莞香靈芝與市售靈芝中總?cè)坪康膶?duì)比分析

戚怡， 呂思敏， 丁鴻燕， 李林科， 吳鐵，， 于豐彥

（1.廣東醫(yī)科大學(xué)，廣東東莞 523808；2.廣東醫(yī)科大學(xué)﹠廣東潤(rùn)和生物科技有限公司輔酶Q10聯(lián)合研究中心，廣東東莞 523808）

靈芝藥用在我國(guó)已有2 000多年的歷史，其藥用及保健價(jià)值一直備受青睞，銷量快速增長(zhǎng)，但由于野生靈芝資源稀缺，所以對(duì)人工栽培靈芝的需求越來越大。“莞香靈芝”是以瑞香科沉香屬植物沉香的木屑為栽培原料培養(yǎng)出的一種以靈芝總?cè)坪枯^高為特色的靈芝新品種（專利申請(qǐng)?zhí)枺?01610320833.5）。靈芝總?cè)剖窃陟`芝中發(fā)現(xiàn)的一類三萜類化合物，是靈芝的主要化學(xué)和藥效成分，具有抗腫瘤、保肝護(hù)肝、降低膽固醇、降血脂、降血糖、抗氧化延緩衰老、抗HIV等功效[1-3]。

為更好地開發(fā)和推廣莞香靈芝，本研究分別采用2015版《中華人民共和國(guó)藥典》（簡(jiǎn)稱《中國(guó)藥典》）及《安徽省地方標(biāo)準(zhǔn)》中的方法檢測(cè)靈芝總?cè)频暮?，?duì)7種隨機(jī)市售的靈芝及人工栽培的莞香靈芝進(jìn)行對(duì)照檢測(cè)與評(píng)價(jià)?！吨袊?guó)藥典》、《安徽省地方標(biāo)準(zhǔn)》均以紫外分光光度法測(cè)定總?cè)?，以香草醛—冰乙酸顯色，區(qū)別在于二者提取方法不同，但均有對(duì)應(yīng)的質(zhì)量評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料

1.1 儀器 FR223CN電子天平（奧豪斯儀器有限公司）；紫外—可見分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；水浴鍋（上海愛明儀器有限公司）；超聲波清理器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥與試劑 樣品G1～G7（見表1）為隨機(jī)市售不同來源地的靈芝子實(shí)體，均購自廣東化州市不同藥材批發(fā)部；樣品G8為實(shí)驗(yàn)室用莞香木栽培的靈芝子實(shí)體（莞香靈芝，專利申請(qǐng)?zhí)枺?01610320833.5）。齊墩果酸對(duì)照品（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：821882）；無水乙醇、氯仿、高氯酸均為分析純；5%香草醛—冰乙酸（現(xiàn)配現(xiàn)用）。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，樣品含量比較采用方差分析，莞香靈芝（G8）與市售靈芝（G1～G7）總?cè)坪勘容^采用LSD法。

表1 市售靈芝來源信息Table 1 The information of commercial Ganoderma scorces

2 方法與結(jié)果

2.1 按《中國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)靈芝總?cè)坪?/p>

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取齊墩果酸5mg，用甲醇溶解，超聲1 min促溶，用甲醇定容至25 mL量瓶中，4℃冰箱保存，作為對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 每種試藥分別取粉碎的靈芝子實(shí)體試樣平行2份，精密稱取樣品各2 g，置于100 mL錐形瓶中，加入50 mL的無水乙醇溶液，超聲處理（功率40%、頻率53 kHz）45 min；抽濾，濾液置于100 mL容量瓶中，用適量的無水乙醇溶液洗滌容量瓶和濾渣，洗液并入同一容量瓶中，加無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密量取上述對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，分別置于10 mL的EP管中，80～90℃水浴揮干，放冷；加入新配制的香草醛—冰醋酸溶液（精密稱取香草醛5 g加入10 mL的冰醋酸，并使它溶解）0.2 mL，高氯酸0.8 mL，搖勻。在70℃水浴中加熱15 min；立即水浴中冷卻5 min，取出，精密加入乙酸乙酯4 mL，搖勻，以相應(yīng)試劑為空白，在546 nm處測(cè)定吸光度[D（λ）]，以齊墩果酸含量（m/mg）為橫坐標(biāo)X，吸光度D（546 nm）為縱坐標(biāo)Y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。求得回歸方程為Y=8.530X-0.038，R2=0.997。靈芝總?cè)凭€性范圍為0.02～0.10 mg。標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 按《中國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)繪制的齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 1 Standard curve of oleanolic acid drawn following Chinese Pharmacopoeia standard

2.1.4 樣品的含量測(cè)定 取供試品適量，置于10mL的EP管中80～90℃水浴揮干，放冷；加入新配制的香草—醛冰醋酸溶液0.2 mL，高氯酸0.8 mL，搖勻，在70℃水浴中加熱15 min，立即水浴中冷卻5 min；取出，精密加入乙酸乙酯4 mL，搖勻。以相應(yīng)試劑為空白，在546 nm處測(cè)定吸光度[D（λ）]，平行2份，取平均吸光度D（546 nm）。通過線性回歸方程算得測(cè)定用的樣液中三萜類物質(zhì)的質(zhì)量。按公式計(jì)算各樣品總?cè)坪浚╳）：w（g/100 g）=（m2×V1）/（m1×V2×1 000）×100。其中：m2為回歸方程計(jì)算出的含量；m1為試樣的質(zhì)量；V1定容體積；V2使用樣液的體積。結(jié)果見表2。

表2 莞香靈芝與市售靈芝總?cè)坪繙y(cè)定結(jié)果（按《中國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定）Table 2 The determination results for the contents of total triterpenoids in Guanxiang Ganoderma and commercial Ganoderma according to Chinese Pharmacopoeia standard

2.2 按安徽省地方標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)靈芝總?cè)坪?/p>

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 齊墩果酸儲(chǔ)備液（0.1 mg/mL）：精密稱取95℃干燥2 h的對(duì)照品10.0 mg用無水乙醇溶解并定容至100 mL容量瓶，作為標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液（4℃保存）。

2.2.2 供試品溶液的制備 每種試藥分別取粉碎的靈芝子實(shí)體試樣1份，精密稱取樣品各1 g，準(zhǔn)確至0.1 mg。置于100 mL圓底燒瓶中，加入30 mL氯仿。（60±1）℃水浴回流2 h，減壓過濾，濾渣加入30 mL氯仿，再回流1 h，常壓過濾。合并濾液，40℃旋蒸至干。加入無水乙醇約40 mL，70℃水浴加熱，并搖動(dòng)至其完全溶解。冷卻至室溫后用無水乙醇定容至50 mL，等待測(cè)液。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20 mL置于10 mL EP管中，常壓水浴蒸干溶劑（98～100℃）。加入新配制的5%香草醛—冰乙酸溶液0.20 mL和高氯酸0.80 mL，搖勻。70℃水浴加熱15 min，取出，冰水冷卻5 min，用自來水浴調(diào)至室溫。用移液管準(zhǔn)確移取冰乙酸5.00 mL稀釋，搖勻。以試劑空白做參照，在30 min內(nèi)用紫外可見分光光度計(jì)在545 nm處測(cè)吸光度[D（λ）]值。以吸光度D（545 nm）為縱坐標(biāo)Y，以三萜含量（m/mg）為橫坐標(biāo)X，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出直線回歸方程并計(jì)算相關(guān)系數(shù)。求得回歸方程為Y=8.288X-0.040，R2=0.996。靈芝總?cè)凭€性范圍為0.01～0.12 mg。標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。

圖2 按安徽省地方標(biāo)準(zhǔn)繪制的齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 2 Standard curve of oleanolic acid drawn following Anhui local standard

2.2.4 樣品的含量測(cè)定 吸取待測(cè)液適量于25 mL具塞比色管中，常壓水浴蒸干溶劑（98～100℃）。加入新配制的5%香草醛—冰乙酸溶液0.20 mL和高氯酸0.80 mL，搖勻。70℃水浴加熱15 min，取出，冰水冷卻5 min，用自來水浴調(diào)至室溫。加冰乙酸5.00 mL稀釋，搖勻。以試劑空白做參照，在30 min內(nèi)用紫外可見分光光度計(jì)在545 nm處測(cè)吸光度[D（λ）]值。通過線性回歸方程算得測(cè)定用的樣液中三萜類物質(zhì)的質(zhì)量。按下面公式計(jì)算各樣品靈芝總?cè)坪浚╳）：w（g/100 g）=[m2/m1（1-w′）×（V2/V1）×1 000]×100。其中：m1為試樣的質(zhì)量，單位為g；m2為通過線性回歸方程算得的測(cè)定用樣液中三萜類物質(zhì)的質(zhì)量，單位為mg；V1為待測(cè)液定容的體積，單位為mL；V2為測(cè)定用的樣液體積，單位為mL；w′為試樣的含水量，單位為克每百克（g/100 g）。結(jié)果見表3。

表3 莞香靈芝與市售靈芝總?cè)坪繙y(cè)定結(jié)果（按安徽地方標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定）Table 3 The determination results for the contents of total triterpenoids in Guanxiang Ganoderma and commercial Ganoderma according to Anhui local standard

2.3 《中國(guó)藥典》方法檢測(cè)莞香靈芝與市售靈芝總?cè)坪康牟町愋詫?duì)比 由表4～6可看出，8種靈芝含量之間存在顯著性差異（P＜0.05），莞香靈芝平均含量顯著高于其他7種市售靈芝平均含量（P＜0.05），G1的平均含量顯著低于其他種靈芝的平均含量（P＜0.05）。

3 討論

靈芝為食藥兩用真菌，我國(guó)已將靈芝列入《中國(guó)藥典》范圍之內(nèi)，并可根據(jù)靈芝的實(shí)體中的主要活性成分和營(yíng)養(yǎng)成分高低對(duì)其進(jìn)行全面的功能評(píng)價(jià)[4]。靈芝中所含靈芝三萜具有顯著的藥理活性，《中國(guó)藥典》及地方標(biāo)準(zhǔn)中均以檢測(cè)總?cè)瞥煞肿鳛樵u(píng)價(jià)靈芝質(zhì)量中必不可少的重要指標(biāo)之一。安徽省是我國(guó)最重要的靈芝產(chǎn)區(qū)，其中宣城旌德縣及大別山是有名的靈芝培植基地，安徽省地方標(biāo)準(zhǔn)（DB34/T 485—2004）中建立的大別山靈芝的標(biāo)準(zhǔn)是國(guó)內(nèi)較早制定的地方標(biāo)準(zhǔn)，有重要行業(yè)代表的參考意義，其有機(jī)溶劑回流提取主要是運(yùn)用總?cè)迫苡谝恍┯袡C(jī)溶劑，使得總?cè)蒲b入到溶劑中而除去不溶性的雜質(zhì)。而《中國(guó)藥典》要求試品經(jīng)過超聲波提取，利用超聲波產(chǎn)生強(qiáng)烈震蕩、高速和在溶劑和樣品之間產(chǎn)生聲波空化作用，導(dǎo)致溶液內(nèi)氣泡的形成、增長(zhǎng)和爆破壓縮，破壞植物藥材的細(xì)胞，使溶劑能夠滲透到藥材細(xì)胞中，提高目標(biāo)物從固相轉(zhuǎn)移到液相的傳質(zhì)速率。本研究采用上述2種方法，以齊墩果酸為對(duì)照品，用紫外—可見分光光度法，對(duì)靈芝總?cè)坪窟M(jìn)行測(cè)定，測(cè)得莞香靈芝及市售靈芝中靈芝總?cè)坪?。按照《中?guó)藥典》方法檢測(cè)，靈芝總?cè)撇坏蒙儆?.50%，本研究測(cè)得長(zhǎng)白山、廣西、江西產(chǎn)靈芝，莞香靈芝均符合要求，莞香靈芝和市售靈芝（分別產(chǎn)自安徽、山東、河南、長(zhǎng)白山、廣西、廣東、江西等地）等8種靈芝含量之間存在顯著性差異（P＜0.05），莞香靈芝平均含量顯著高于其他7種市售靈芝平均含量（P＜0.05），安徽產(chǎn)靈芝子實(shí)體的平均含量顯著低于其他種靈芝的平均含量（P＜0.05）。按照安徽省地方標(biāo)準(zhǔn)方法檢測(cè)：靈芝總?cè)坪浚╳/%）≥1.2，本研究測(cè)得僅有莞香靈芝符合要求。本研究結(jié)果表明，莞香靈芝的靈芝總?cè)坪棵黠@高于市售其他品種的靈芝，并符合中國(guó)藥典及地方標(biāo)準(zhǔn)的要求。提示以莞香木為原料栽培的靈芝可能具有更好的藥理功效，在食用、保健及藥用研發(fā)時(shí)可以優(yōu)先選擇總?cè)坪扛叩妮赶沆`芝。

表4 莞香靈芝與市售靈芝總?cè)频暮縏able 4 Comparison of Guanxiang Ganoderma and commercial Ganoderma (±s)

表4 莞香靈芝與市售靈芝總?cè)频暮縏able 4 Comparison of Guanxiang Ganoderma and commercial Ganoderma (±s)

編號(hào)G1 G2 G3 G4 G5 G6 G7 G8份2 2 2 2 2 2 2 2靈芝總?cè)坪浚╳/%）0.354±0.049 0.455±0.031 0.370±0.030 0.600±0.008 0.727±0.006 0.370±0.022 0.523±0.070 0.937±0.091

表5 8種靈芝平均含量的差異性分析Table 5 Differentiation among average contents in 8 kinds of Ganoderma

表6 莞香靈芝與市售靈芝總?cè)坪繉?duì)比Table 6 Comparison of contents of total triterpenoids in Guanxiang Ganoderma and commercial Ganoderma

很多研究[5-7]表明，不同栽培條件、不同栽培方式、不同處理下培養(yǎng)的靈芝在重要成分的含量方面存在顯著差異。莞香，為瑞香科沉香屬木，是在我國(guó)樹木中唯一以“東莞”命名的樹木，歷來是東莞的特產(chǎn)，其老莖受傷后所積得的樹脂，俗稱沉香，可作香料原料，亦為治胃癌特效藥。為了得到更多的沉香，每年莞香農(nóng)都要對(duì)莞香木進(jìn)行鑿采，剔除下來的白木香下腳料可充分利用為莞香靈芝栽培原料。利用莞香木屑為原料培植出的靈芝中總?cè)坪枯^高，這可能與培養(yǎng)基質(zhì)中的莞香木的養(yǎng)分及活性成分遷移有關(guān)。

本研究測(cè)得莞香靈芝中總?cè)坪棵黠@高于市售的不同品種靈芝，符合《中國(guó)藥典》及地方標(biāo)準(zhǔn)的要求，為莞香靈芝的開發(fā)與利用提供了有意義的科學(xué)依據(jù)。