吐根堿對人臍靜脈內(nèi)皮細胞增殖、遷移、侵襲的影響及機制

李溪，朱曄，吳培潔，梁志偉，周迎春

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣州510405)

腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移與血管的生成密切相關(guān)[1]。一方面，新生血管為腫瘤組織提供生長所需的氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)；另一方面，新生血管為腫瘤的轉(zhuǎn)移提供通道[2]。血管生成過程主要包括內(nèi)皮細胞活化、增殖、遷移、成管[3]。因此，通過阻斷血管生成過程可能抑制腫瘤血管的形成，從而達到抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的效果。吐根堿是一種用于治療急性阿米巴病的臨床藥物，能抑制其蛋白質(zhì)的形成[4]。然而，目前尚無相關(guān)報道揭示吐根堿對腫瘤血管新生的抑制作用及潛在作用機理。2018年3～11月，我們利用人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)模擬腫瘤新生血管內(nèi)皮細胞，探討吐根堿對其增殖、遷移、侵襲和成管能力的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞與材料 HUVECs購于美國公司 ATCC 中心。吐根堿購于Sigam公司；DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清和胰蛋白酶購于美國Hyclone公司；Transwell小室和Matrigel購于美國Corning公司；細胞裂解液購于浙江碧云天公司；PBS緩沖液、BCA蛋白定量試劑盒購于北京賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司；青霉素、鏈霉、PVDF膜購于北京索萊寶科技有限公司；單克隆抗體購于Cell Signaling Technology公司；辣根過氧化物酶標記的二抗購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng)、分組及干預(yù)方法 HUVECs用DMEM完全培養(yǎng)液(10%胎牛血清、100 μg/mL青霉素和鏈霉素)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度37 ℃，CO2濃度5%。置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后換液，待細胞生長至貼壁狀態(tài)，細胞融合接近90% 時傳代。取對數(shù)生長期的細胞，隨機分為陰性對照組、吐根堿低濃度組、吐根堿中濃度組、吐根堿高濃度組。陰性對照組加入細胞培養(yǎng)基，吐根堿低、中、高濃度組分別加入終濃度為10、20、40 nmol/L的吐根堿。每組設(shè)3個復(fù)孔。

1.3 細胞增殖能力檢測 采用MTS法。取對數(shù)生長期的HUVECs，制備成細胞密度為0.3×105/mL的懸液，每孔100 μL接種于96孔板中，同時每組設(shè)3個復(fù)孔。各組干預(yù)72 h，每孔加入20 μL的CellTiter 96 AQueous One Solution，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，然后用全自動酶標儀在波長490 nm下檢測OD值，計算細胞相對存活率=(各濃度組OD值/陰性對照組OD值)×100%。

1.4 細胞遷移能力檢測 ①采用細胞劃痕實驗。取對數(shù)生長期的HUVECs，在預(yù)先用0.1%明膠包被的12孔板中每孔接種5 000個細胞。待細胞貼壁并長到90% 以上時，用滅菌的10 μL槍頭在孔中央劃十字交叉線。用PBS清洗劃掉的細胞。用不完全的DMEM饑餓細胞6 h之后棄掉培養(yǎng)基，陰性對照組中加不完全DMEM培養(yǎng)，低、中、高濃度藥物組在完全DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。置于培養(yǎng)箱中8 h后，用PBS洗兩次，加入2 μmol/L的calcein-AM處理細胞30 min，于倒置顯微鏡下觀察，計算細胞遷移率=(各濃度組細胞遷移數(shù)/陰性對照組細胞遷移數(shù))×100%。②采用Transwell小室遷移實驗。將Transwell小室置于0.1%明膠包被的24孔板中，在培養(yǎng)箱中放置30 min以上。制備濃度為5×105/mL的HUVECs懸液，取200 μL置于EP管中，加入低、中、高濃度的藥物并放在培養(yǎng)箱中處理1 h。將細胞懸液接種到小室內(nèi)，下層加入 600 μL完全DMEM培養(yǎng)基置于培養(yǎng)箱中 8 h， 4%多聚甲醛固定20 min，PBS洗3遍，最后用結(jié)晶紫染色30 min，倒置顯微鏡下拍照，計算細胞遷移率=(各濃度組細胞遷移數(shù)/陰性對照組細胞遷移數(shù))×100%。

1.5 HUVECs形成管腔數(shù)量檢測 采用細胞成管實驗。每孔加80 μL的Matrigel于48孔板中，放在細胞培養(yǎng)箱中30 min。制備細胞密度為5×105/mL的HUVECs懸液，取300 μL置于EP管中，加入低、中、高濃度的藥物后放在培養(yǎng)箱中1 h。待Matrigel凝固后，將預(yù)處理的細胞懸液接到Matrigel上，放在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h。加入2 μmol/L的calcein-AM處理細胞30 min，于倒置顯微鏡下觀察并拍照，計數(shù)形成的管腔數(shù)量(成管數(shù))。

1.6 NF-κB信號通路p65蛋白表達檢測 采用Western blotting法。用PBS洗兩遍HUVECs后，在每皿中分別加RIPA混合裂解液(含各種磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑)。4 ℃，10 000 r/min離心20 min，收集上清液，用BCA定量試劑盒測蛋白濃度，均冰上操作。蛋白加入上樣緩沖液，高溫變性后加樣，用10%分離膠和5%濃縮膠進行跑膠，轉(zhuǎn)膜、封閉 ，加入一抗，4 ℃孵育過夜，PBST洗3次，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔的IgG室溫下孵育1 h，PBST洗3次，用化學(xué)發(fā)光法曝光顯影，用Image J軟件進行NF-κB細胞信號通路p65和磷酸化p65蛋白灰度值分析。

2 結(jié)果

2.1 各組細胞增殖能力比較 陰性對照組細胞存活率為100%，吐根堿低、中、高濃度組細胞存活率分別為82.22%±0.32%、70.31%±0.58%、38.54%±0.46%，吐根堿低、中、高濃度組細胞存活率均低于對照組，且吐根堿中、高濃度組均低于吐根堿低濃度組，吐根堿高濃度組低于吐根堿中濃度組(P均<0.05)。

2.2 各組細胞遷移能力比較 劃痕實驗顯示，吐根堿低、中、高濃度組的細胞遷移率均低于陰性對照組，且吐根堿高濃度組低于低、中濃度組，中濃度組低于低濃度組(P均<0.05)。Transwell小室實驗顯示，吐根堿低、中、高濃度組細胞遷移率均低于陰性對照組，且吐根堿高濃度組低于低、中濃度組，中濃度組低于低濃度組(P均<0.05)。見表1。

表1 各組細胞遷移率比較

注：與陰性對照組比較，*P<0.05；與吐根堿低濃度組比較，﹟P<0.05；與吐根堿中濃度組比較，△P<0.05。

2.3 各組成管數(shù)比較 陰性對照組、吐根堿低、中、高濃度組成管數(shù)分別為(38±2)、(30±2)、(20±3)、(5±1)個，吐根堿低、中、高濃度組成管數(shù)均少于陰性對照組，且吐根堿高濃度組少于中、低濃度組，中濃度組少于低濃度組(P均<0.05)。

2.4 各組NF-κB p65及磷酸化p65蛋白表達比較 吐根堿低、中、高濃度組NF-κB磷酸化p65蛋白表達均低于陰性對照組，且吐根堿高濃度組低于低、中濃度組(P均<0.05)；低、中濃度組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。各組NF-κB p65蛋白表達差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

3 討論

惡性腫瘤作為一類嚴重危害人類健康的疾病，是全球疾病致死的重要原因之一，全世界每年約有500萬人死于惡性腫瘤。其中，肝癌的發(fā)病率占第五位，病死率占第三位[5]。肝癌的預(yù)后普遍較差，而且多數(shù)發(fā)生在術(shù)后2年，并伴隨新的腫瘤產(chǎn)生[6]。肝癌發(fā)生發(fā)展較快，容易侵襲或轉(zhuǎn)移，主要是依賴于血管的生成。因此，抑制腫瘤血管生成成為治療腫瘤的重要策略之一[7]。目前FDA批準用于治療肝癌惟一的靶向藥物是抗血管新生抑制劑索拉非尼，但其藥效并不令人滿意，且不良反應(yīng)大，如可引起嚴重的手足綜合征、腹瀉、皮疹等[8]，而且治療費用昂貴。因此亟需要尋找安全、有效的抗腫瘤血管生成藥物用于肝癌的治療。

表2 各組NF-κB p65及磷酸化p65蛋白表達 比較

注：與陰性對照組比較，*P<0.05；與吐根堿高濃度組比較，﹟P<0.05。

新藥的研發(fā)不僅耗費大量的人力和資金，而且新藥研發(fā)周期長。諾貝爾得主詹姆斯·布萊克也曾說，“最有成效的藥物研發(fā)是從老藥開始”。例如具有解熱鎮(zhèn)痛作用的阿司匹林，由于其具有抗血小板聚集作用，又被人們用于預(yù)防血栓的形成[9]。因此，我們著眼于挖掘上市藥物或臨床在研藥物的抗血管生成新用途。前期研究中，我們通過HUVECs細胞增殖實驗篩選了1 200個FDA批準的藥物，同時結(jié)合內(nèi)皮細胞分化和遷移功能實驗，初步發(fā)現(xiàn)了治療急性阿米巴病的藥物吐根堿具有潛在的抗血管新生功能。吐根堿是一種異喹啉型生物堿，存在于巴西產(chǎn)吐根的根中。臨床上長期被用做治療急性阿米巴病[4]。有研究發(fā)現(xiàn)，吐根堿可下調(diào)髓細胞白血病序列1重組蛋白(Mcl-1)蛋白從而引起腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體(TRIAL)介導(dǎo)的凋亡[10]。除此之外，蘇宏領(lǐng)等[11]研究發(fā)現(xiàn)，吐根堿可通過抑制PI3K-Akt信號通路活性，對腎癌具有顯著的抑制作用。然而，目前尚無相關(guān)報道揭示吐根堿對內(nèi)皮細胞的抑制作用及潛在作用機理。

在本研究中，我們評價了吐根堿對HUVECs多個功能的抑制效果，從而探討其可能的作用機制。本研究發(fā)現(xiàn)，吐根堿低、中、高濃度組細胞存活率均低于對照組，且吐根堿中、高濃度組均低于吐根堿低濃度組，吐根堿高濃度組低于吐根堿中濃度組，表明吐根堿能夠抑制HUVECs的增殖。基于以上結(jié)果，我們推測吐根堿的作用靶標可能是血管內(nèi)皮細胞。

內(nèi)皮細胞的遷移是血管生成中一個非常重要的過程，而腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移離不開血管新生。因此我們分別用劃痕實驗和Transwell遷移實驗檢測吐根堿對HUVECs遷移和侵襲的影響。本研究采用劃痕實驗及Transwell小室實驗均顯示，吐根堿低、中、高濃度組的細胞遷移率均低于陰性對照組，且吐根堿高濃度組低于低、中濃度組，中濃度組低于低濃度組，表明吐根堿能抑制HUVECs的侵襲和遷移，并且在一定范圍內(nèi)，吐根堿對內(nèi)皮細胞的抑制濃度呈梯度依賴性，隨著藥物濃度的提高，對遷移的抑制效果不斷增強。

血管生成是一個非常復(fù)雜的過程，內(nèi)皮細胞的管狀結(jié)構(gòu)的形成是其中的一個關(guān)鍵步驟。本研究采用體外小管形成實驗發(fā)現(xiàn)，吐根堿低、中、高濃度組成管數(shù)均少于陰性對照組，且吐根堿高濃度組少于中、低濃度組，中濃度組少于低濃度組，提示吐根堿能干擾HUVEC形成管腔結(jié)構(gòu)，從而阻礙腫瘤血管的生成，減少養(yǎng)分供給。

NF-κB信號通路是一條控制著很多生理活動的信號通路，參與細胞生長、分化、生存、凋亡、遷移、血管生成等眾多生理功能[12]。在NF-κB信號通路中，磷酸化的p65起著主要的調(diào)節(jié)作用[13]。NF-κB p65第536位絲氨酸位點磷酸化(磷酸化的p65 Ser536) 蛋白在胃癌中的表達降低，其表達與胃癌的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期有關(guān)，并且磷酸化的p65 Ser536可能抑制胃癌細胞的遷移與侵襲能力[14]。歐志濤等[15]認為，細胞因子誘導(dǎo)的凋亡抑制分子1 能促進HepG2細胞增殖，與磷酸化的 p65表達量增多有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，吐根堿低、中、高濃度組NF-κB磷酸化p65蛋白表達均低于陰性對照組，且吐根堿高濃度組低于低、中濃度組，提示吐根堿能夠下調(diào)NF-κB磷酸化p65的表達，從而抑制HUVECs的增殖、侵襲、遷移和形成管腔結(jié)構(gòu)。

綜上所述，吐根堿能抑制HUVECs的增殖、侵襲、遷移及形成管腔能力，其作用機制可能與下調(diào)NF-κB p65的磷酸化有關(guān)。