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    兒童耐藥肺炎支原體DNA拷貝量與臨床預后相關(guān)性分析

    2020-03-10 08:07:36朱美君
    臨床肺科雜志 2020年3期
    關(guān)鍵詞:大環(huán)內(nèi)酯拷貝阿奇

    朱美君

    肺炎是常見的兒童疾病之一,患兒主要出現(xiàn)發(fā)熱、干咳、咳痰等臨床癥狀[1]。近年來支原體肺炎的發(fā)病率逐漸升高,發(fā)病急、病情重。臨床上肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae,MP)引起的呼吸系統(tǒng)疾病不易與其他病原體區(qū)分,為臨床診治帶來一定挑戰(zhàn)。MP無細胞壁,對糖肽類、β-內(nèi)酰胺類藥物具有天然抗性,目前對于MP的治療主要采用紅霉素、克拉霉素、羅紅霉素、阿奇霉素等,但由于近年來大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的濫用,MP菌株對大環(huán)內(nèi)酯類藥物出現(xiàn)明顯的耐藥性[2]。MP臨床分離培養(yǎng)較為困難,目前關(guān)于MP的耐藥性機制尚不完全清楚。研究報道,耐藥MP引起患兒治療時間及臨床癥狀持續(xù)時間延長,耐藥MP與患兒的臨床預后具有一定的相關(guān)性[3]。但關(guān)于耐藥MP-DNA拷貝量是否與臨床預后相關(guān)則未見報道,本文通過檢測耐藥MP-DNA拷貝量,分析其與臨床預后的相關(guān)性。

    資料與方法

    一、一般資料

    2017年12月至2018年12月于本院兒科就診的合并發(fā)熱或(和)咳嗽,且1年內(nèi)反復MP感染且不規(guī)律應用大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物≥2次的110例患兒納入研究組?;純褐心?6例,女44例,年齡1~8歲,平均(6.30±1.24)歲。納入標準:①年齡1~8歲,患者入院前未進行抗生素、免疫抑制劑等治療;②患兒肺部有濕啰音或哮鳴音;③患兒依從性好,家屬知情同意;④本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準。排除標準:①患有免疫缺陷性疾病患兒;②患有肺結(jié)核或者哮喘等呼吸系統(tǒng)疾病者;③阿奇霉素過敏或者有嚴重反應不良患兒;④伴有先天性疾病患兒。

    二、方法

    1 MP培養(yǎng)及藥敏試驗 用無菌棉拭子在患兒咽喉部捻轉(zhuǎn)數(shù)次采集咽拭子標本,把被檢測的棉拭子置于含有快速MP培養(yǎng)基的分離培養(yǎng)瓶中,37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。陽性判斷:MP繁殖過程中分解糖類,形成 H+,引起培養(yǎng)基的pH值降低,指示劑顏色由紅色變?yōu)辄S色;陰性:培養(yǎng)基顏色變渾濁或者保持不變。本次藥敏試驗共檢測5種抗菌藥物(紅霉素、羅紅霉素、阿奇霉素、克拉霉素、加替沙星),根據(jù)藥物濃度由高到低,于體外對MP抑制抗菌藥物作用進行病原體耐藥性分析。

    實驗步驟:取1支分裝的阿奇霉素干粉培養(yǎng)基,加入1.5 mL無菌水溶解;在藥敏陰性孔中加入50 uL培養(yǎng)基,將采集的MP標本咽拭子在培養(yǎng)基中攪動數(shù)次,取50 uL含有MP標本的培養(yǎng)液加入藥敏板,置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。藥敏試驗判定標準[4]:MP培養(yǎng)基上C孔為澄清藍色,則為MP陽性(+);C孔培養(yǎng)基不變,則為MP陰性(-)。藥物敏感:A、B孔MP均為陰性(-);重度敏感:A孔MP為陰性(-)、B孔MP為陽性(+);耐藥:A孔MP為陽性(+)、B孔MP為陽性(+)。重度敏感按照敏感進行處理。

    2 療效判定標準 依據(jù)國家衛(wèi)生計生委辦公廳、國家中醫(yī)藥管理局辦公室、解放軍總后勤部衛(wèi)生部藥品器材局發(fā)布的《抗菌藥物臨床應用指導原則(2015年版)》[5]將治療效果分為無效、進展、顯效、痊愈4級。有效率=(顯效例數(shù)+痊愈例數(shù))/總例數(shù)×100%。

    3 熒光定量PCR 采用高溫消毒的吸痰器于患兒咽部吸取痰液1~3 mL置于無菌試管中;4倍體積4%的NaOH室溫消化30min,取1 mL至離心管中,加入濃縮液100 uL,12000r/min離心5min,棄上清,沉淀中加入50 uL核酸釋放劑;加50 uL DNA提取液于MP-DNA檢測管中,于ABI7500 Real Time 熒光定量PCR儀中檢測MP-DNA載量,依據(jù)試劑盒說明書分析檢測結(jié)果。

    4 血清炎癥因子的檢測 采集患兒入院第二天清晨空腹血液,分離血清,IL-6、PCT采用ELISA法測定,hs-CRP采用免疫比濁法測定,BECKMAN CUNLTER GENS 全自動無分類血細胞分析儀檢測白細胞總數(shù)、丹麥全自動血沉儀檢測血沉。

    三、統(tǒng)計學分析

    結(jié) 果

    一、肺炎支原體陽性率、藥敏試驗及測序結(jié)果

    經(jīng)過檢測顯示,110例研究組中MP陽性感染患兒42例,陽性率38.18%。42例紅霉素、羅紅霉素、阿奇霉素、克拉霉素、加替沙星的敏感性及耐藥性分析(見表1)。42例MP陽性中27例阿奇霉素敏感,15例耐藥。阿奇霉素耐藥15例患兒中,1年內(nèi)阿奇霉素不規(guī)律使用2次的有2例,3次的有4例,4次的有9例,隨著不規(guī)律用藥次數(shù)的增加,耐藥比例顯著增加(P<0.05)(見表2)。

    表1 42例MP陽性感染患兒的耐藥性分析 [n(%)]

    表2 1年內(nèi)不規(guī)律阿奇霉素用藥次數(shù)及耐藥率分析 [n(%)]

    二、治療效果及預后恢復情況的比較

    根據(jù)MP耐藥情況將患兒分為耐藥組(27例)和敏感組(15例),其中耐藥組治療2周后治愈率為59.26%(17/27);4周后治愈率為77.78%(21/27);敏感組治療2周后治愈率為100%(15/15);耐藥組發(fā)熱時間、住院時間均高于敏感組(P<0.05)(見表3)。

    表3 治療效果比較

    三、各組MP-DNA拷貝量的比較

    兩組MP-DNA拷貝量比較顯示,耐藥組MP-DNA水平顯著高于敏感組,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(見表4)。

    表4 MP-DNA拷貝量比較

    四、各組炎癥因子的比較

    各組炎癥因子比較顯示,耐藥組血清hs-CRP、IL-6水平顯著高于敏感組,白細胞總數(shù)、PCT、血沉與敏感組比較無顯著差異(P<0.05)(見表5)。

    表5 各組炎癥因子及恢復情況的比較

    五、Logistic回歸分析影響耐藥肺炎支原體感染患者預后的危險因素

    單因素分析發(fā)現(xiàn),MP-DNA、hs-CRP、IL-6是影響耐藥肺炎支原體感染患者預后的危險因子(P<0.05)。多因素分析發(fā)現(xiàn),MP-DNA、hs-CRP是影響耐藥肺炎支原體感染患者不良預后的獨立危險因素(P<0.05)(見表6)。

    表6 Logistic多因素回歸分析影響患者預后的危險因素

    討 論

    MP感染是臨床常見的兒童疾病之一,MP感染引起人肺A549上皮細胞黏蛋白表達增加,引起患兒痰液黏稠,氣道內(nèi)黏液分泌物明顯增多、壅塞,常表現(xiàn)為大葉性肺炎[6]。MP感染除引起肺部癥狀外,還引起肺外多系統(tǒng)并發(fā)癥,包括胃腸道反應、過敏反應等,部分患兒甚至出現(xiàn)多器官功能障礙或衰竭[7]。MP因為缺乏細胞壁,天然耐藥頭孢類抗生素、青霉素,但對四環(huán)素類、喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯藥物敏感,兒童處于生長發(fā)育、骨骼形成階段,限制四環(huán)素類、喹諾酮類藥物在兒童中的應用,所以治療兒童MP常用大環(huán)內(nèi)酯類藥物[8]。阿奇霉素是大環(huán)內(nèi)酯類的一種,主要發(fā)揮抑菌、抗炎等作用,其組織滲透性較好,對肺部感染組織的治療較好,臨床常用阿奇霉素序貫法治療兒童MP[9]。目前數(shù)據(jù)顯示,我國兒童及成年患者中分離的MP菌株對大環(huán)內(nèi)酯類具有較高耐藥性,因此研究耐藥MP患兒對臨床治療及預后具有重要意義。

    趙熙婷等研究報道,阿奇霉素序貫法對耐藥性MP治療效果良好[10]。本研究中采用阿奇霉素序貫法治療2周后,多數(shù)患兒痊愈,與上述報道結(jié)果相似,提示阿奇霉素序貫法治療可用于兒童MP感染。王亞坤等研究報道,耐藥MP患兒的治療時間及病程均有所延長[11]。劉會彩等研究報道,大環(huán)內(nèi)酯類治療耐藥MP退熱時間較敏感株延長,總發(fā)熱時間較敏感株也延長[12]。本研究顯示,耐藥組治愈率低于敏感組,耐藥組治療時間和退熱時間均顯著高于敏感組,提示耐藥MP可對治療效果及臨床預后具有一定影響,與上述研究結(jié)果一致。

    MP通過免疫學機制產(chǎn)生致病作用,MP感染機體后引起抗原抗體結(jié)合,激活補體,產(chǎn)生中性粒細胞趨化因子,大量白細胞聚集在病變部位,引起組織增生或者破壞性病變[13]。CRP是典型的急性期時相蛋白,是介導炎癥反應的重要炎癥因子,并且通過與炎癥損傷細胞暴露的磷脂結(jié)合啟動免疫應答[14]。PCT是甲狀腺分泌的降鈣素前體物質(zhì),機體正常狀態(tài)下只存在少量,但當機體感染時PCT水平則會顯著升高[15]。研究顯示PCT與細菌感染程度呈正相關(guān)。IL-6是MP反應中的重要炎癥因子,在細胞免疫和體液免疫中發(fā)揮重要作用,研究顯示,IL-6在炎癥反應早期異常增高,誘導T細胞分化,促進炎癥因子的分泌,IL-6水平可能與MP感染的嚴重程度和臨床預后相關(guān)[16]。本研究中耐藥組患兒血清hs-CRP、IL-6水平顯著高于對照組,白細胞數(shù)、PCT也高于對照組,與上述研究結(jié)果一致,炎性因子水平的升高可能與耐藥MP表面的基因型變化,免疫損傷和炎癥反應持續(xù)時間延長相關(guān)。

    MP-DNA拷貝量客觀反映了MP與宿主免疫清除能力之間的平衡。研究報道,MP核糖體23S r RNA V區(qū)2063位基因型的改變,引起敏感株的增殖受到抑制,而耐藥株的增殖不受抑制,進而引起感染患者MP-DNA拷貝量的差異;且MP核糖體23S r RNA V區(qū)2063位基因型改變引起抗生素與核糖體親和力改變[4]。本研究中耐藥菌組患兒MP-DNA拷貝量顯著高于敏感組,且耐藥株2周治愈率低于敏感組,治療時間高于敏感組,這可能與敏感組MP增殖力減弱、抗生素親和力降低有關(guān)。COX多因素回歸分析顯示,MP-DNA、hs-CRP是影響耐藥肺炎支原體感染患者不良預后的獨立危險因素,提示可根據(jù)患者MP-DNA拷貝量、hs-CRP水平采取合適的治療方法進一步改善患者預后情況。

    綜上所述,耐藥組患兒MP-DNA拷貝量高于敏感組MP-DNA拷貝量,且是影響臨床預后的獨立危險因素之一。但關(guān)于耐藥MP-DNA拷貝量與臨床預后的具體作用機制有待進一步研究。

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