基質(zhì)膠對(duì)植入式葡萄糖傳感器外膜材料殼聚糖生物相容性的影響

沈 浩 劉 俊 敬微微 索永寬 常世杰 沙憲政#*

1(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)公共基礎(chǔ)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程教研室，沈陽(yáng) 110122)2(廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院，福建 廈門 361000)3(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，沈陽(yáng) 110001)

引言

由于異物反應(yīng)(如早期的急慢性炎癥反應(yīng)、纖維化的產(chǎn)生和血管的退化以及鈣化組織的形成等)的存在，造成植入式葡萄糖傳感器電極附近氧的供應(yīng)和葡萄糖傳質(zhì)的降低，使得傳感器于植入短期后在功能上產(chǎn)生明顯的下降，如靈敏度的降低、響應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)、輸出的不穩(wěn)定性等，無(wú)法達(dá)到長(zhǎng)期、實(shí)時(shí)、準(zhǔn)確、連續(xù)地檢測(cè)血糖的目的，最終設(shè)備失去應(yīng)用價(jià)值[1-2]。這就需要利用外膜材料對(duì)傳感器進(jìn)行保護(hù)，以提高其在體內(nèi)的性能，延長(zhǎng)使用壽命。天然高分子和合成高分子材料已經(jīng)廣泛應(yīng)用于傳感器外膜(如殼聚糖，聚氨酯等)，是傳感器制作封裝不可缺少的材料?？山到獠牧蠚ぞ厶鞘且环N應(yīng)用較為廣泛的天然高分子材料，是甲殼質(zhì)的脫乙酰衍生物，無(wú)毒，具有良好的生物相容性，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，如緩釋材料、手術(shù)縫線等[3-5]。殼聚糖生物相容性較好[6]，而且殼聚糖可以制備成多孔的形式，有利于葡萄糖和氧氣等分子到設(shè)備的傳遞，但其仍會(huì)產(chǎn)生較強(qiáng)的炎癥反應(yīng)、纖維化，需要進(jìn)一步改善。通常人們會(huì)探索新的材料，或者在良好材料的基礎(chǔ)上進(jìn)行修飾，通過(guò)制備復(fù)合材料、增加緩釋系統(tǒng)等來(lái)達(dá)到提高生物相容性的目的[7-11]，但這些方法在材料的制備方面具有成本高、耗時(shí)長(zhǎng)、工藝復(fù)雜等缺點(diǎn)，在應(yīng)用的過(guò)程中難以得到廣泛推廣。

基底膜是細(xì)胞外基質(zhì)的特化結(jié)構(gòu)形式，存在于多種組織之中。在室溫條件下，基底膜基質(zhì)能夠形成具有生物學(xué)活性的細(xì)胞外基質(zhì)，在一定程度上模擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)、組成、物理特性和功能，有利于細(xì)胞的凝集、黏附、鋪展和遷移，并能促進(jìn)干細(xì)胞分化，在組織工程修復(fù)研究中具有巨大潛力[12-14]。戴云等在前期的研究中發(fā)現(xiàn)，基底膜基質(zhì)能夠定向誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨方向分化[15]。Ulrike Klueh等在葡萄糖傳感器涂上一層基于基底膜基質(zhì)的生物水凝膠，形成了具有良好生物相容性的外膜[16]。但是，目前很少有將基質(zhì)膠與天然材料結(jié)合共同應(yīng)用于傳感器等設(shè)備外膜的研究。

本研究選取基質(zhì)膠Matrigel作為研究對(duì)象，在殼聚糖良好的生物相容性基礎(chǔ)上，通過(guò)大鼠模型探討了基質(zhì)膠對(duì)膜材料生物相容性的影響。Matrigel是由BD公司從富含胞外基質(zhì)蛋白的EHS小鼠腫瘤中提取出基底膜基質(zhì)膠，其主要成分有Ⅳ型膠原、層粘連蛋白、硫酸肝素糖蛋白、巢蛋白，還包含生長(zhǎng)因子(TGF-beta、EGF、IGF、FGF)和基質(zhì)金屬蛋白酶等。在體內(nèi)，這些細(xì)胞外基質(zhì)成分形成特殊的三維結(jié)構(gòu)。除了支持細(xì)胞外，還能在細(xì)胞層和它們毗鄰的基質(zhì)層間形成一個(gè)界面，在傷口愈合以及組織重生領(lǐng)域起到重要的作用。在體外，Matrigel在25℃下能夠形成一種特殊的凝膠，還具有生物學(xué)活性。模擬體內(nèi)細(xì)胞基底膜的結(jié)構(gòu)、組成物理特性和功能，可用于形態(tài)、生物功能遷移侵襲和基因表達(dá)等的研究。利用基質(zhì)膠Matrigel的上述特性，結(jié)合殼聚糖的無(wú)毒可降解、生物相容性良好等特性，為進(jìn)一步探究植入式傳感器設(shè)備外膜保護(hù)材料奠定了一定的基礎(chǔ)，使其能更好地應(yīng)用于體內(nèi)。

1 方法

隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，自身對(duì)照動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，于2015年12月-2016年12月在中國(guó)醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程實(shí)驗(yàn)室、組織胚胎學(xué)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1)主要試劑：殼聚糖粉末(CS，脫乙酰度為92.5%，浙江金殼生物化學(xué)有限公司)，Matrigel(20 mg/mL，BD公司)，硅膠顆粒(200-300目，國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司)，NaOH粉末(北京化工廠，分析純)。

2)主要儀器：電子天平(METTLER TOLEDO EL104)，數(shù)字恒溫磁力攪拌器(85-2型，江蘇省金壇市友聯(lián)儀器研究所)，LEICA圖像采集系統(tǒng)(德國(guó)徠卡公司)，PH計(jì)(METTLER TOLEDO DELTA 320)。

3)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SD大鼠24只(雄性，體重200～300 g，鼠齡8周，中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(遼)-2013-0001；使用許可證號(hào)：SYXK(遼)2013-0007)。

1.2 實(shí)驗(yàn)過(guò)程

1)植入膜材料的制備：模板浸取法，硅膠作為致孔劑制備多孔殼聚糖膜，打孔器制成直徑約5 mm圓形膜片，置于75%酒精中，冰箱內(nèi)4℃保存；購(gòu)買的Matrigel基質(zhì)膠(蛋白質(zhì)濃度為20 mg/mL)，分裝后通過(guò)低糖培養(yǎng)液稀釋為10和15 mg/mL兩種濃度，利用移液槍使用不同的槍頭取3種濃度的基質(zhì)膠各100 μL，分別滴涂到制備好的3個(gè)多孔殼聚糖的一側(cè)表面上，干燥后取3種濃度的基質(zhì)膠另100 μL，分別滴涂到3個(gè)多孔殼聚糖的另一側(cè)表面干燥后準(zhǔn)備植入。全程使用無(wú)菌技術(shù)。

2)膜材料的皮下植入實(shí)驗(yàn)：SD大鼠24只，隨機(jī)分6組，每組4只。將制備好的PCSM、滴涂不同濃度基質(zhì)膠的PCSM(直徑約為5 mm)，以脊柱為對(duì)稱軸，沿兩側(cè)各植入兩個(gè)圓形膜。

3)膜材料植入后的組織形態(tài)學(xué)觀察：在膜材料植入鼠皮下組織的第7、14、28、42、56和70 d時(shí)，用過(guò)量戊巴比妥鈉注射液腹腔注射，將每組的4只SD大鼠安樂(lè)死，植入的膜材料與周圍組織一同取出，修成大概0.5 cm3的小塊，用甲醛固定24～36 h，標(biāo)準(zhǔn)的程序制作常規(guī)石蠟切片，切片厚度5 μm，HE(蘇木精-伊紅)染色。

1.3 觀察指標(biāo)

1)膜外炎性細(xì)胞面積比：利用IPP 6.0(Image-Pro Plus 6.0)軟件中的顏色分割和面積統(tǒng)計(jì)功能，觀察切片的蘇木精-伊紅染色在40倍鏡下的圖像照片，針對(duì)膜材料與皮膚和肌肉組織間藍(lán)染的細(xì)胞核進(jìn)行面積統(tǒng)計(jì)，計(jì)算統(tǒng)計(jì)的藍(lán)染細(xì)胞核面積占中間區(qū)域總面積的百分比，每張切片選取5個(gè)視野(能夠基本覆蓋整個(gè)切片圖像)，先將5個(gè)數(shù)值做平均，再將每個(gè)周組的4只大鼠的數(shù)據(jù)匯總后取平均值。

2)膜外纖維包膜厚度：應(yīng)用IPP軟件中的距離測(cè)定功能，對(duì)蘇木精-伊紅染色10倍鏡下圖像照片中膜材料到皮膚和肌肉組織間的纖維厚度進(jìn)行測(cè)定，在每張圖像照片近皮膚端和近肌肉端各隨機(jī)選取5個(gè)部位進(jìn)行距離測(cè)量并記錄(此處認(rèn)為5個(gè)大概覆蓋到膜長(zhǎng))，計(jì)算這5個(gè)值的平均值，待每個(gè)周組的4只大鼠的數(shù)據(jù)匯總后再取平均值。

3)膜外血管密度：通過(guò)IPP軟件統(tǒng)計(jì)膜材料周圍的微細(xì)血管的總面積，并計(jì)算其占膜材料到皮膚和肌肉組織間面積的百分比；通過(guò)目前國(guó)內(nèi)外判斷微血管的標(biāo)準(zhǔn)來(lái)確定膜材料周圍血管的位置，具有管腔、出現(xiàn)一個(gè)以上血管內(nèi)皮細(xì)胞、內(nèi)部含有1個(gè)以上紅細(xì)胞的區(qū)域。在蘇木精-伊紅染色圖像照片的40倍鏡下，隨機(jī)選取4～5個(gè)區(qū)域進(jìn)行血管密度的測(cè)定，然后計(jì)算這些數(shù)據(jù)的平均值，每個(gè)周組的4只大鼠的數(shù)據(jù)匯總后再取平均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 多孔殼聚糖膜周圍的組織形態(tài)學(xué)變化

初步觀察各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的蘇木精-伊紅染色圖片(本研究主要觀察7、14 d急性炎癥反應(yīng)期，28 d后的慢性炎癥反應(yīng)在此不做描述)?？梢钥吹?，材料植入后第7 d時(shí)，膜材料周圍有一些藍(lán)色細(xì)胞核聚集，膜內(nèi)也有少量的藍(lán)染細(xì)胞核，此時(shí)幾乎沒(méi)有多少組織進(jìn)入膜材料的空隙內(nèi)，圖1(a)所示為PCSM植入皮下組織7 d時(shí)的HE染色情況(100×)。圖1(b)為PCSM植入皮下組織14 d時(shí)的HE染色情況(100×)，膜外有大量的藍(lán)染細(xì)胞核聚集，膜內(nèi)也有一些的藍(lán)染細(xì)胞核，此時(shí)部分組織長(zhǎng)入材料的空隙中。如圖1(c)、(d)所示，滴涂濃度為10和15 mg/mL時(shí)，基質(zhì)膠的PCSM植入皮下組織14 d時(shí)HE染色情況(100×)，膜外的藍(lán)核聚集較多，說(shuō)明炎性細(xì)胞較多，核藍(lán)染顏色較深，反映炎性情況較強(qiáng)。第7和14 d時(shí)，其他組的形態(tài)學(xué)變化與以上描述相似。由于每個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)以及不同濃度下的圖片較多，不能全部列出，每個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)均隨機(jī)選取圖片進(jìn)行描述(下同)。

第28 d時(shí)，膜材料周圍開(kāi)始出現(xiàn)膠原纖維組織、一些炎性細(xì)胞堆積，形成了生物淤積，最終結(jié)果是產(chǎn)生了纖維包膜，此時(shí)，組織進(jìn)一步長(zhǎng)入到膜材料的空隙中，并且仍存在一定的炎癥反應(yīng)。圖2(a)為植入28 d、滴涂基質(zhì)膠濃度為15 mg/mL的PCSM，膜周圍此時(shí)形成纖維包膜，并存在一定量的炎性反應(yīng)。圖2(b)為植入42 d、滴涂基質(zhì)膠濃度為20 mg/mL的PCSM，此時(shí)膜材料周圍纖維包膜相比28 d時(shí)變得致密一些，膜內(nèi)部的空隙中大部分區(qū)域被組織所填充，炎性細(xì)胞的數(shù)量也有所減少，此時(shí)慢性炎性反應(yīng)較28 d時(shí)減輕。圖2(c)為植入56 d、滴涂基質(zhì)膠濃度為10 mg/mL的PCSM，纖維包膜進(jìn)一步變得致密。圖2(d)為植入70 d、滴涂基質(zhì)膠濃度為15 mg/mL的PCSM，此時(shí)膜材料周圍的纖維包膜厚度相比56 d時(shí)觀察變化不是十分明顯，開(kāi)始趨向穩(wěn)定，藍(lán)染的核也較少，說(shuō)明慢性炎癥正在減少。此時(shí)，組織幾乎填充了整個(gè)膜內(nèi)部的空隙。圖片均為HE染色，100×。

圖1 第7、14 d膜材料周圍組織形態(tài)學(xué)變化(HE染色，100×)。(a)滴涂基質(zhì)膠濃度15 mg/mL的PCSM 7 d時(shí)；(b)未滴涂基質(zhì)膠的PCSM 14 d時(shí)；(c)滴涂基質(zhì)膠濃度10 mg/mL的PCSM 14 d時(shí)；(d)滴涂基質(zhì)膠濃度15 mg/mL的PCSM 14 d時(shí)Fig.1 Histomorphology changes of membrane materials at day 7 and day 14 (HE staining, 100×). (a) PCSM with 15 mg/mL Matrigel at day 7; (b) PCSM without Matrigel at day 14; (c) PCSM with 10 mg/mL Matrigel at day 14; (d) PCSM with 15 mg/mL Matrigel at day 14

圖2 膜材料周圍纖維包膜情況(HE染色，100×;FC：纖維包膜)。(a)滴涂基質(zhì)膠濃度15 mg/mL的PCSM 28 d時(shí)；(b)滴涂基質(zhì)膠濃度20 mg/mL的PCSM 42 d時(shí)；(c)滴涂基質(zhì)膠濃度10 mg/mL的PCSM 56 d時(shí)；(d)滴涂基質(zhì)膠濃度15 mg/mL的PCSM 70 d時(shí)Fig.2 Fibrous capsule situation around the membrane materials (HE staining, 100×; FC：fibrous capsule). (a) PCSM with 15 mg/mL Matrigel at day 28; (b) PCSM with 20 mg/mL Matrigel at day 42; (c) PCSM with 10 mg/mL Matrigel at day 56; (d) PCSM with 15 mg/mL Matrigel at day 70

圖3(a)、(b)分別為第7、14 d時(shí)，滴涂濃度為10 mg/mL基質(zhì)膠的PCSM周圍血管的情況，此時(shí)膜材料周圍均生長(zhǎng)出一些血管，并伴有一些炎性細(xì)胞，可以看出14 d時(shí)炎癥反應(yīng)較為強(qiáng)烈；圖3(c)為第28 d時(shí)，單獨(dú)植入PCSM周圍血管的情況；圖3(d)、(e)分別為第42、56 d時(shí)，滴涂濃度為15 mg/mL基質(zhì)膠的PCSM周圍血管的情況；圖3(f)為第70 d時(shí)，滴涂濃度為20 mg/mL基質(zhì)膠的PCSM周圍血管的情況。圖片均為HE染色(400×)，黑色箭頭所指為血管。

由圖3可以看出，無(wú)論是單獨(dú)植入PCSM還是植入滴涂基質(zhì)膠的PCSM周圍，均會(huì)有一些血管存在，因不同情況、不同時(shí)間、血管的多少有所不同，但從染色的圖像上無(wú)法判斷血管密度的大小，以及不同濃度基質(zhì)膠是否對(duì)PCSM周圍血管密度有影響，但通過(guò)這些血管便可計(jì)算膜外血管密度(即血管面積百分比)，以此來(lái)判定血管密度的大小。

圖3 各組膜材料周圍血管情況(HE染色，400×)。(a)滴涂基質(zhì)膠濃度10 mg/mL的PCSM 7 d時(shí)；(b)滴涂基質(zhì)膠濃度10 mg/mL的PCSM 14 d時(shí)；(c)未滴涂基質(zhì)膠的PCSM 28 d時(shí)；(d)滴涂基質(zhì)膠濃度15 mg/mL的PCSM 42 d時(shí)；(e)滴涂基質(zhì)膠濃度15 mg/mL的PCSM 56 d時(shí)；(f)滴涂基質(zhì)膠濃度20 mg/mL的PCSM 70 d時(shí)Fig.3 The situation of blood vessels around the membrane materials (HE staining,400×). (a) PCSM with 10 mg/mL Matrigel at day 7; (b) PCSM with 10 mg/mL Matrigel at day 14; (c) PCSM without Matrigel at day 28; (d) PCSM with 15 mg/mL Matrigel at day 42. (e) PCSM with 15 mg/mL Matrigel at day 56; (b) PCSM with 20 mg/mL Matrigel at day 70

2.2 膜材料周圍炎癥細(xì)胞比的統(tǒng)計(jì)分析

針對(duì)第7、14 d的情況，應(yīng)用IPP 6.0軟件，讀取蘇木精-伊紅染色切片的40倍鏡下照片統(tǒng)計(jì)膜外炎性細(xì)胞面積比，根據(jù)表1數(shù)據(jù)繪制柱狀圖，如圖4所示。7 d時(shí)，各組膜材料周圍炎性細(xì)胞面積比大約在7%左右，而且相差不大；14 d時(shí)，各組這一數(shù)值均有所增加，達(dá)到9%左右。滴涂基質(zhì)膠后，膜外炎性細(xì)胞面積比要高于未滴涂時(shí)的情況，通過(guò)單因素方差分析，變化差異不具有顯著性(P<0.05)。整體上，14 d時(shí)的炎癥反應(yīng)要強(qiáng)于7 d時(shí)的炎癥反應(yīng)，不同基質(zhì)膠濃度組間差異不明顯。

表1 膜材料周圍炎性細(xì)胞面積比

2.3 膜外纖維包膜厚度的統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用IPP軟件中的測(cè)距功能，測(cè)量28、42、56、70 d組植入皮下組織的膜材料周圍形成的纖維包膜厚度，統(tǒng)計(jì)取平均值，整理如表2、3所示。

通過(guò)對(duì)數(shù)據(jù)的直觀情況來(lái)看，纖維包膜厚度無(wú)論是近皮膚端還是近肌肉端均呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)，纖維包膜變得致密并趨向于穩(wěn)定。對(duì)不同時(shí)間組纖維包膜厚度數(shù)據(jù)繪制柱狀圖，如圖5所示，(a)～(d)分別為第28、42、56、70 d組膜材料周圍纖維包膜厚度柱形圖，厚度單位為μm。從柱形圖的變化趨勢(shì)可以看出，每個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)上，滴涂基質(zhì)膠組均降低了PCSM周圍的纖維包膜厚度，使其變得更加致密；但不同濃度基質(zhì)膠降低的幅度不同，其中20 mg/mL時(shí)降低的幅值最大，其效果最為顯著。從表2、3以及柱狀圖可以清晰地看到，近皮膚端數(shù)據(jù)與近肌肉端數(shù)據(jù)相近，滴涂不同濃度基質(zhì)膠的PCSM周圍纖維包膜厚度均有所降低，不同濃度降低的幅度不同，基質(zhì)膠濃度為20 mg/mL時(shí)較為明顯。利用單因素方差分析、結(jié)合Bonferroni法進(jìn)行兩兩比較后，第42、56、70 d時(shí)，對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組中滴涂基質(zhì)膠濃度為20 mg/mL的多孔殼聚糖膜組差異具有顯著性意義，膜材料靠近皮膚端數(shù)據(jù)兩兩組比較的P值分別為0.01、0.035、0.024，靠近肌肉端數(shù)據(jù)P值分別為0.036、0.047、0.210，其他各組之間兩兩比較后的差異不顯著(P>0.05)，說(shuō)明基質(zhì)膠濃度為20 mg/mL時(shí)能有效降低膜材料周圍的纖維包膜厚度。從另一個(gè)角度分析，滴涂不同濃度基質(zhì)膠的PCSM周圍纖維包膜厚度隨時(shí)間變化的曲線如圖6所示，其中(a)為近皮膚端數(shù)據(jù)，(b)為近肌肉端數(shù)據(jù)；不同濃度基質(zhì)膠隨時(shí)間均呈下降趨勢(shì)，15和20 mg/mL組下降較為明顯，尤其是20 mg/mL時(shí)。

圖4 7、14 d滴涂不同濃度基質(zhì)膠的PCSM周圍炎性細(xì)胞面積比(橫軸C表示基質(zhì)膠濃度,C0、C10、C15、C20分別表示基質(zhì)膠濃度為0、10、15、20 mg/mL，縱軸A表示炎性細(xì)胞面積比)Fig.4 Inflammatory cell area ratio around PCSM coated with different concentrations Matrigel at day 7 and day 14(C0, C10, C15, and C20 represent the matrigel concentration on the PCSM, they are 0, 10, 15, 20 mg/mL, respectively)

表2 植入膜材料周圍纖維包膜厚度(近皮膚端)

表3 植入膜材料周圍纖維包膜厚度(近肌肉端)

圖5 膜材料周圍纖維包膜厚度柱狀圖。(a)28 d；(b)42d；(c)56 d；(d)70 dFig.5 Histogram of fibrous capsule thickness around the implanted membrane materials.(a)28 d；(b)42 d；(c)56 d；(d)70 d

2.4 膜外血管密度的統(tǒng)計(jì)分析

利用IPP 6.0軟件，對(duì)膜材料周圍血管密度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，分別統(tǒng)計(jì)了4～5個(gè)視野下和8～10個(gè)視野下各周組膜外的血管密度，整理數(shù)據(jù)如表4所示。比較視野數(shù)量是否對(duì)膜外血管密度有影響，從數(shù)據(jù)觀察可知，兩種視野數(shù)下統(tǒng)計(jì)的膜外血管密度之間的差異不明顯。比較各時(shí)間點(diǎn)下滴涂不同濃度基質(zhì)膠的PCSM周圍血管密度值可以看到，除了PCSM組在7、14 d 時(shí)血管增生較為明顯、數(shù)值較大，其他組血管密度大體上呈現(xiàn)隨時(shí)間增加而增大的趨勢(shì)，但血管密度相對(duì)較低，規(guī)律性不強(qiáng)。

圖6 滴涂不同濃度基質(zhì)膠的膜材料周圍纖維包膜厚度隨時(shí)間變化曲線(C0、C10、C15、C20代表滴涂到PCSM上的基質(zhì)膠濃度分別為0、10、15、20 mg/mL)。(a)近皮膚端；(b)近肌肉端Fig.6 Curve of the fibrous capsule thickness around the membrane coated with different concentrations of Matrigel (C0, C10, C15, and C20 represent the matrigel concentration on the PCSM, they are 0, 10, 15, 20 mg/mL, respectively) (a) Near the skin; (b) Near the muscle

3 討論

本研究在殼聚糖生物相容性良好的基礎(chǔ)上[17-18]，制備了多孔殼聚糖膜(PCSM)。在膜材料的表面滴涂基質(zhì)膠，旨在進(jìn)一步提高PCSM的生物相容性，更好地作為傳感器外層保護(hù)膜，更好地保護(hù)設(shè)備。多孔材料能夠降低纖維包膜厚度，顯著地改善葡萄糖傳感器周圍的炎癥反應(yīng)、纖維包膜等情況[19-21]，但PCSM尚不能滿足實(shí)際需求。

在實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)動(dòng)物模型探究了滴涂不同濃度基質(zhì)膠的PCSM的生物相容性。從形態(tài)學(xué)上觀察炎性反應(yīng)，雖然在第14 d時(shí)滴涂基質(zhì)膠的膜材料周圍的炎性反應(yīng)要強(qiáng)于未滴涂的情況，但從炎性細(xì)胞面積的百分比數(shù)據(jù)上觀察整體的差異性不明顯，方差分析結(jié)果表明差異不具有顯著性，說(shuō)明基質(zhì)膠對(duì)炎性反應(yīng)的影響不是很大。纖維包膜厚度數(shù)據(jù)在相同的時(shí)間點(diǎn)，整體為滴涂不同濃度基質(zhì)膠的PCSM周圍包膜厚度要低于單獨(dú)植入的PCSM包膜厚度，說(shuō)明基質(zhì)膠能夠降低PCSM周圍形成纖維包膜的厚度，而且隨著時(shí)間推移，各組纖維包膜厚度降低的幅值是不相同的?；|(zhì)膠濃度為20 mg/mL時(shí)，幅值降低的最大，說(shuō)明基質(zhì)膠能有效地減少纖維包膜厚度，但此時(shí)并不代表基質(zhì)膠濃度為20 mg/mL時(shí)就是最佳濃度，本研究只選取了3種濃度，分別為10、15和20 mg/mL，其中20 mg/mL為購(gòu)買時(shí)的最大濃度。由于濃度的跨度相對(duì)較大，濃度范圍有限，并不能確定一個(gè)最佳濃度值，只能說(shuō)基質(zhì)膠降低了膜材料周圍形成纖維包膜的厚度，且3種濃度中20 mg/mL最為有效，所以濃度的問(wèn)題還需進(jìn)一步探究。由膜材料周圍血管面積的百分比數(shù)據(jù)可知，血管生長(zhǎng)情況各組間的變化規(guī)律不顯著，第7 d單獨(dú)植入PCSM周圍的血管密度要大一些，而滴涂基質(zhì)膠組數(shù)據(jù)要小一些，第14、42、56、70 d數(shù)據(jù)大體呈現(xiàn)增長(zhǎng)的趨勢(shì)，也存在個(gè)別數(shù)據(jù)差別較大。在血管新生的調(diào)控機(jī)制上，近年來(lái)提出了血管新生因子平衡學(xué)說(shuō)，正常情況下血管新生的誘導(dǎo)因子與抑制因子處于平衡狀態(tài)，一旦此平衡被打破就會(huì)激活血管系統(tǒng)發(fā)芽長(zhǎng)出新生血管。血管新生誘導(dǎo)因子有多肽類(如VEGF、bFGF、TGF-β等)[22-24]、未定性因子(如肝素)等，基質(zhì)膠中含有一些多肽類物質(zhì)(如TGF-β)，但卻沒(méi)有明顯促進(jìn)血管增長(zhǎng)，分析的原因主要有兩點(diǎn)：一是Matrigel基質(zhì)膠中這些血管新生誘導(dǎo)因子的含量具有不確定性；二是也可能由于基質(zhì)膠植入后一段時(shí)間的降解，一些活性物質(zhì)失活而失去了其作用。另外，研究中沒(méi)有分析植入位置對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組數(shù)據(jù)結(jié)果的影響，希望今后能加以補(bǔ)充。

此外，對(duì)指標(biāo)的評(píng)價(jià)也可能受到實(shí)驗(yàn)條件的限制。本實(shí)驗(yàn)主要是利用組織形態(tài)學(xué)方法，結(jié)合IPP圖像分析軟件對(duì)指標(biāo)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，使用SPSS對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，相對(duì)來(lái)說(shuō)是從宏觀的角度進(jìn)行了分析，統(tǒng)計(jì)的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組數(shù)據(jù)需要進(jìn)一步完善和改進(jìn)。Arturo J Vegas[25]等在較新的一項(xiàng)研究中，利用合成的復(fù)合物TMTD(triazole-thiomorpholine dioxide)修飾的藻酸鹽微球體作為外膜保護(hù)材料，保護(hù)能產(chǎn)生胰島素的SC-β細(xì)胞，產(chǎn)生胰島素降低血糖，并且探討了TMTD修飾的藻酸鹽微球體的生物相容性，從微觀的細(xì)胞學(xué)角度進(jìn)行了分析，在植入部位的組織及材料處提取細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀分離出巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等；通過(guò)免疫熒光染色技術(shù)，對(duì)細(xì)胞沉積(DAPI染細(xì)胞核和纖維蛋白)和肌成纖維細(xì)胞(染α-平滑肌蛋白)進(jìn)行了染色處理，結(jié)果表明在材料上有較低的細(xì)胞沉積水平，而在蛋白提取物的蛋白質(zhì)組分析中也進(jìn)一步表明，材料能夠減少纖維化反應(yīng)。因此，探究新的材料或者新的復(fù)合方法時(shí)，需評(píng)價(jià)其生物相容性，為了使評(píng)價(jià)結(jié)果更加準(zhǔn)確，應(yīng)結(jié)合組織形態(tài)學(xué)方法、統(tǒng)計(jì)學(xué)法以及微觀細(xì)胞學(xué)等方法，從多方面、多角度進(jìn)行評(píng)價(jià)。

4 結(jié)論

通過(guò)大鼠模型、結(jié)合形態(tài)學(xué)和統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，探究了基質(zhì)膠與多孔殼聚糖膜相結(jié)合后的生物相容性。對(duì)多孔殼聚糖膜滴涂不同濃度的基質(zhì)膠，將其植入動(dòng)物皮下組織后，在炎性反應(yīng)、形成纖維包膜厚度以及血管密度等方面進(jìn)行了分析，表明基質(zhì)膠能有效地降低形成的纖維包膜厚度，在一定程度上提高血管密度，促進(jìn)血管的生成。整體來(lái)看，基質(zhì)膠可在一定程度上提高PCSM的生物相容性，進(jìn)一步提高膜材料的性能。未來(lái)應(yīng)對(duì)基質(zhì)膠結(jié)合多孔殼聚糖膜的生物相容性，在基質(zhì)膠濃度和膜材料植入部位進(jìn)行探究，探索是否存在一個(gè)最佳濃度以及植入部位對(duì)其相容性的影響，并結(jié)合一些蛋白質(zhì)(如纖維蛋白)含量的測(cè)定，從而更好地對(duì)材料進(jìn)行評(píng)價(jià)，為更好地應(yīng)用到體內(nèi)奠定基礎(chǔ)。

(致謝：感謝中國(guó)醫(yī)科大學(xué)組胚教研室翟效月老師在組織切片過(guò)程中提供的幫助)