HO-3867對胃癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響及機(jī)制

曹亮，周艷，劉寒旸，耿翔，魏憶，陳帥，湯黎明

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州二院，江蘇常州213003)

胃癌是常見的惡性腫瘤之一，病死率在各種惡性腫瘤中排第三位[1]，嚴(yán)重威脅人類生命健康。胃癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸是個(gè)復(fù)雜、多基因、多因素參與的過程，其發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，越來越多的學(xué)者關(guān)注胃癌的治療和預(yù)后。干預(yù)胃癌的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和促進(jìn)其凋亡是胃癌治療的突破點(diǎn)。HO-3867是一種新型合成的二芳基烯基哌啶酮(DAP)化合物，是一種姜黃素類似物，也是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子3(STAT3)選擇性抑制劑。研究表明，HO-3867對多種腫瘤細(xì)胞具有抑制增殖、遷移、侵襲和促進(jìn)凋亡的作用，如卵巢癌[2]、子宮內(nèi)膜癌[3]、胰腺癌[4]等，具有良好的抗腫瘤特性。然而，目前尚未有HO-3867對人胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲作用的報(bào)道。2017年12月～2018年8月，我們通過體外培養(yǎng)胃癌細(xì)胞株MGC-803，觀察HO-3867對MGC-803細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響，并探討其作用機(jī)制，旨在為胃癌的治療提供更多的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 胃癌細(xì)胞株MGC-803購自上海中國科學(xué)院細(xì)胞庫。1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購自GIBCO公司；HO-3867購自MCE公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒 8(CCK-8)購自日本Dojndo公司；Transwell小室購自BD公司；抗第10號染色體同源缺失性磷酸酶-張力蛋白(PTEN)、p-PTEN、B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)抗體購自Cell Signaling Technology公司；抗GAPDH、基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)、MMP-9、B淋巴細(xì)胞瘤-2相關(guān)蛋白(Bax)抗體購自Abcam公司；辣根過氧化酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗、BCA蛋白濃度測定試劑盒、RIPA裂解液、PMSF、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 胃癌細(xì)胞株MGC-803在含10%FBS、1%青霉素(1×105U/L)和氯霉素(100 mg/L)的1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，至對數(shù)生長期，接種于10 cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱，孵育細(xì)胞，每天換一次培養(yǎng)基液，每兩天按3∶1傳代。

1.3 HO-3867劑量的確定 取對數(shù)生長期的細(xì)胞，以5×103/孔接種至96孔板，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，分別以1、2、4、6、8 μmol/L的HO-3867處理細(xì)胞，同時(shí)設(shè)置陰性對照孔(以等量血清培養(yǎng)基培養(yǎng))，培養(yǎng)24 h后每孔中加入10 μL CCK-8試劑，孵育1 h，用酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞增殖能力。發(fā)現(xiàn)HO-3867濃度為1 μmol/L時(shí)，對細(xì)胞增殖沒有明顯影響；HO-3867濃度為8 μmol/L時(shí)，則引起細(xì)胞死亡；濃度為2、4、6 μmol/L時(shí)，細(xì)胞存活并出現(xiàn)不同的抑制增殖反應(yīng)。因此選用2、4、6 μmol/L濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 分組方法 將細(xì)胞分為HO-3867低劑量組、HO-3867中劑量組、HO-3867高劑量組以及未給藥的空白對照組，根據(jù)檢測方法設(shè)立相應(yīng)的細(xì)胞濃度。

1.5 檢測指標(biāo)

1.5.1 細(xì)胞增殖能力 采用細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)。將對數(shù)生長期的各組細(xì)胞，以5×103/孔接種至96孔板，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。HO-3867低、中、高劑量組分別以2、4、6 μmol/L的HO-3867處理細(xì)胞，空白對照組以等量血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h 后每孔中加入CCK-8試劑10 μL，孵育1 h，用酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞活力值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5.2 細(xì)胞克隆形成能力 采用細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)。HO-3867低、中、高劑量組分別以2、4、6 μmol/L的HO-3867處理細(xì)胞24 h，空白對照組以等量血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。用胰酶消化后進(jìn)行計(jì)數(shù)，每個(gè)培養(yǎng)皿種入200個(gè)細(xì)胞，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)2周后，PBS清洗2次，甲醛固定，GIMSA染色后顯微鏡下拍照，觀察細(xì)胞克隆形成數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5.3 細(xì)胞遷移能力 采用細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)。將對數(shù)生長期的各組細(xì)胞，以2×105/孔接種至6孔板，HO-3867低、中、高劑量組分別以2、4、6 μmol/L的HO-3867處理細(xì)胞，空白對照組以等量血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。處理24 h后消化收集細(xì)胞，以5 000個(gè)/孔接種至Transwell小室內(nèi)，小室上側(cè)為無血清培養(yǎng)液，下側(cè)為含20%FBS的培養(yǎng)液，48 h后用0.1%結(jié)晶紫染色，用濕棉簽擦去未發(fā)生遷移的細(xì)胞，然后顯微鏡下觀察拍照，取5個(gè)高倍鏡視野，觀察遷移穿膜細(xì)胞數(shù)量。重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

1.5.4 細(xì)胞侵襲能力 采用細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)。用冷的無血清1640培養(yǎng)液與MatrigeITM膠以6∶1比例稀釋為凝膠，取100 μL加入Transwell小室中構(gòu)建細(xì)胞體外侵襲模型。將對數(shù)生長期的各組細(xì)胞以2×105/孔接種至6孔板，HO-3867低、中、高劑量組分別以2、4、6 μmol/L的HO-3867處理細(xì)胞，空白對照組以等量血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。消化收集各孔細(xì)胞，以2×105/孔接種至Transwell小室內(nèi)，小室上側(cè)為無血清培養(yǎng)液，下側(cè)為含20%FBS的培養(yǎng)液，48 h后用0.1%結(jié)晶紫染色，用濕棉簽擦去未發(fā)生侵襲的細(xì)胞，顯微鏡下觀察拍照，取5個(gè)高倍鏡視野，觀察侵襲穿膜細(xì)胞數(shù)量。重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

1.5.5 細(xì)胞凋亡情況 采用細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)。將對數(shù)生長期的各組細(xì)胞，以2×105/孔接種至6孔板，HO-3867低、中、高劑量組分別以2、4、6 μmol/L的HO-3867處理細(xì)胞24 h，空白對照組以等量血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。消化收集各孔細(xì)胞，按照說明書進(jìn)行AnnexinV及PI雙染色，上機(jī)檢測，觀察晚期凋亡(Q2)和早期凋亡(Q3)細(xì)胞的總凋亡數(shù)所占百分比計(jì)算總凋亡率。重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

1.5.6 抑癌基因PTEN蛋白表達(dá) 采用Western blotting法檢測抑癌基因PTEN蛋白的表達(dá)以及活化狀態(tài)的p-PTEN水平。按照蛋白提取步驟提取各組總蛋白，用BCA法測定總蛋白濃度，經(jīng)SDS-PAGE點(diǎn)用后轉(zhuǎn)移到NC膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBST洗滌后，分別加入1∶1 000抗PTEN、p-PTEN、GAPDH抗體，4 ℃孵育過夜，TBST洗滌后加入1∶5 000辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗，37 ℃孵育1 h，再用TBST洗滌，化學(xué)發(fā)光并曝光成像。

1.5.7 細(xì)胞遷移、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá) 采用Western blotting法檢測。提取總蛋白后，同上法檢測遷移相關(guān)蛋白MMP-9、MMP-2及凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax的表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞增殖能力比較 HO-3867低、中、高劑量組細(xì)胞活力值均低于空白對照組(P均<0.05)，且HO-3867劑量較高組的細(xì)胞活力值低于HO-3867劑量較低組(P均<0.05),見圖1。

注： *為P<0.001。

2.2 各組細(xì)胞克隆形成能力變化 空白對照組、HO-3867低劑量組、HO-3867中劑量組、HO-3867高劑量組細(xì)胞克隆形成數(shù)分別為(137.0±22.6)、(88.3±11.0)、(57±10.8)、(35.3±11.7)個(gè)，HO-3867低、中、高劑量組細(xì)胞克隆形成數(shù)均少于空白對照組(P均<0.05)，且HO-3867劑量較高組的細(xì)胞克隆形成數(shù)較少(P均<0.05)。見圖2。

注：A為空白對照組；B為HO-3867低劑量組；C為HO-3867中劑量組；D為HO-3867高劑量組。

2.3 各組細(xì)胞遷移、侵襲能力比較 HO-3867低、中、高劑量組侵襲、遷移穿膜細(xì)胞數(shù)均少于空白對照組(P均<0.05)，且HO-3867劑量較高組的侵襲、遷移穿膜細(xì)胞數(shù)少于HO-3867劑量較低組(P均<0.05)，見表1。

表1 各組細(xì)胞遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)比較(個(gè),

注：與空白對照組相比，*P<0.05；與HO-3867低劑量組比較，#P< 0.05；與HO-3867中劑量組比較，&P<0.05。

2.4 各組細(xì)胞凋亡情況比較 空白對照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組細(xì)胞的總凋亡率分別為1.43%±0.33%、4.55%±0.38%、5.64%±0.17%、8.56%±0.92%，HO-3867低、中、高劑量組總凋亡率均高于空白對照組(P均<0.05)，見圖3。

2.5 各組遷移及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)比較 HO-3867低、中、高劑量組MMP-2、MMP-9、Bcl-2 蛋白表達(dá)均低于空白對照組(P均<0.05)，且HO-3867劑量較高組MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)低于HO-3867劑量較低組(P均<0.05)。HO-3867低、中、高劑量組Bax蛋白表達(dá)均高于空白對照組(P均<0.05)，且HO-3867劑量較高組Bax蛋白表達(dá)高于HO-3867劑量較低組(P均<0.05)。見表2。

注：A為空白對照組；B為HO-3867低劑量組；C為HO-3867中劑量組；D為HO-3867高劑量組。

2.6 各組細(xì)胞PTEN、p-PTEN蛋白表達(dá)比較 HO-3867低、中、高劑量組PTEN、p-PTEN蛋白表達(dá)均高于空白對照組(P均<0.05)，且HO-3867劑量較高組PTEN、p-PTEN蛋白表達(dá)高于HO-3867劑量較低組(P均<0.05)。見表3。

表2 各組MMP-2、MMP-9、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)比較

注：與空白對照組相比，*P<0.05；與低劑量組比較，#P<0.05；與中劑量組比較，&P<0.05。

表3 各組PTEN、p-PTEN蛋白表達(dá)比較

注：與空白對照組相比，*P<0.05；與低劑量組比較，#P<0.05；與中劑量組比較，&P<0.05。

3 討論

胃癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一，而且其早期診斷率低、發(fā)現(xiàn)時(shí)多已發(fā)生淋巴及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，常常在患者就診時(shí)就已經(jīng)失去了根治性手術(shù)的機(jī)會，目前尚無對胃癌療效好、不良反應(yīng)小的治療藥物。HO-3867是二芳基哌啶酮(DAP)化合物，是姜黃素類似物的一種，是通過將哌啶酮連接到β-二酮結(jié)構(gòu)和取代苯基上的氟而得到的。HO-3867的化學(xué)設(shè)計(jì)包括添加兩個(gè)特定的基團(tuán)，一個(gè)氮氧基團(tuán)和一個(gè)羥胺基團(tuán)。這些基團(tuán)有助于化合物的活化，特別是在癌細(xì)胞富含氧化還原的環(huán)境中，使其成為還原的氮氧化合物[5]。研究表明，HO-3867能抑制卵巢癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，并選擇性地對癌細(xì)胞有毒性作用，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡[6～8]。Tierne等[3]研究表明，HO-3867可上調(diào)P53蛋白表達(dá)以及下調(diào)Bcl-2、Bcl-xL、Caspase-3、Caspase-7和多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞G2/M阻滯。另外，Hu等[4]研究發(fā)現(xiàn)，HO-3867能通過活性氧依賴性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡。然而，目前尚無HO-3867在胃癌中作用的報(bào)道。

增殖、凋亡、侵襲和遷移是惡性腫瘤細(xì)胞基本特征，與腫瘤發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，能否抑制胃癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移和誘導(dǎo)其凋亡，是HO-3867抗胃癌的關(guān)鍵。因此本研究用HO-3867處理胃癌細(xì)胞MGC-803后，觀察其增殖、凋亡、侵襲和遷移功能改變，探討HO-3867是否具有抗胃癌的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，HO-3867低、中、高劑量組細(xì)胞活力值均低于空白對照組，提示用HO-3867處理細(xì)胞后，MGC-803細(xì)胞增殖能力明顯降低；HO-3867低、中、高劑量組細(xì)胞克隆形成數(shù)少于空白對照組，提示HO-3867可明顯抑制胃癌細(xì)胞克隆形成能力；HO-3867低、中、高劑量組侵襲、遷移穿膜細(xì)胞數(shù)均少于空白對照組，提示HO-3867可明顯抑制胃癌細(xì)胞的侵襲、遷移能力；HO-3867低、中、高劑量組總凋亡率均高于空白對照組，提示HO-3867能明顯促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡，以上結(jié)果表明，HO-3867具有抑制胃癌細(xì)胞MGC-803增殖、侵襲和遷移并促進(jìn)其凋亡的能力。

胃癌的發(fā)生發(fā)展與腫瘤遷移和侵襲密切相關(guān)?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是蛋白水解酶中的一種，能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)，在腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移的過程中起著重要作用。MMP-2、MMP-9蛋白是MMPs家族中重要成員，在多種腫瘤中表達(dá)上調(diào)，參與腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移過程[9,10]。本研究發(fā)現(xiàn)，HO-3867低、中、高劑量組MMP-2、MMP-9、Bcl-2 蛋白表達(dá)均低于空白對照組，表明HO-3867抑制MGC-803細(xì)胞的侵襲和遷移能力可能是通過下調(diào)MMP-9、MMP-2蛋白表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。

凋亡是細(xì)胞自然死亡的過程，在腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為中起著重要的作用[11]。因此誘導(dǎo)胃癌凋亡是抗胃癌的重要途經(jīng)。Bcl-2和Bax是經(jīng)典的抑制凋亡和促進(jìn)凋亡基因，兩者構(gòu)成比是凋亡調(diào)控的關(guān)鍵因素。Bcl-2過表達(dá)與Bax形成異源二聚體抑制細(xì)胞凋亡，Bax過表達(dá)與Bcl-2 構(gòu)成同源二聚體促進(jìn)細(xì)胞凋亡[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，HO-3867低、中、高劑量組Bcl-2蛋白表達(dá)均低于空白對照組，Bax蛋白表達(dá)均高于空白對照組，提示HO-3867可促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡，推測HO-3867可能通過調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax蛋白水平來誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞MGC-803凋亡。

PTEN是張力蛋白同源磷酸酶基因，位于染色體10q23.31，能編碼具有磷脂和蛋白質(zhì)雙重磷脂酶活性的蛋白，即為PTEN蛋白[13]。PTEN在多種癌癥中表達(dá)缺失或低表達(dá)，是一個(gè)抑癌基因，被認(rèn)為與癌癥的進(jìn)展密切相關(guān)[14]。在多項(xiàng)研究結(jié)果顯示，PTEN對STAT3具有負(fù)性調(diào)節(jié)作用，抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[15,16]。而HO-3867是STAT3選擇性抑制劑，HO-3867是否能通過調(diào)節(jié)PTEN來調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞增殖、凋亡以及遷移和侵襲功能尚不明確。本研究發(fā)現(xiàn)，與空白對照組相比，HO-3867處理后的MGC-803細(xì)胞中PTEN、p-PTEN蛋白水平明顯上調(diào)，表明HO-3867可上調(diào)PTEN基因的表達(dá)并促進(jìn)PTEN磷酸化活化，可能是其抑制胃癌細(xì)胞MGC-803的增殖能力、遷移和侵襲，并誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一。

綜上所述，HO-3867能抑制胃癌細(xì)胞株MGC-3867的增殖、克隆形成、侵襲和遷移，并促進(jìn)其凋亡，其機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)PTEN、Bcl-2、Bax、MMP-2以及MMP-9等基因表達(dá)來發(fā)揮作用的，這可能為胃癌治療提供新的依據(jù)。但HO-3867對于胃癌的具體作用機(jī)制尚未完全明確，未來尚需要更深入的研究。