TAZ促進(jìn)胃癌中血管生成及相關(guān)機(jī)制的研究*

白婧如 趙秀蘭 孫冉 張丹芳 劉鐵菊 張艷輝 董學(xué)易 車娜 梁曉輝 程潤芬劉爽

胃癌是全球第五大常見癌癥，盡管隨著診斷與治療技術(shù)的不斷提高，胃癌的發(fā)病率有所下降，但其總體預(yù)后仍較差［1］。腫瘤的新生血管為腫瘤細(xì)胞提供豐富的營養(yǎng)，在腫瘤的生長、侵襲、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用［2］。內(nèi)皮依賴性血管是最為“經(jīng)典”的血管生成模式，很多信號(hào)分子參與其形成的調(diào)控，其中血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是較為明確的可以促進(jìn)其形成的調(diào)控因子，而VEGF的分泌又受到多種因子的調(diào)控［3-4］。

β-catenin是典型Wnt通路的效應(yīng)分子，廣泛存在于內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等，與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［5］。β-catenin通常定位于細(xì)胞膜，參與細(xì)胞骨架的形成。在腫瘤細(xì)胞中，β-catenin表現(xiàn)為膜表達(dá)的缺失，其細(xì)胞核的異位表達(dá)激活Wnt信號(hào)通路，從而入核與不同靶基因結(jié)合，在腫瘤中發(fā)揮不同作用［6］。多項(xiàng)研究表明，β-catenin在多種腫瘤中可以促進(jìn)VEGF的分泌，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤血管生成［7-9］。

TAZ，又稱為WWTR1（含有WW結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子1），作為Hippo信號(hào)通路的關(guān)鍵下游效應(yīng)分子，最初通過其與14-3-3蛋白質(zhì)相互作用而被發(fā)現(xiàn)［10］。近期研究表明，TAZ作為一種轉(zhuǎn)錄共激活劑，在多種腫瘤中高度表達(dá)，發(fā)揮著不同的致癌作用［11-12］。此外，越來越多研究發(fā)現(xiàn)TAZ在血管生成中發(fā)揮重要作用［13-14］。

目前，TAZ在胃癌中的作用機(jī)制尚未明確，關(guān)于TAZ與β-catenin在血管生成中作用的研究仍較少。本研究旨在通過分析探討TAZ在胃癌中的作用機(jī)制，為胃癌血管生成方面的研究提供新的見解。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織標(biāo)本 收集天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院和天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院2001年1月至2013年1月經(jīng)手術(shù)切除后送檢的胃癌標(biāo)本150例，所有患者術(shù)前均未接受放化療。

1.1.2 細(xì)胞株 人胃癌細(xì)胞系MGC803購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)研究所，MKN28購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，HUVEC細(xì)胞購自美國ATCC公司，293T細(xì)胞購自上海復(fù)旦大學(xué)中山附屬醫(yī)院。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 DMEM、RPMI-1640和Opti-MEM培養(yǎng)基均購自美國Neuronbc公司，胎牛血清（FBS）購自美國Gibco公司。慢病毒包裝試劑盒和質(zhì)粒均購自美國GeneCopoeia公司，TAZ過表達(dá)質(zhì)粒（EXZ0976-Lv201），TAZ過表達(dá)對照質(zhì)粒（EX-NEGLv201），TAZ降表達(dá)質(zhì)粒（HSH017916-LvRH1GP），TAZ降表達(dá)對照質(zhì)粒（CSHCTR001-1-LvRH1GP）均購自美國GeneCopoeia公司。Transwell小室購自美國FALCON公司，Matrigel膠購自美國Invitrogen公司。兔抗人TAZ抗體購自美國Abcam公司，兔抗人βcatenin抗體購自美國Abcam公司，鼠抗人CD34購自北京中山金橋生物技術(shù)有限公司，小鼠抗人GAPDH抗體購自美國Santa Cruz公司，二抗購自北京中山金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)法 石蠟包埋，切片，每片厚度5μm。切片經(jīng)二甲苯脫蠟，無水乙醇脫苯后，用3%甲醇過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶30 min，之后95%乙醇-80%乙醇-無水逐級(jí)脫水，EDTA 9.0抗原修復(fù)液微波修復(fù)，血清封閉于室溫20 min，滴加一抗TAZ（1：200）于4℃孵育過夜。次日用PBS液沖洗3次，滴加兔二抗孵育1 h后，DAB顯色15 min，水洗，蘇木復(fù)染細(xì)胞核，水洗，脫水透明，封片。

判定標(biāo)準(zhǔn)：采用Mattern積分法對免疫組織化學(xué)染色結(jié)果進(jìn)行評分，每個(gè)標(biāo)本在顯微鏡（×400）下，隨機(jī)選取10個(gè)視野，分別記錄標(biāo)本的陽性細(xì)胞百分比及染色強(qiáng)度。陽性細(xì)胞百分比判定規(guī)則如下：陽性細(xì)胞＜25%為0分，25%～50%為1分，51%～75%為2分，＞75%為3分。將染色強(qiáng)度按以下標(biāo)準(zhǔn)分為0～3級(jí)：無陽性著色為0，淺黃色為1級(jí)，黃色為2級(jí)，棕黃色為3級(jí)。最后通過染色強(qiáng)度與染色范圍的乘積確定最終得分，＜3為陰性，≥3為陽性。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) HUVEC、MGC803、293T及MKN28細(xì)胞培養(yǎng)：添加10%FBS、1%雙抗（100 U/mL青霉素，100 U/mL鏈霉素）的DMEM或RPMI-1640培養(yǎng)基。細(xì)胞均培養(yǎng)于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及建立穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系 常規(guī)方法培養(yǎng)293T細(xì)胞后，用含滅活血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2～3 d，根據(jù)慢病毒試劑說明書添加試劑與TAZ上下調(diào)質(zhì)粒，之后待293T細(xì)胞中觀察到熒光顆粒后，收集病毒液，并做標(biāo)記。將胃癌細(xì)胞傳代于6孔板中，用含滅活血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，然后按照轉(zhuǎn)染試劑說明書添加相應(yīng)試劑及病毒液，12 h后更換普通完全培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染48 h后用熒光倒置顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率，用嘌呤霉素進(jìn)行藥篩。

1.2.4 共培養(yǎng)及條件培養(yǎng)基的制備 HUVEC與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)需要采用條件培養(yǎng)基（conditioned medium CM）。用上述穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中饑餓培養(yǎng)24 h，然后用5%FBS培養(yǎng)基替代。取其上清液，1 000 r/min離心10 min去除細(xì)胞碎片，用0.22μm濾器過濾后即為條件培養(yǎng)基，于4℃保存。

1.2.5 Western blot法檢測 將細(xì)胞裂解后提取的蛋白等量上樣于10%聚丙烯酰胺分離凝膠中電泳，之后濕轉(zhuǎn)90 min于PVDF膜。用含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉1 h后，添加抗體TAZ（1：500），β-catenin（1：5 000），GAPDH（1：2 000），4℃孵育過夜。次日待恢復(fù)室溫后回收一抗，TBST洗膜3次，添加相應(yīng)二抗孵育1～2 h，洗膜3次后加發(fā)光液，避光顯影，拍照。應(yīng)用Image J軟件分析蛋白條帶。

1.2.6 Transwell遷移實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)用無血清培養(yǎng)基制備細(xì)胞懸液，并調(diào)整細(xì)胞密度至1×105個(gè)/mL。小室上層內(nèi)加入200μL細(xì)胞懸液，下層內(nèi)加入500μL含有血清的完全培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后用冷甲醇固定20 min，擦除上層細(xì)胞后用0.4%結(jié)晶紫染色，鏡檢，計(jì)數(shù)并統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

1.2.7 三維培養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)前將培養(yǎng)基與Matrigel膠1：1混合，添加40μL平鋪于96孔板，放置培養(yǎng)箱中過夜。次日，消化細(xì)胞并重懸至1×105個(gè)/mL，將細(xì)胞懸液以200μL/孔加入到96孔板內(nèi)，之后放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待顯微鏡觀察成管后拍照計(jì)數(shù)。

1.2.8 MTT實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)按照試劑盒說明書進(jìn)行，將培養(yǎng)好的96孔板于酶聯(lián)免疫檢測儀上，檢測每孔490 nm的吸光值（OD），記錄統(tǒng)計(jì)。

1.2.9 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA） 將轉(zhuǎn)染后的胃癌細(xì)胞及其相應(yīng)的對照組細(xì)胞提前無血清饑餓培養(yǎng)后，分別收集上清液，按照ELISA試劑盒說明書按步驟操作，設(shè)計(jì)3個(gè)復(fù)孔，最后加入終止液反應(yīng)30 min后，用酶標(biāo)儀讀取450 nm OD值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

上述實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料分析均采用t檢驗(yàn)法，應(yīng)用Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析，并用χ2檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)TAZ與臨床病理資料的關(guān)系。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TAZ在胃癌中的表達(dá)

用免疫組織化學(xué)法檢測TAZ、β-catenin在150例胃癌組織中的表達(dá)水平，結(jié)果顯示TAZ主要表達(dá)定位于腫瘤細(xì)胞胞核內(nèi)，β-catenin表達(dá)于細(xì)胞膜和細(xì)胞核中（圖1）。150例胃癌組織中TAZ陽性表達(dá)率為43%，βcatenin陽性表達(dá)率為54.7%。此外，在TAZ陽性組中βcatenin陽性表達(dá)率為67.2%，在TAZ的陰性組中βcatenin陽性表達(dá)率為32.8%，β-catenin在TAZ陽性組中表達(dá)明顯高于TAZ陰性組，TAZ的表達(dá)與β-catenin具有相關(guān)性，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）。

通過免疫組織化學(xué)法用CD34對內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，采用t檢驗(yàn)比較高表達(dá)TAZ組與低表達(dá)TAZ組微血管密度（microvessel density，MVD）計(jì)數(shù)。結(jié)果顯示，高表達(dá)TAZ組MVD數(shù)量明顯多于低表達(dá)TAZ組，TAZ的表達(dá)與MVD具有相關(guān)性（圖2，P＜0.05）。

分析TAZ與150例胃癌患者臨床病理資料的關(guān)系。結(jié)果顯示，TAZ的表達(dá)與年齡、性別和腫瘤直徑大小無關(guān)，而與腫瘤分級(jí)、TNM分期和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)相關(guān)（表2）。此外，Kaplan-Meier生存分析結(jié)果表明，TAZ表達(dá)陽性患者較TAZ陰性患者的生存時(shí)間相對較短，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.028，圖2）。

圖1 免疫組織化學(xué)法檢測人胃癌組織中TAZ與β-catenin表達(dá)情況（×200）

表1 TAZ與β-catenin的相關(guān)分析 例

表2 TAZ的表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系 例

2.2 TAZ促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞成管、增殖及遷移的能力

通過對共培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行三維培養(yǎng)，結(jié)果顯示，內(nèi)皮細(xì)胞與TAZ上調(diào)的MKN28細(xì)胞CM共培養(yǎng)后，成管能力較對照組明顯增強(qiáng)，相反，內(nèi)皮細(xì)胞與TAZ下調(diào)的MGC803細(xì)胞CM共培養(yǎng)后，成管能力較對照組明顯減弱。

Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TAZ下調(diào)組的內(nèi)皮細(xì)胞遷移數(shù)量少于對照組，而在TAZ上調(diào)組中，內(nèi)皮細(xì)胞遷移數(shù)量明顯較對照組增多，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖3）。

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4，TAZ上調(diào)組較TAZ下調(diào)組更有利于內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，TAZ上調(diào)后，內(nèi)皮細(xì)胞的增殖能力明顯增強(qiáng)，而下調(diào)腫瘤細(xì)胞中TAZ的表達(dá)，內(nèi)皮細(xì)胞的增殖能力減弱。

圖2 胃癌中TAZ與MVD的關(guān)系及生存分析圖

圖3 TAZ對內(nèi)皮細(xì)胞管道形成能力及遷移能力的影響

2.3 TAZ表達(dá)升高增強(qiáng)胃癌細(xì)胞中β-catenin的表達(dá)

細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示，在MKN28細(xì)胞系中，上調(diào)TAZ的表達(dá)，β-catenin的表達(dá)也隨之增強(qiáng)，而在MGC803細(xì)胞中，下調(diào)TAZ的表達(dá)，β-catenin的表達(dá)也降低。

Western blot結(jié)果與免疫熒光結(jié)果相一致，轉(zhuǎn)染TAZ過表達(dá)質(zhì)粒的MKN28細(xì)胞，與對照組相比，βcatenin的表達(dá)水平上升；轉(zhuǎn)染TAZ降表達(dá)質(zhì)粒的MGC803細(xì)胞，β-catenin的表達(dá)水平較對照組降低（圖5）。

2.4 TAZ表達(dá)升高促進(jìn)VEGF蛋白的表達(dá)

通過ELISA法檢測MKN28（過表達(dá)TAZ或?qū)φ眨┖蚆GC803（下調(diào)TAZ或下調(diào)對照）中VEGF蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，MKN28細(xì)胞中TAZ的過表達(dá)與對照組相比，VEGF表達(dá)增加，MGC803中TAZ下調(diào)明顯抑制了VEGF的表達(dá)（圖6）。

圖4 TAZ對內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力的影響；

圖5 免疫熒光與Western blot檢測TAZ與β-catenin的表達(dá)變化

圖6 ELISA法對各組腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)基中VEGF因子檢測情況；*：P＜0.05

3 討論

近年來，TAZ被發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中表達(dá)水平升高，如乳腺癌、肺癌、大腸癌和膠質(zhì)瘤等，通過多條信號(hào)通路途徑在不同的腫瘤中發(fā)揮著致癌作用。在Hippo通路激活后，TAZ被LATS1/2磷酸化，由此在細(xì)胞質(zhì)中保持靜止?fàn)顟B(tài)。相反，Hippo通路未激活或由多個(gè)內(nèi)在和細(xì)胞外信號(hào)抑制其作用時(shí)，導(dǎo)致TAZ的去磷酸化和核定位［10，12］。有研究表明，TAZ在乳腺癌中高表達(dá)，上調(diào)TAZ促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）、侵襲遷移及增殖等［15］。TAZ通過子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中GAB2的中間體，從而進(jìn)一步調(diào)節(jié)PI3K/AKT途徑［16］。此外，高表達(dá)TAZ被發(fā)現(xiàn)存在于非小細(xì)胞肺癌中，且與其分化程度差、預(yù)后差、生存期短有關(guān)［17］。本研究中發(fā)現(xiàn)TAZ在胃癌組織中高表達(dá)，且與腫瘤分級(jí)、轉(zhuǎn)移等相關(guān)。

大量研究表明，TAZ在調(diào)控血管生成中發(fā)揮重要作用［13］。在小鼠的視網(wǎng)膜中敲除YAP/TAZ基因，會(huì)導(dǎo)致小鼠視網(wǎng)膜血管發(fā)育缺陷［18］。YAP/TAZ還可以通過調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和重排，從而促進(jìn)新生血管的穩(wěn)定性［19］。在腫瘤中TAZ通過Hippo、Wnt和GPCR等信號(hào)通路對腫瘤的分化、轉(zhuǎn)移、生長和干細(xì)胞特性的維持發(fā)揮重要作用［20］。本研究通過免疫組織化學(xué)法用CD34對內(nèi)皮進(jìn)行標(biāo)記，進(jìn)行MVD計(jì)數(shù)。結(jié)果顯示，TAZ蛋白在胃癌中的表達(dá)與MVD相關(guān)，提示TAZ可能在胃癌血管生成中發(fā)揮作用。在共培養(yǎng)后進(jìn)行一系列細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮細(xì)胞與TAZ高表達(dá)的胃癌細(xì)胞共培養(yǎng)后，其成管、增殖和遷移能力得到促進(jìn)。免疫組織化學(xué)法檢測發(fā)現(xiàn)，在人體胃癌標(biāo)本中β-catenin表達(dá)與TAZ表達(dá)具有高度相關(guān)性。

多項(xiàng)研究表明，β-catenin為Wnt信號(hào)通路中的關(guān)鍵因子并參與基因的調(diào)控。TAZ在細(xì)胞質(zhì)中磷酸化狀態(tài)能抑制Wnt/β-catenin靶基因的表達(dá)，而核TAZ脫磷酸化可激活Wnt/β-catenin通路［21］。來自大腸桿菌的脂多糖通過Wnt/β-catenin誘導(dǎo)的TAZ升高刺激人牙周膜干細(xì)胞的成骨分化［22］。當(dāng)Wnt信號(hào)通路激活時(shí)，β-catenin向胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移，從而與T細(xì)胞因子（transcription factor，TCF）等結(jié)合發(fā)揮作用［5］?；罨摩?catenin易位至細(xì)胞核并與TCF復(fù)合以促進(jìn)VEGFA的轉(zhuǎn)錄，表明Wnt/βcatenin信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)節(jié)血管形成［8］。此外，有研究表明，在VEGF啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)現(xiàn)有TCF結(jié)合元件，進(jìn)一步表明β-catenin對VEGF的表達(dá)存在一定的調(diào)控作用［9］。VEGF主要通過與其受體特異性結(jié)合，促使內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，微血管新生，最終形成新的腫瘤血管網(wǎng)［23］。本研究通過Western blot法和免疫熒光檢測結(jié)果表明，TAZ的上調(diào)可以促進(jìn)胃癌細(xì)胞中β-catenin的表達(dá)，相反，降表達(dá)TAZ后，β-catenin表達(dá)隨之降低。此外，通過ELISA實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在胃癌細(xì)胞系中上調(diào)TAZ的表達(dá)促進(jìn)VEGF蛋白的表達(dá)。

綜合上述，TAZ在胃癌組織中高表達(dá)，且TAZ通過與β-catenin的相互作用，促進(jìn)VEGF的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移。本研究從人體組織標(biāo)本與體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)兩部分探討了TAZ在胃癌血管生成中的作用，證實(shí)了TAZ與β-catenin的相關(guān)性。此外，本研究對TAZ在胃癌發(fā)生發(fā)展中的調(diào)控作用進(jìn)行探究，為胃癌血管生成方面的研究提供新的思路與見解。但是腫瘤血管生成是一個(gè)綜合而復(fù)雜的過程，關(guān)于TAZ在胃癌中如何調(diào)控β-catenin的表達(dá)以及相關(guān)通路的相互作用亟需進(jìn)一步的研究。