SA-hIL-21修飾磁珠的合成及其生物學(xué)功能的研究

茹道平，高基民

(溫州醫(yī)科大學(xué) 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院&生命科學(xué)學(xué)院，浙江 溫州 325035)

癌癥已經(jīng)嚴(yán)重威脅到人類的健康.手術(shù)、化療以及放射療法等治療腫瘤的傳統(tǒng)方法在應(yīng)用上都有它們的局限性[1].近年來，隨著免疫學(xué)和基因工程的不斷發(fā)展，免疫治療癌癥的方法得到了國內(nèi)外學(xué)者的追捧[2].該方法在臨床治療上顯示出了特異性強(qiáng)、靶向性強(qiáng)和持續(xù)作用等優(yōu)點(diǎn)，從而被廣泛使用[3].過繼性免疫效應(yīng)細(xì)胞療法(adoptive cell transfer therapy)，是一種相對(duì)療效比較好、比較安全的腫瘤免疫療法.體外擴(kuò)增免疫細(xì)胞是過繼性免疫效應(yīng)細(xì)胞療法的一個(gè)重要環(huán)節(jié)[4].

免疫細(xì)胞的增殖、分化和功能受到包括白細(xì)胞介素家族在內(nèi)的一系列細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)[5].白細(xì)胞介素-21(interleukin-21, IL-21)是一種主要由活化的CD4+T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，在人體免疫系統(tǒng)抵御和消滅病毒感染細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞方面起著重要作用[6].IL-21能夠誘導(dǎo)腫瘤相關(guān)性抗原特異性細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞(CTL)轉(zhuǎn)變?yōu)橐环N穩(wěn)定的、非輔助細(xì)胞依賴性的細(xì)胞表型[7].IL-21也能使人外周血中自然殺傷細(xì)胞(NΚ)和 CD8+T細(xì)胞中穿孔素、顆粒酶B、干擾素-γ和趨化因子受體3的mRNA表達(dá)上調(diào)[8].IL-21可以通過維持和增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞應(yīng)答實(shí)現(xiàn)持久的腫瘤免疫反應(yīng)而發(fā)揮抗腫瘤作用[9].以往的研究表明，IL-21能夠有效促進(jìn)NΚ、CTL等多種淋巴細(xì)胞的分化和增殖[10].由于IL-21不會(huì)產(chǎn)生活化誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡(AICD)且能減少抗原特異性T細(xì)胞的程序性死亡，與IL-2、IL-15相比,IL-21能更有效持久地增強(qiáng)CTL的胞毒活性[11]和增加抗原特異性CD8+T細(xì)胞的數(shù)量[12].

IL-21與IL-21R/γc結(jié)合后主要通過JAKs-STATs通路發(fā)揮生物學(xué)功能[10].γc在IL-21R復(fù)合物中的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是必須的[13].依賴于細(xì)胞系的不同，IL-21R/γc可以激活不同的下游靶因子包括Jak1、Jak3、Stat1、Stat3、Stat4和Stat5[14].IL-21與IL-21受體的親和常數(shù)Kd為定值時(shí)，根據(jù)Kd=(CIL-21·CIL-21R)/CIL-21與IL-21R結(jié)合物公式，IL-21與IL-21受體的結(jié)合隨著IL-21濃度增高而增加.然而，提高細(xì)胞培養(yǎng)基IL-21的濃度，必然對(duì)培養(yǎng)基溶氧量、pH緩沖能力、滲透壓以及培養(yǎng)基中其他營養(yǎng)成分造成一定的影響.這些因素有可能限制了IL-21促進(jìn)其靶細(xì)胞增殖的效率.我們猜想： 如果能夠?qū)崿F(xiàn)在細(xì)胞表面較小空間范圍內(nèi)富集IL-21，而不是提高整個(gè)培養(yǎng)基溶液中IL-21的濃度，就可以突破上述因素的限制，從而可能找到一種更高效的體外擴(kuò)增免疫細(xì)胞方法.

鏈親和素(streptavidin, SA)是由Streptomycesavidinii菌分泌的一種非糖基化的蛋白質(zhì)，它由4條相同的肽鏈組成，分子量約為66kDa，其氨基酸組成中的丙氨酸和甘氨酸的含量較多，結(jié)合生物素的活性基團(tuán)是肽鏈中的色氨酸殘基.每個(gè)SA分子可以結(jié)合4個(gè)生物素(biotin)分子[15].生物素又稱為維生素H，是一種水溶性B族維生素.根據(jù)生物素與親和素之間高親合力牢固結(jié)合的原理[16]，我們嘗試將SA-IL-21融合蛋白錨定到已生物素化的磁珠上，得到SA-IL-21修飾磁珠，從而探索一種實(shí)現(xiàn)在細(xì)胞表面較小空間范圍內(nèi)富集IL-21的方法.

外周血淋巴細(xì)胞(peripheral blood lymphocyte)是血液循環(huán)中的淋巴細(xì)胞，主要由T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK等免疫細(xì)胞組成.研究表明，外周血單核細(xì)胞(PBMC)、T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和NK來源的細(xì)胞系均表達(dá)IL-21受體.人外周血淋巴細(xì)胞可由人外周血分離獲得.由于人外周血淋巴細(xì)胞主要由表達(dá)IL-21受體的免疫細(xì)胞組成，并易于獲得，人外周血淋巴細(xì)胞可作為研究SA-IL-21修飾磁珠促進(jìn)免疫細(xì)胞體外擴(kuò)增的理想細(xì)胞模型.

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

pET24a-SA-hIL-21載體，E.coliRosetta(DE3)株，MB49膀胱癌細(xì)胞均為本實(shí)驗(yàn)室保存.DEAE-Sephrose Fast Flow(DEAE SFF)柱購買于美國GE公司.胰蛋白酶，鼠抗人SA-hIL-21單克隆抗體，羊抗鼠IgG購買于碧云天生物技術(shù)研究所.血球計(jì)數(shù)板購買于德國MARIENFELD公司.人IL-21標(biāo)準(zhǔn)品購買于美國R&D公司.CCK-8檢測(cè)試劑盒購買于上海圣爾生物科技有限公司.NHS-PEG4-biotin購買于上海恪敏生物科技有限公司.BeaverBeadsTMMag NH2磁珠購買于上海希言科學(xué)儀器有限公司.人外周血來源于本實(shí)驗(yàn)室志愿者.

1.2 方法

1.2.1 pET24a-SA-hIL-21工程菌發(fā)酵培養(yǎng)

取5μL保存于-80℃冰箱中的E.coliRosetta(DE3)菌種接種于5mL含有10μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，放于37℃水平搖床上250r/min培養(yǎng)過夜.然后，取一次活化的菌液5mL再次接種到500mL含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中并放于37℃水平搖床上250r/min培養(yǎng)12h.菌液OD600的值達(dá)到1.5～2.0時(shí)，取500mL菌液接種于10L發(fā)酵培養(yǎng)基中，待菌液OD600=3時(shí)即進(jìn)入發(fā)酵的誘導(dǎo)階段，設(shè)置誘導(dǎo)階段的溫度為32.5℃，pH=7.0，起始DO 50%，添加終濃度為0.5mmol/L誘導(dǎo)劑IPTG后繼續(xù)發(fā)酵10h，然后結(jié)束發(fā)酵收集菌液.

1.2.2 SA-hIL-21的純化與復(fù)性

將DEAE SFF柱用平衡液進(jìn)行2個(gè)柱體積的平衡，當(dāng)流出的液體的pH值穩(wěn)定時(shí)進(jìn)行上樣.將樣品以1mL/min的速度泵入DEAE SFF柱中，然后以5mL/min的速度依次泵入復(fù)性液和洗脫液進(jìn)行洗脫.每種液體至少過足2個(gè)柱體積.收集洗脫峰蛋白用膜包進(jìn)行濃縮.然后用10% SDS-PAGE對(duì)收集的蛋白進(jìn)行純化復(fù)性鑒定.

1.2.3 SA-hIL-21對(duì)生物素化MB49細(xì)胞的錨定率測(cè)定

取生長狀態(tài)比較良好的MB49細(xì)胞，用胰蛋白酶消化后制備MB49細(xì)胞懸液，再用PBS洗滌3次，稀釋細(xì)胞濃度為2×106/mL，加入Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin使其終濃度為1mg/mL(PBS配制，現(xiàn)配現(xiàn)用)，37℃反應(yīng)1h，PBS洗滌3次后，加入SA-hIL-21融合蛋白，37℃反應(yīng)1h，PBS洗滌細(xì)胞3次，加入鼠抗人SA-hIL-21單克隆抗體(PBS 1∶100稀釋)，37℃反應(yīng)0.5h，PBS洗滌細(xì)胞3次，加入10μL PE標(biāo)記的羊抗鼠IgG(PBS 1∶100稀釋)，37℃避光反應(yīng)0.5h.離心洗滌后每管取300μL PBS重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)入流式檢測(cè)管，用美國BD FACS Arial流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析，測(cè)定融合蛋白對(duì)生物素化MB49細(xì)胞的錨定修飾率.其中空白對(duì)照組只加入MB49細(xì)胞.

1.2.4 SA-hIL-21刺激外周血淋巴細(xì)胞增殖能力的測(cè)定

將人外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)移入15mL離心管中，1000r/min，離心8min.加入適量的R/MINI-1640完全培養(yǎng)基，重懸細(xì)胞，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞密度為2×105/mL左右，用排槍依次在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入100μL的細(xì)胞懸液.將復(fù)性后的SA-hIL-21融合蛋白和hIL-21標(biāo)準(zhǔn)品分別倍比稀釋(2×)，每孔加入100μL，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，其中陰性對(duì)照組中加入培養(yǎng)基和細(xì)胞，空白對(duì)照組只加入培養(yǎng)基.于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)72h，期間要在日本Nikon TS100倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的增殖情況.3d后每孔加入20μL CCK-8，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)3h，Bio-Tek ELx800酶標(biāo)儀檢測(cè)450nm下吸光度值(OD450).

1.2.5 SA-hIL-21與磁珠的錨定

吸取6μL濃度為1mol/μL的磁珠溶液置于磁力架上的流式管中，用PBS洗3遍.根據(jù)每摩爾磁珠加入200ng生物素的原則，將1.2μg生物素溶于PBS中，配得100μL濃度為12ng/μL的生物素試劑.將配好的100μL生物素試劑加到含磁珠的流式管，室溫反應(yīng)30min.向流式管中加入200μL PBS清洗磁珠，用加樣槍輕輕混勻，在磁力架上沉降10min，吸走上清液，注意不要吸走磁珠.重復(fù)兩次.將SA-hIL-21融合蛋白(濃度1μg/μL)稀釋為100ng/μL，即稀釋10倍，取原液5μL加入45μL PBS.根據(jù)磁珠生物素之比，1mol磁珠需加入100ng蛋白進(jìn)行反應(yīng)，因此共需蛋白600ng，即加入配置好的蛋白溶液6μL.加PBS補(bǔ)足50μL體系，反應(yīng)40min.向流式管中加入200μL PBS清洗磁珠，用加樣槍輕輕混勻，在磁力架上沉降10min，吸走上清液，重復(fù)兩次.

1.2.6 SA-hIL-21對(duì)磁珠的錨定率測(cè)定

在SA-hIL-21修飾磁珠溶液中加入鼠抗人SA-hIL-21單克隆抗體，按1∶100的比例稀釋.37℃反應(yīng)30min.向流式管中加入200μL PBS清洗磁珠，用加樣槍輕輕混勻，在磁力架上沉降10min，吸走上清液，注意不要吸走磁珠.重復(fù)兩次.向流式管中加入PE標(biāo)記的羊抗鼠IgG，按1∶100的比例稀釋.37℃避光反應(yīng)0.5h.通過流式細(xì)胞儀分析，測(cè)定SA-hIL-21融合蛋白對(duì)生物素化磁珠的錨定修飾率.其中空白對(duì)照組只加入生物素化磁珠.

1.2.7 SA-hIL-21修飾磁珠的生物學(xué)活性測(cè)定

依次在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中用排槍每孔加入100μL的人外周血淋巴細(xì)胞懸液.將SA-hIL-21修飾磁珠和hIL-21標(biāo)準(zhǔn)品分別倍比稀釋(2×)，每孔加入100μL，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔.hIL-21蛋白標(biāo)準(zhǔn)品組最高刺激濃度為0.5μg/mL.由于錨定修飾磁珠時(shí)，每摩爾磁珠加入100ng SA-hIL-21融合蛋白，我們?cè)O(shè)置SA-hIL-21修飾磁珠實(shí)驗(yàn)組的最高刺激濃度為5mol/mL.將細(xì)胞置于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h.將孔內(nèi)的培養(yǎng)基吸走，每孔加入20μL胰蛋白酶，37℃反應(yīng)2min，加入180μL完全培養(yǎng)基，重懸細(xì)胞.SA-hIL-21修飾磁珠組的細(xì)胞懸液放到磁力架上磁力沉降磁珠10min，吸走細(xì)胞懸液，鋪到新的96孔板內(nèi).hIL-21標(biāo)準(zhǔn)品組的細(xì)胞懸液直接鋪板.每孔加入20μL CCK-8試劑，5% CO2、37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)3h，用Bio-Tek ELx800酶標(biāo)儀檢測(cè)OD450吸收光值.

2 結(jié)果與分析

2.1 SA-hIL-21工程菌的制備

圖1 IPTG誘導(dǎo)前后菌液蛋白的SDS-PAGEFig.1 SDS-PAGE of proteins’ expression before and after treated with IPTG1. 蛋白質(zhì)Marker;2. IPTG誘導(dǎo)前;3. IPTG誘導(dǎo)后A;4. IPTG誘導(dǎo)后.

將重組載體pET24a-SA-hIL-21轉(zhuǎn)進(jìn)感受態(tài)細(xì)胞E.coliRosetta(DE3)中，培養(yǎng)在含10μg/mL卡那霉素的固體LB培養(yǎng)基中.次日，LB固體培養(yǎng)基上長出若干單克隆菌落.挑取單克隆菌落培養(yǎng)于5mL LB液體培養(yǎng)基中，待培養(yǎng)基OD600達(dá)到3后，加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá).SDS-PAGE電泳結(jié)果如圖1所示，轉(zhuǎn)入載體pET24a-SA-hIL-21的E.coliRosetta菌株經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)后能大量表達(dá)SA-hIL-21(分子量約34kDa)，說明已成功制備SA-hIL-21工程菌.

2.2 SA-hIL-21的表達(dá)

將SA-hIL-21工程菌進(jìn)行一次活化和二次活化，將二次活化后的發(fā)酵種子液接種到10L發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng).期間每隔1.5h取一次樣測(cè)量菌體的OD600值.菌體生長曲線如圖2所示.結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌體在培養(yǎng)4.5h以后，OD600值達(dá)到3，即進(jìn)入IPTG誘導(dǎo)階段.繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)，9h后菌體的表達(dá)量不再發(fā)生改變即判斷菌體的生長進(jìn)入了穩(wěn)定期，結(jié)束發(fā)酵并收集菌液[17].將采集的各個(gè)時(shí)間段的樣本與上樣緩沖液混勻制備成樣品后進(jìn)行SDS-PAGE電泳鑒定，結(jié)果如圖3所示.電泳顯示在34kDa左右表達(dá)有與SA-hIL-21蛋白大小相同的蛋白條帶，同時(shí)經(jīng)過稱量菌體濕重約為282g.

圖2 發(fā)酵菌種生長曲線Fig.2 The growth curve of fermentation bacterial species

圖3 SA-hIL-21蛋白發(fā)酵后表達(dá)的SDS-PAGE檢測(cè)Fig.3 SDS-PAGE of SA-hIL-21 expression after fermentation

2.3 SA-hIL-21的純化與復(fù)性

溶解的包涵體離心后，取上清進(jìn)行DEAE SFF弱陰離子交換純化，并進(jìn)行柱上復(fù)性.AKTA純化儀顯示有多個(gè)較小的穿透峰和一個(gè)較明顯的洗脫峰，如圖4所示.經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，穿透峰多為雜蛋白，洗脫峰主要為目的蛋白，SA-hIL-21融合蛋白主要以多聚體和單體的形式存在.通過RP-HPLC分析，SA-hIL-21融合蛋白的純度可達(dá)到90%以上，如圖5所示.通過BCA法測(cè)得SA-hIL-21融合蛋白濃度為1mg/mL.

圖4 目標(biāo)蛋白的洗脫曲線Fig.4 The eluting curve of the objective protein

圖5 SA-hIL-21融合蛋白的RP-HPLC純度分析Fig.5 The purity of SA-hIL-21 fusion protein analyzed by RP-HPLC

2.4 SA-hIL-21雙功能融合蛋白生物學(xué)功能的鑒定

用hIL-21單克隆抗體及FITC標(biāo)記的二抗，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)SA-hIL-21錨定已生物素化MB49細(xì)胞的效率.結(jié)果顯示： SA-hIL-21融合蛋白能錨定修飾表面已生物素化的MB49細(xì)胞，錨定效率可達(dá)到97.8%，說明獲得的SA-hIL-21融合蛋白具備與生物素高親合力牢固結(jié)合的生物學(xué)特性,如圖6所示.

將復(fù)性后的SA-hIL-21融合蛋白和hIL-21標(biāo)準(zhǔn)品分別倍比稀釋(2×)，分別對(duì)體外培養(yǎng)的外周血淋巴細(xì)胞進(jìn)行刺激.培養(yǎng)72h后用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性，檢測(cè)所得OD450值應(yīng)用GraphPad Prism5軟件分析，根據(jù)量-效關(guān)系方程，將SA-hIL-21融合蛋白組及hIL-21蛋白標(biāo)準(zhǔn)品組促進(jìn)外周血淋巴細(xì)胞增值的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，直接得到了二者對(duì)外周血淋巴細(xì)胞的增值率的量-效曲線，如圖7見第196頁所示.分析得到： hIL-21蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的半數(shù)有效濃度EC50=1.154；SA-hIL-21融合蛋白的半數(shù)有效濃度EC50=1.334.

圖6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SA-hIL-21對(duì)生物素化MB49細(xì)胞的錨定效率Fig.6 Modified rate of SA-hIL-21 on biotinylated MB49 cells by FACS(a)： MB49細(xì)胞;(b)： MB49細(xì)胞+SA-hIL-21;(c)： MB49細(xì)胞+生物素+SA-hIL-21.

2.5 SA-hIL-21對(duì)磁珠的錨定率

孵hIL-21抗體及FITC標(biāo)記的二抗后，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)SA-hIL-21融合蛋白錨定已生物素化磁珠的效率.結(jié)果顯示： SA-hIL-21融合蛋白能錨定修飾表面已生物素化的磁珠，錨定效率可達(dá)到87.0%，大部分的磁珠上已經(jīng)修飾了SA-hIL-21融合蛋白,說明我們已經(jīng)成功得到了SA-hIL-21融合蛋白修飾磁珠，結(jié)果如圖8見第196頁所示.

2.6 SA-hIL-21修飾磁珠促進(jìn)人外周血淋巴細(xì)胞增殖的能力

細(xì)胞培養(yǎng)72h后，鏡下觀察加入SA-hIL-21修飾磁珠組及SA-hIL-21標(biāo)準(zhǔn)蛋白組均有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用，且其增值程度呈現(xiàn)梯度變化，重復(fù)組之間未發(fā)現(xiàn)有明顯差異.除去磁珠，加入CCK-8后3h，肉眼觀察加入SA-hIL-21修飾磁珠組及SA-hIL-21標(biāo)準(zhǔn)蛋白組從第一個(gè)孔到最后一孔顏色逐漸變淺，呈梯度變化.將hIL-21蛋白標(biāo)準(zhǔn)品組及SA-hIL-21修飾磁珠組促進(jìn)外周血淋巴細(xì)胞增值的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，直接得到了二者對(duì)外周血淋巴細(xì)胞的增值率的量-效曲線，結(jié)果如圖9見第196頁所示.Top值是藥物濃度處于最佳刺激濃度時(shí)產(chǎn)生的最大效應(yīng).根據(jù)GraphPad Prism5軟件分析，hIL-21蛋白標(biāo)準(zhǔn)品組的Top值為1.332；SA-hIL-21修飾磁珠組的Top值為1.797.

圖7 SA-hIL-21融合蛋白的生物學(xué)活性測(cè)定Fig.7 Bioactive assays of SA-hIL-21 fusion protein

圖8 SA-hIL-21對(duì)生物素化磁珠錨定效率Fig.8 Modified rate of SA-hIL-21 on biotinylated magnetic beads

圖9 hIL-21標(biāo)準(zhǔn)蛋白組與SA-hIL-21修飾磁珠組的量-效曲線Fig.9 Dose-dependence curve of hIL-21 protein and magnetic beads

3 討 論

我們利用生物素-鏈親和素高親和力緊密結(jié)合的原理，將同時(shí)具有SA和hIL-21生物學(xué)活性的SA-hIL-21融合蛋白錨定到生物素化的磁珠上.經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，SA-hIL-21融合蛋白能錨定已生物素化的磁珠，錨定效率可達(dá)到87.0%，即是87.0%的磁珠上已經(jīng)修飾了SA-hIL-21融合蛋白,說明我們已經(jīng)成功得到了SA-hIL-21融合蛋白修飾磁珠.

我們分別用獲得的SA-hIL-21修飾磁珠和hIL-21標(biāo)準(zhǔn)蛋白去刺激外周血淋巴細(xì)胞增殖.hIL-21標(biāo)準(zhǔn)蛋白組設(shè)置了2-1～2-7μg/mL 7個(gè)梯度濃度.由于SA-hIL-21錨定修飾磁珠時(shí)，磁珠： SA-hIL-21融合蛋白=1mol∶0.1μg，5mol/mL磁珠理論上結(jié)合了0.5μg SA-hIL-21融合蛋白.因此，我們?cè)O(shè)置了SA-hIL-21修飾磁珠組5×20～5×2-6mol/mL 7個(gè)梯度濃度，與hIL-21標(biāo)準(zhǔn)蛋白組相對(duì)應(yīng).磁珠修飾的過程中，不可能所有加入的SA-hIL-21融合蛋白都能結(jié)合到磁珠上，必然存在部分SA-hIL-21融合蛋白丟失.因此，5mol/mL SA-hIL-21修飾磁珠上實(shí)際結(jié)合的SA-hIL-21融合蛋白必然少于0.5μg，依次類推，SA-hIL-21修飾磁珠組各個(gè)梯度濃度中的實(shí)際蛋白量少于理論.盡管如此，我們由圖9可以看到，SA-hIL-21修飾磁珠組各個(gè)梯度濃度的效應(yīng)均強(qiáng)于對(duì)應(yīng)的hIL-21標(biāo)準(zhǔn)蛋白組各個(gè)梯度濃度的效應(yīng).最重要的是，當(dāng)SA-hIL-21修飾磁珠濃度處于最佳刺激濃度時(shí)促進(jìn)外周血淋巴細(xì)胞的增殖的最大效應(yīng)比hIL-21標(biāo)準(zhǔn)蛋白的最大效應(yīng)強(qiáng)56.59%.

SA-hIL-21修飾磁珠促進(jìn)外周血淋巴細(xì)胞的增殖的最大效應(yīng)強(qiáng)于hIL-21標(biāo)準(zhǔn)蛋白有以下3方面原因.其一，細(xì)胞培養(yǎng)基hIL-21的濃度提高到一定程度，必然對(duì)培養(yǎng)基溶氧量、pH緩沖能力、滲透壓以及培養(yǎng)基中其他營養(yǎng)成分造成一定的影響.這些因素有可能限制了hIL-21促進(jìn)其靶細(xì)胞增殖的效率，細(xì)胞增殖不再隨著hIL-21的濃度的提高而增強(qiáng).SA-hIL-21修飾磁珠，實(shí)現(xiàn)在細(xì)胞表面較小空間范圍內(nèi)富集hIL-21，而不是提高整個(gè)培養(yǎng)基溶液中hIL-21的濃度，就可以突破上述因素的限制，從而可以在體外更高效地促進(jìn)hIL-21靶細(xì)胞的增殖.其二，與游離的hIL-21蛋白相比，錨定在磁珠上的SA-hIL-21活動(dòng)的空間范圍受到限制，與IL-21受體結(jié)合后不易于解離.因此，SA-hIL-21修飾磁珠能夠更持久、穩(wěn)定地促進(jìn)靶細(xì)胞的增殖.其三，SA-hIL-21修飾磁珠與靶細(xì)胞接觸可能可以模擬細(xì)胞胞間接觸，從而促進(jìn)外周血淋巴細(xì)胞的增殖和分化.細(xì)胞胞間接觸和相互作用在免疫細(xì)胞的增殖和分化過程中發(fā)揮著重要的作用，尤其是T細(xì)胞和Nκ細(xì)胞.因此，SA-hIL-21修飾磁珠可能通過模擬細(xì)胞胞間接觸的方式促進(jìn)外周血中的T細(xì)胞和Nκ細(xì)胞的增殖和分化.

IL-21的靶細(xì)胞包括多種免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用的免疫細(xì)胞，例如T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞等[18].SA-hIL-21修飾磁珠的獲得有望進(jìn)一步改進(jìn)體外擴(kuò)增以上免疫細(xì)胞的方法，從而對(duì)過繼性免疫效應(yīng)細(xì)胞療法的發(fā)展具有重要意義.同時(shí)，SA-hIL-21修飾磁珠的獲得有助于其他細(xì)胞因子錨定修飾磁珠的研究，為以后將一種或同時(shí)多種細(xì)胞因子錨定到磁珠上提供經(jīng)驗(yàn).

綜上所述，我們成功獲得了錨定率達(dá)到87.0%的SA-hIL-21融合蛋白修飾磁珠，并測(cè)得所得的SA-hIL-21融合蛋白修飾磁珠能夠高效促進(jìn)外周血淋巴細(xì)胞的增殖，其最大效應(yīng)比hIL-21標(biāo)準(zhǔn)蛋白的最大效應(yīng)強(qiáng)56.59%.我們發(fā)現(xiàn)了一種比以往更高效體外擴(kuò)增外周血淋巴細(xì)胞的方法，為后續(xù)體外大規(guī)模培養(yǎng)外周血中某種或多種免疫細(xì)胞及與hIL-21靶細(xì)胞相關(guān)的免疫療法奠定了基礎(chǔ)，也為錨定修飾其他磁珠提供經(jīng)驗(yàn).