QuEChERS前處理結(jié)合HPLC-Q-TOF/MS非靶向快速篩查涼茶中的非法添加物

曾廣豐，謝建軍*，王志元，陳 峰，李 菊

(1.廣東檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣東 廣州 510623；2.廣東省動(dòng)植物與食品進(jìn)出口技術(shù)措施研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 ，廣東 廣州 510623)

涼茶是嶺南人民根據(jù)本地的水土和氣象等特性，在預(yù)防疾病與保健養(yǎng)生的過程中，用獨(dú)特的研制方法將天然中草藥熬制成一種具有清熱解毒、利津祛火、防治常病等功能的植物性飲料[1-2]。自2006年廣東涼茶成功列入首批國家級(jí)非物質(zhì)文化保護(hù)遺產(chǎn)以來，涼茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅猛，市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)激烈。一些不法商家受利益驅(qū)使，為增強(qiáng)療效，搶占市場(chǎng)，在自制涼茶中非法添加解熱鎮(zhèn)痛和止咳西藥。消費(fèi)者飲用此類涼茶可能會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重肝腎毒性。

目前涼茶中違禁化學(xué)藥物的檢測(cè)方法主要包括薄層色譜法[3-4]、高效液相色譜法[5-6]和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[7-8]等。上述涼茶中非法添加成分的分析方法是針對(duì)已知目標(biāo)成分的分析，需有相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品。色譜類設(shè)備和基于四極桿型質(zhì)量分析器的質(zhì)譜由于靈敏度和分辨率低，只能用于數(shù)量不多的已知目標(biāo)物檢測(cè)[9-11]。如果需要對(duì)非靶向目標(biāo)物進(jìn)行定性檢測(cè)，則需要借助分辨率更高的質(zhì)譜分析技術(shù)[12-14]。四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜(Q-TOF/MS)是一種可以快速區(qū)分和鑒定涼茶中非法添加物的有效方法，在一級(jí)質(zhì)譜中可確定目標(biāo)物分子量，再通過二級(jí)質(zhì)譜得到各化合物的不同碎片信息，結(jié)合HPLC 中的保留時(shí)間信息,并與文獻(xiàn)或標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照從而確定化合物的結(jié)構(gòu)[15-16]。本文以涼茶作為研究基質(zhì)，結(jié)合QuEChERS前處理技術(shù)，采用HPLC-Q-TOF/MS對(duì)涼茶中的非法添加物進(jìn)行無標(biāo)準(zhǔn)品非靶向快速定性篩查。該方法分析速度快、通量高，可為涼茶中非法添加物的快速篩查和質(zhì)量控制提供重要的方法依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 藥品及試劑

對(duì)乙酰氨基酚、鹽酸苯海拉明、雙氯芬酸鈉、馬來酸氯苯那敏(純度大于99.0%，德國Dr.Ehrestorfor，購自安譜公司)；罌粟堿、那可丁、可待因、蒂巴因、可待因-D3(純度大于99.0%，CNW，購自安譜公司)；乙腈、甲酸(HPLC級(jí)，美國Thermo Fisher公司)；氯化鈉、檸檬酸鈉、檸檬酸氫二鈉、無水硫酸鎂、中性氧化鋁(Al-N)、氨丙基粉(NH2)、石墨化炭黑(GCB)、N-丙基乙二胺(PSA)、硅膠粉、堿性氧化鋁(Al-B)、硅膠鍵合十八烷基(C18)均購自安譜公司。實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q 超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

TripleTOFTM5600高分辨質(zhì)譜儀(美國AB SCIEX公司)；島津LC-20AD液相色譜系統(tǒng)(日本島津公司)；Milli-Q Advantage A10 超純水系統(tǒng)(法國Merck Millipore公司)。

1.3 樣品收集與前處理

涼茶樣品分別購于散裝涼茶零售店，包括口腔茶、咽喉茶、感冒茶、止咳茶、清熱降火茶等。

準(zhǔn)確稱取5 g涼茶樣品于50 mL聚丙烯塑料離心管中，加入10 mL 0.5%乙酸乙腈，渦旋振蕩1 min后加入4.0 g MgSO4、0.5 g檸檬酸鈉、0.5 g檸檬酸氫二鈉和1.0 g NaCl，渦旋振蕩提取5 min，于10 000 r/min離心5 min，吸收上清液1 mL于裝有75 mg氨丙基粉的2 mL離心管中渦旋振蕩1 min，于12 000 r/min離心10 min，上清液過0.22 μm有機(jī)濾膜，濾液供HPLC-Q-TOF/MS測(cè)定。

1.4 儀器條件

1.4.1 色譜條件色譜柱：Waters BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流動(dòng)相：A為0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸，B為乙腈，梯度洗脫：0～10 min，5%～90%B；10～13 min，90%～100%B；13～16 min，100%B；16～17 min，100%～5%B；17～20 min，5%B；流速：0.5 mL/min；進(jìn)樣量5 μL；柱溫：40℃。

1.4.2 質(zhì)譜條件離子源：ESI和APCI復(fù)合源；APCI源連接ABsciex公司自動(dòng)校正系統(tǒng)(CDS)，每10個(gè)樣品自動(dòng)校正1次，校正液流速0.35 mL/min；一級(jí)TOF/MS掃描精確質(zhì)量范圍：100～1 000 Da；數(shù)據(jù)采集時(shí)間：100 ms；二級(jí)IDA-MS掃描精確質(zhì)量范圍：50～1 000 Da；高靈敏模式；數(shù)據(jù)采集時(shí)間：50 ms；信號(hào)閾值：100 cps； IDA實(shí)驗(yàn)每循環(huán)采集6次數(shù)據(jù)，動(dòng)態(tài)背景減法扣除。源內(nèi)參數(shù)見表1。

表1 TOF-IDA-MS模式的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS parameters of TOF-IDA-MS

1.5 篩查方法

樣液的高分辨質(zhì)譜信息由ABSciex公司的Analyst TF 1.6軟件采集，并采用PeakView 2.0軟件對(duì)實(shí)際樣品中的非法添加物進(jìn)行篩查。通過查閱文獻(xiàn)，得到常見的解熱鎮(zhèn)痛和止咳西藥的化合物列表，并導(dǎo)入數(shù)據(jù)分析軟件中。然后設(shè)置相應(yīng)的檢索參數(shù)：精確質(zhì)量偏差范圍為±1×10-5，保留時(shí)間限定范圍為±0.2 min，離子化模式設(shè)定為+H模式。用軟件計(jì)算化合物的實(shí)測(cè)值與理論值的偏差，通過分子離子的精確質(zhì)量偏差、同位素分布、同位素比例及保留時(shí)間進(jìn)行綜合分析，并給出相應(yīng)的檢索匹配得分值，對(duì)于檢索結(jié)果中精確質(zhì)量數(shù)、同位素比值和二級(jí)碎片匹配得分值大于80的化合物，本方法確認(rèn)其為檢出非法添加物。

2 結(jié)果與討論

2.1 非靶向快速篩查非法添加物的質(zhì)控方法

為確保篩查結(jié)果的準(zhǔn)確性，本實(shí)驗(yàn)挑選 8種非法添加物進(jìn)行質(zhì)控實(shí)驗(yàn)。選擇的非法添加物包括解熱鎮(zhèn)痛類西藥和止咳平喘類西藥:對(duì)乙酰氨基酚、馬來酸氯苯那敏、雙氯芬酸鈉、鹽酸苯海拉明、蒂巴因、罌栗堿、那可丁、可待因。選擇的8種質(zhì)控化合物極性跨度大、出峰時(shí)間分散，離子化模式同時(shí)包括正負(fù)離子模型，能夠有效監(jiān)控非靶向篩查過程中整體實(shí)驗(yàn)條件的穩(wěn)定性，確保篩查結(jié)果穩(wěn)定可靠。8種質(zhì)控化合物分別在“1.5”條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化前處理和儀器檢測(cè)條件。

2.1.1 質(zhì)譜檢測(cè)模式選擇由于對(duì)乙酰氨基酚、鹽酸苯海拉明、馬來酸氯苯那敏、可待因、罌粟堿、蒂巴因和那可丁在ESI+模式下分子離子峰具有更高的響應(yīng)，信號(hào)更穩(wěn)定，故選擇正離子模式檢測(cè)，其分子離子峰為[M+H]+；雙氯芬酸鈉的分子結(jié)構(gòu)中含有Na+，在ESI-模式下可獲得較高響應(yīng)，故選擇負(fù)離子模式檢測(cè)，其分子離子峰為[M-Na]-。Triple TOF 5600型系統(tǒng)中配置的復(fù)合離子源有電噴霧離子源和大氣壓化學(xué)電離源兩種，本研究選擇電噴霧離子源作為檢測(cè)離子源，大氣壓化學(xué)電離源作為校正離子源。

2.1.2 吸附劑的種類與用量考察了Al-N、NH2、GCB、PSA、Si和C18吸附劑的凈化效果及吸附劑的最佳用量，結(jié)果如圖1所示。當(dāng)各吸附劑用量均為100 mg時(shí)，NH2粉對(duì)8種目標(biāo)化合物的吸附最小，回收率為86.8%～100%；而其它吸附劑對(duì)目標(biāo)化合物的影響較大，個(gè)別化合物的回收率低于65%。同時(shí)，考察了不同用量的NH2粉對(duì)8種質(zhì)控化合物吸附情況的影響。當(dāng)NH2粉的用量為75 mg時(shí)，8種目標(biāo)化合物的吸附最小，回收率為89.8%～100%；隨著NH2粉用量的增加，雙氯芬酸鈉的回收率逐漸降低，當(dāng)NH2粉用量為175 mg時(shí)，回收率只有44.2%。因此，最終選用NH2粉作為吸附劑，其最佳用量為75 mg，此時(shí)可獲得較好的凈化效果。

圖1 不同吸附劑對(duì)8種質(zhì)控化合物回收率的影響Fig.1 Effects of different sorbents on recoveries of 8 compoundsA:paracetamol,B:diphenhydramine,C:chlorphenamine maleate,D:diclofenac sodium,E:codeine,F:thebaine,G:noscapine,H:papaverine

2.1.3 質(zhì)控化合物的定性定量依據(jù)本研究選擇8種非法添加物作為目標(biāo)分析對(duì)照物質(zhì)，對(duì)8個(gè)目標(biāo)化合物進(jìn)行HPLC-Q-TOF/MS分析，以獲得目標(biāo)化合物的高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)信息；根據(jù)一級(jí)TOF/MS和二級(jí)IDA-MS質(zhì)譜信息定性定量分析目標(biāo)化合物。8個(gè)目標(biāo)化合物的定性定量分析質(zhì)譜數(shù)據(jù)見表2。

表2 8種非法添加物的高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)Table 2 Mass fragmentations of 8 compounds analyzed by IDA-MS

圖2 8種質(zhì)控化合物的提取離子流色譜圖Fig.2 Extracted ion chromatogram of 8 compounds

2.1.4 質(zhì)控非法添加物定量曲線的建立樣品中8種非法添加物的含量，根據(jù)目標(biāo)化合物的一級(jí)TOF/MS高分辨質(zhì)譜信息進(jìn)行分析。可待因用內(nèi)標(biāo)法定量，其它化合物用外標(biāo)法定量。首先利用HPLC-Q-TOF/MS獲得目標(biāo)化合物的離子流色譜圖，8種目標(biāo)化合物配制成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，稀釋成系列不同質(zhì)量濃度，檢測(cè)后獲得目標(biāo)化合物的校正曲線以及線性范圍(見表3)；同時(shí)以3 倍信噪比和10 倍信噪比為依據(jù)，確定方法的檢出限與定量下限。8 種目標(biāo)化合物的高分辨提取離子流圖見圖2。結(jié)果表明，校準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)(r2)均不小于0.999 0，檢出限為2.0～10 μg/kg，定量下限為5.0～25 μg/kg，相關(guān)參數(shù)見表3。由質(zhì)控非法添加物的定量分析結(jié)果可知，本方法的檢出限低、靈敏度高，可用于非靶向非法添加物的快速篩查。

表3 8種化合物的線性范圍、相關(guān)系數(shù)(r2)、檢出限與定量下限Table 3 Linear ranges,correlation coefficients(r2),LODs and LOQs of 8 compounds compounds

2.1.5 質(zhì)控化合物的精密度對(duì)檢測(cè)為陰性的感冒茶基質(zhì)進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。添加3個(gè)不同濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)濃度水平做6份平行樣品，其平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)結(jié)果見表4。由表4可知，樣品的平均回收率為75.8%～95.6%,RSD為2.1%～6.5%，方法的精密度及準(zhǔn)確度良好，可用于非靶向非法添加物殘留的快速篩查。

表4 8種質(zhì)控化合物的平均回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 4 Average recoveries and relative standard deviations of 8 compounds(n=6)

2.2 非靶向非法添加物殘留的快速篩查流程

基于“2.1”的優(yōu)化結(jié)果可知，本方法的篩查技術(shù)穩(wěn)定性好、靈敏度高，可擴(kuò)展到解熱鎮(zhèn)痛類西藥和止咳類西藥的非靶向篩查。自建高分辨數(shù)據(jù)庫是實(shí)現(xiàn)非靶向篩查的基礎(chǔ)，PeakView 2.0軟件是進(jìn)行化合物信息數(shù)據(jù)存儲(chǔ)以及歸類的專業(yè)軟件。將關(guān)注的解熱鎮(zhèn)痛類西藥和止咳類西藥的分子式導(dǎo)入PeakView 2.0構(gòu)成篩查數(shù)據(jù)庫。樣品經(jīng)前處理后供HPLC-Q-TOF/MS測(cè)定。采集的一級(jí)質(zhì)譜圖包含化合物的精確質(zhì)量數(shù)和分子式。使用一級(jí)譜圖對(duì)篩查出的可疑非法添加物進(jìn)行一級(jí)同位素分布和母離子精確質(zhì)量數(shù)匹配分析。如果一級(jí)譜圖信息匹配，再對(duì)二級(jí)碎片豐度比和精確質(zhì)量數(shù)等信息進(jìn)行匹配。通過ChemDraw Ultra 12.0軟件繪制可疑成分的結(jié)構(gòu)式，并將其導(dǎo)入PeakView 2.0軟件，將結(jié)構(gòu)與二級(jí)碎片進(jìn)行匹配，并結(jié)合相應(yīng)的檢索匹配得分值判斷目標(biāo)化合物是否檢出。以對(duì)乙酰氨基酚篩查為例，建立非靶向篩查非法添加西藥的分析方法，篩查流程圖見圖3：將對(duì)乙酰氨基酚分子式導(dǎo)入PeakView 2.0中，并定義離子化模式為[M+H]+，得到的一級(jí)高分辨精確質(zhì)量數(shù)和同位素比例見圖3A。調(diào)用其二級(jí)質(zhì)譜圖，結(jié)合其結(jié)構(gòu)式進(jìn)行結(jié)構(gòu)與二級(jí)精確質(zhì)量數(shù)的匹配。匹配結(jié)果見圖3B，對(duì)乙酰氨基酚的3個(gè)主要碎片均與結(jié)構(gòu)完全匹配，3個(gè)碎片的精確質(zhì)量數(shù)誤差小于0.001 Da，因此可判定為檢出。本文所建立涼茶中的非法添加物非靶向篩查技術(shù)完全滿足方法學(xué)要求。

圖3 對(duì)乙酰氨基酚的定性篩查圖示Fig.3 Qualitative screening flow chart of paracetamol

2.3 實(shí)際樣品的篩查

采取建立的篩查方法對(duì)市售的50份散裝涼茶樣品進(jìn)行測(cè)定。首先使用“1.5”所建立的方法對(duì)樣品進(jìn)行篩查，如定性檢出非法添加物，再進(jìn)行定量分析。檢測(cè)結(jié)果表明，共有10份涼茶樣品檢出對(duì)乙酰氨基酚，其中3份口腔茶的檢出量分別為21.5、4.43、6.11 mg/kg；2份咽喉茶的檢出量分別為5.38、4.14 mg/kg；1份感冒茶的檢出量為5.66 mg/kg；1份止咳茶的檢出量為4.59 mg/kg；1份潤肺止咳茶的檢出量為26.7 mg/kg； 2份特效感冒茶的檢出量分別為2 188、1 519 mg/kg。

3 結(jié) 論

本文利用QuEChERS/HPLC-Q-TOF/MS建立了涼茶中非法添加物的非靶向篩查方法。通過添加 8種化合物作為質(zhì)控化合物，優(yōu)化了QuEChERS方法對(duì)涼茶樣品的前處理?xiàng)l件。采用軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，無需對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品，通過對(duì)目標(biāo)化合物母離子的精確質(zhì)量數(shù)、同位素比例等信息進(jìn)行比對(duì)，并結(jié)合二級(jí)碎片譜圖與結(jié)構(gòu)匹配技術(shù)即可同時(shí)篩查和確認(rèn)涼茶中的多種非法添加物殘留。本方法的建立可為涼茶中非法添加西藥的快速篩查和質(zhì)量控制提供技術(shù)依據(jù)。