Ca2+、Zn2+、Ni2+、聚乙烯醇，50倍的Mn2+、羧甲基纖維素鈉，20倍的Cu2+，5倍的Fe3+、Cr6+不干擾測定。

2.5 檢出限及線性范圍

在優(yōu)化的實驗條件下，MINO的濃度(c)在5.0×10-7～1.0×10-5mol/L范圍內(nèi)與熒光強度恢復(fù)值ΔIF呈良好線性關(guān)系，線性方程為ΔIF=2.91×107c(mol/L)-7.98，相關(guān)系數(shù)r為0.999 5。平行測定5.0×10-6mol/L的MINO溶液5次，其RSD為1.5%。根據(jù)IUPAC規(guī)定，以DL=3σ/k計算得到該方法的檢出限為4.9×10-7mol/L。

2.6 樣品測定

隨機抽取同一批號的MINO膠囊10粒，稱取適量(相當于0.049 4 g MINO)，加水攪拌，超聲溶解10 min后轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，定容，搖勻，靜置10 min，過濾。準確移取適量上清液，按照實驗方法進行測定，結(jié)果見表1。

表1 樣品測定結(jié)果及回收率(n=5)Table 1 Determination results of MINO in samples and recovery of the method(n=5)

1.Kunming Pharmaceutical Group Co.,Ltd,product batch number:H10940017;2.Jiangsu Wyeth Pharmaceutical Co.,Ltd,product batch number:H10960011

2.7 機理初探

圖4B為KMnO4-MINO體系的紫外-可見光譜圖，在KMnO4體系中加入MINO，吸收光譜發(fā)生了變化，表明MINO可與KMnO4發(fā)生氧化還原反應(yīng)。

圖4 CQDs-KMnO4(A)和KMnO4-MINO(B)體系的紫外-可見吸收光譜Fig.4 UV-Vis absorption spectra of CQDs-KMnO4(A)and KMnO4-MINO(B)systems

其次，對CQDs和CQDs-KMnO4體系的熒光壽命進行了擬合。通過瞬態(tài)穩(wěn)態(tài)熒光光譜儀分別進行測定，結(jié)果見表2。CQDs的加權(quán)平均壽命[16]為7.29 ns，CQDs-KMnO4的為6.61 ns，熒光壽命減小，也表明KMnO4與CQDs之間是動態(tài)猝滅，即KMnO4與激發(fā)態(tài)的CQDs進行了相互作用。

ωrepresents the relative weight;τrepresents the component lifetime;χ2represents the chi-square test

基于以上實驗現(xiàn)象和結(jié)果，推測體系“關(guān)-開”機理如下：光激發(fā)CQDs，使CQDs在導(dǎo)帶和價帶之間產(chǎn)生電子空穴對。當KMnO4加入到CQDs溶液中時，KMnO4通過電子轉(zhuǎn)移的方式[17]與CQDs表面的基團作用并結(jié)合于CQDs表面。因KMnO4具有強氧化性，易得電子，使得KMnO4最低空軌道LUMO的能量低于CQDs的導(dǎo)帶能量，從而導(dǎo)致CQDs導(dǎo)帶中的激發(fā)態(tài)電子不能有效回到價帶，而是以非輻射的形式轉(zhuǎn)移到KMnO4最低空軌道LUMO上，使得熒光信號“關(guān)”。當MINO加入到CQDs-KMnO4體系中時，由于MINO與KMnO4具有更強的作用力，強還原性的MINO與結(jié)合于CQDs表面的KMnO4發(fā)生反應(yīng)，將KMnO4從CQDs表面移除，使CQDs的熒光得到恢復(fù)，熒光信號“開”，其可能機理如圖5所示。

圖5 CQDs的熒光“關(guān)-開”機理圖Fig.5 Mechanism of CQDs quenching and fluorescence recover

3 結(jié) 論

采用一步水熱法合成了強熒光油菜籽CQDs?；贙MnO4可使油菜籽CQDs熒光猝滅和MINO可使猝滅后CQDs熒光重新恢復(fù)的現(xiàn)象，建立了“關(guān)-開”型CQDs熒光探針檢測MINO的新方法，該方法靈敏、快速，準確，拓展了CQDs在分析化學領(lǐng)域的應(yīng)用范圍，為藥物熒光檢測提供了新思路。