影響多糖含量測定的不同因素的探究

凌紅妹 朱雁青

摘 要：本文研究了在多糖測定中，不同影響因子與多糖測定準(zhǔn)確度的關(guān)系。采用添加不同的單糖，氨基酸以及金屬離子，測定其對(duì)苯酚硫酸法測定結(jié)果的影響。研究結(jié)果表明：木糖、 果糖會(huì)導(dǎo)致多糖含量測定結(jié)果顯著升高;選擇吸光值在 0.8-1.2 范圍內(nèi)的樣品濃度下進(jìn)行測定，可以顯著減小雜多糖測定結(jié)果的偏差。待測多糖溶液中含有脯氨酸會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)溶液的吸光值升高，而多糖溶液中含有蘇氨酸、丙氨酸、賴氨酸、纈氨酸等會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)溶液的吸光值降低。鐵離子、亞鐵離子、鎂離子和鋅離子均對(duì)反應(yīng)液的吸光值有一定提升作用，使測定結(jié)果偏高?？紤]到食品中金屬離子的含量較低，故可以認(rèn)為，在食用多糖的含量測定中金屬離子的影響較小。本實(shí)驗(yàn)對(duì)之后各種食品源的樣品中多糖測定提供一定的理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：多糖;單糖;氨基酸;金屬離子

中圖分類號(hào)：TS201.23 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1671-2064（2019）06-0231-03

多糖（Polysaccharide）指由糖苷鍵結(jié)合的糖鏈，是組成生物高分子家族中的一個(gè)成員[1]。多糖是由10個(gè)或者10個(gè)以上的單糖分子組合而形成的聚合糖高分子碳水化合物，可分為均一性多糖和不均一性多糖（雜多糖）。大自然中天然存在的雜多糖物質(zhì)通常由兩種或兩種以上不同種類的單糖組成，且絕大部分都與脂類或蛋白質(zhì)結(jié)合，形成組分、結(jié)構(gòu)復(fù)雜，分子量大小不一的糖脂和糖蛋白等。

在關(guān)于多糖物質(zhì)的實(shí)驗(yàn)室研究和工業(yè)生產(chǎn)過程中，通常要求對(duì)其含量進(jìn)行測定、調(diào)整、監(jiān)控，但是由于自然界中的多糖物質(zhì)的種類繁多，各種組成單糖的比例以及存在形式亦存在不同，因此，對(duì)于不同的原料不能盲目地采取同一種方法處理，根據(jù)不同原料特性來采取適當(dāng)?shù)亩嗵欠治龇椒ㄊ种匾Ｄ壳俺Ｓ玫姆椒ㄊ潜椒?硫酸法[2]、蒽酮-硫酸法[2-3]和3、5-二硝基水楊酸法（DNS法）[4]。

近年來，常用的多糖含量測定方法就是苯酚-硫酸法，具有成本低廉、操作簡單、耗時(shí)較短、效果顯著、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，單糖、寡糖和均一多糖的含量都可以選擇此法。該方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線均是使用葡萄糖作為基準(zhǔn)品進(jìn)行繪制，即假定所要測量原料的多糖為均一性多糖。但實(shí)際上，許多中草藥和食品中的多糖組成復(fù)雜，大部分是雜多糖，即包括兩種或兩種以上的單糖分子，如巖藻糖、木糖、甘露糖等。不同的單糖的顯色能力不同，測定結(jié)果也會(huì)有差別。楊勇杰等[5]研究發(fā)現(xiàn)，不同的單糖標(biāo)準(zhǔn)溶液在相同濃度、相同波長下測得的吸收值相差較大，分別以其作為標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)雜多糖測定的結(jié)果有較大的差異。在銀耳多糖含量的測定中，對(duì)于同一批次的多糖提取液，假如選擇顯色能力最強(qiáng)的葡萄糖作為基準(zhǔn)物，那么得到的數(shù)值就會(huì)比真實(shí)值略低一些;如果選擇顯色能力最差的巖藻糖作為基準(zhǔn)物，那么測量的數(shù)值就會(huì)大大超出了真實(shí)值。因此，對(duì)于雜多糖中不同單糖含量對(duì)苯酚-硫酸法測定結(jié)果的影響，需要進(jìn)一步研究。中草藥中不僅含有豐富的植物多糖，而且還具有相當(dāng)一部分的蛋白質(zhì)和游離的氨基酸分子。另外，在整個(gè)多糖的獲取和測定過程中，由于原料特性、提取方法、操作水平等條件的不同，得到的產(chǎn)物單糖組成也不一樣，可能含有一些難以去除的雜質(zhì)成分，比如蛋白質(zhì)、色素、無機(jī)鹽及小分子物質(zhì)等。湯文杰[6]等在16種常用中草藥常規(guī)營養(yǎng)成分、常量和微量元素及氨基酸的含量測定中發(fā)現(xiàn)，黃芪、豬苓和油菜籽中氨基酸的成分顯著高于其他14種中草藥，且富含天冬氨酸和谷氨酸;豬苓、熟地黃、絞股藍(lán)中銅和鐵的成分明顯要多一些，而油菜籽、絞股藍(lán)和白術(shù)中鋅的成分稍高。經(jīng)典硫酸-苯酚法測定多糖含量未考慮金屬離子和游離氨基酸對(duì)測定結(jié)果的影響，其測定結(jié)果可能存在一定偏差。因此，為了能夠進(jìn)一步提高中草藥多糖含量測量的準(zhǔn)確性，闡明影響硫酸-苯酚法測定結(jié)果準(zhǔn)確性的關(guān)鍵影響因子，要求我們對(duì)不同氨基酸和金屬離子對(duì)測量結(jié)果的影響進(jìn)行實(shí)驗(yàn)和討論。

本文系統(tǒng)的研究并比較常用對(duì)照品葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、果糖、木糖等顯色反應(yīng)后吸收曲線的穩(wěn)定性，闡明雜多糖多糖組成對(duì)其測定結(jié)果的影響。定量研究中草藥原料中常見游離氨基酸、金屬離子對(duì)多糖含量測定結(jié)果的影響，進(jìn)一步闡明多糖含量測定的關(guān)鍵影響因子。

1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

葡萄糖，果糖，木糖，鼠李糖，半乳糖購買于天津博迪化工股份有限公司，硫酸，苯酚分別購買于廣州永大化學(xué)試劑有限公司，蘇氨酸，脯氨酸，丙氨酸，天冬氨酸，賴氨酸，纈氨酸，異亮氨酸，亮氨酸等購買于上海源聚生物科技有限公司，大豆肽購買于鄭州優(yōu)然化工產(chǎn)品有限公司，氯化鐵，氯化亞鐵，硫酸鋅，硫酸鎂，硫酸銅購買于天津大茂化學(xué)試劑廠。

電子分析天平（型號(hào)：Sartorius BP211D 分析天平，廠家：中科院廣州化學(xué)研究所），分光光度計(jì)（型號(hào)：UV-2100紫外可見分光光度計(jì)，廠家：尤尼柯（上海）儀器有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

采用苯酚-硫酸法測定樣品中多糖的含量。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：將葡萄糖粉末置于105℃的烘箱中，干燥3h，準(zhǔn)確稱取干燥至恒重的葡萄糖25mg于潔凈干燥的250ml容量瓶，加水至刻度線并搖勻，配成0.1mg/ml的葡萄糖對(duì)照品溶液，在4℃冰箱中冷藏保存，備用。分別精密量取0.1mg/ml的葡萄糖對(duì)照品溶液0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2ml于10ml具塞試管中，依次添加水使其最終體積為2.0ml，各加入6%的苯酚溶液1.0ml，振搖混勻，加入5.0ml濃硫酸，迅速振搖混勻，于室溫放置20min后測定490nm處吸光度。以葡萄糖溶液的濃度（μg/ml）為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2 具有不同單糖組成的多糖含量測定

分別將干燥至恒重的果糖、木糖按照10%、20%、30%的比例取代葡萄糖，準(zhǔn)確稱取25mg于250ml容量瓶中，加水至刻度線并搖勻，配成0.1mg/ml的雜多糖溶液，并按照苯酚-硫酸法測定吸光值，樣品的吸光值應(yīng)該在標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍之內(nèi)。

2.3 具有不同種類的氨基酸的多糖含量測定

配制不同濃度梯度的氨基酸溶液和60μg/ml的葡萄糖溶液：分別精確稱取0.5，1.0，2.5，5.0，10.0，25.0mg氨基酸于250ml容量瓶中，加水定容至刻度線，配制成2μg/ml，4μg/ml，10μg/ml，20μg/ml，40μg/ml，100μg/ml的氨基酸溶液。準(zhǔn)確稱取葡萄糖15mg于250ml容量瓶中，加水至刻度線并搖勻，配成60μg/ml的葡萄糖溶液。

分別加入1ml的60μg/ml的葡萄糖溶液和1ml氨基酸溶液，混勻之后，加入1ml的6%的苯酚溶液，以及5ml的濃硫酸，震蕩混勻，靜置20分鐘，在490nm的波長下測吸光度值，樣品的吸光值應(yīng)該在標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍之內(nèi)。

2.4 具有不同種類金屬離子的多糖含量測定

配制不同濃度的金屬離子溶液和60μg/ml的葡萄糖溶液：分別配制10ppm，20ppm，40ppm，60ppm，80ppm的金屬離子溶液和60μg/ml的葡萄糖溶液。分別加入1ml的60μg/ml的葡萄糖溶液和1ml金屬離子溶液，混勻之后，加入1ml的6%的苯酚，以及5ml的濃硫酸，震蕩混勻，靜置20分鐘，在490nm的波長下測吸光度值，樣品的吸光值應(yīng)該在標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍之內(nèi)。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

3.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

利用上述方法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸分析，得到在多糖測定過程中，濃度-吸光度的回歸方程：y=0.015x-0.0284（0-60μg/ml），相關(guān)系數(shù)R2=0.999，表明方程的擬合度較好。

3.2 不同單糖對(duì)多糖測定的影響

0.1F、0.2F和0.3F分別表示用果糖取代10%、20%和30%的葡萄糖，0.1X、0.2X和0.3X分別表示用木糖取代10%、20%和30%的葡萄糖。由圖1可見，將不同比例的果糖或者木糖代替葡萄糖，測得的吸光度值均比葡萄糖高。果糖含量不同導(dǎo)致的多糖含量增加值不一樣，其中0.2F的吸光值增加量最大，0.1F次之，0.3F再次之，對(duì)照組（純葡萄糖）的吸光值最低，而木糖則表現(xiàn)不同的影響，0.1X的吸光值最大，對(duì)照（純葡萄糖）的吸光值最低，0.2X次之，0.3X再次之，說明隨著木糖含量的增加，多糖測定結(jié)果趨近于對(duì)照組。

3.3 氨基酸按量對(duì)多糖含量測定影響

由圖2可見，不同氨基酸對(duì)硫酸-苯酚法測定多糖含量有明顯不同的影響，其中一些氨基酸使測定結(jié)果升高，視為提高組，如多糖溶液中含有0.04mg/ml的脯氨酸會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)溶液的吸光值顯著升高4.18%，導(dǎo)致測定值與實(shí)際值相比偏高。而一些氨基酸則使測定結(jié)果降低，視為降低組，如多糖溶液中含有0.04mg/ml的蘇氨酸、丙氨酸、賴氨酸和纈氨酸等氨基酸會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)溶液的吸光值降低22.7%、9.0%、46.3%、19.2%導(dǎo)致測定值與實(shí)際值相比偏低。若樣品中含有較多游離氨基酸，其測定值的準(zhǔn)確性將受到影響，波動(dòng)程度由氨基酸種類與濃度決定。

3.4 不同金屬離子對(duì)多糖測定的影響

由圖3可見，鐵離子、亞鐵離子、鎂離子和鋅離子的存在均對(duì)反應(yīng)液的吸光值有一定提升作用。10mg/ml的鐵離子、亞鐵離子、鋅離子和鎂離子分別使反應(yīng)液的吸光值提高2.42%、4.94%、2.58%和1.57%;而80mg/ml的鐵離子、亞鐵離子、鎂離子和鋅離子則可以分別使反應(yīng)液的吸光值顯著提高11.8%、9.6%、6.4%、13.2%。我國地域遼闊，東南部與西北部區(qū)域的土壤因?yàn)榈刭|(zhì)情況不同，無機(jī)物富集的情況有很大差異，土地中無機(jī)鹽在改變植物的生長及新陳代謝活動(dòng)的同時(shí)，也在其體內(nèi)積累、富集，改變其特殊化學(xué)物質(zhì)的正常積累過程。因此，在選擇中草藥及測量其多糖含量時(shí)，應(yīng)考慮金屬離子的影響。但考慮到食品及保健品中金屬離子的含量鮮有超過10ppm的，故可以認(rèn)為，在食用多糖的含量測定中，金屬離子的影響較小。

4 結(jié)語

雜多糖的單糖組成對(duì)雜多糖含量的測定結(jié)果有較顯著的影響。雜多糖中含有木糖、果糖會(huì)導(dǎo)致多糖含量測定結(jié)果偏高，其中雜多糖的單糖組成中含有10%木糖或含有10%果糖會(huì)導(dǎo)致測定多糖含量測定結(jié)果顯著偏高21.5%、26.2%。根據(jù)雜多糖組成對(duì)測定結(jié)果影響的規(guī)律可知，在測定雜多糖含量時(shí)，選擇吸光值在0.8-1.2范圍內(nèi)的稀釋倍數(shù)下進(jìn)行測定，可以顯著減小雜多糖測定結(jié)果的偏差。

待測多糖溶液中含有脯氨酸會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)溶液的吸光值升高，導(dǎo)致測定值與實(shí)際值相比偏高;而多糖溶液中含有蘇氨酸、丙氨酸、賴氨酸、纈氨酸等氨基酸會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)溶液的吸光值降低，導(dǎo)致測定值與實(shí)際值相比偏低。

常見金屬離子如鐵離子、亞鐵離子、鎂離子和鋅離子等，均對(duì)反應(yīng)液的吸光值有一定提升作用，使測定結(jié)果偏高?？紤]到食品中金屬離子的含量較低，故可以認(rèn)為，在食用多糖的含量測定中金屬離子的影響較小。

參考文獻(xiàn)

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