Sigma因子6促進(jìn)擬南芥MIRNA基因轉(zhuǎn)錄

楊天宇，鄭丙蓮

(1.復(fù)旦大學(xué) 遺傳工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200438; 2.復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，上海 200438)

MicroRNA(miRNA)是一類(lèi)長(zhǎng)度在20～24nt的單鏈內(nèi)源小分子RNA[1]，廣泛存在于真核生物中，由Victor Ambros等于1993年在線蟲(chóng)(Caenorhabditiselegans)[2]中首次發(fā)現(xiàn).植物中的miRNA被發(fā)現(xiàn)的時(shí)間較晚，2002年，陳雪梅[3]實(shí)驗(yàn)室和David Bartel[4]實(shí)驗(yàn)室才在擬南芥(Arabidopsisthaliana)中發(fā)現(xiàn)miRNA的存在.miRNA能夠通過(guò)切割靶標(biāo)的mRNA或者抑制翻譯達(dá)到在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)的目的.在擬南芥中，miRNA的生物合成途徑已經(jīng)被了解得非常清楚.首先，DNA依賴(lài)的RNA聚合酶Ⅱ(PolⅡ)[5]將MIRNA基因轉(zhuǎn)錄成具有莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的初級(jí)miRNA(pri-miRNA)[6]；pri-miRNA被Dicer like 1(DCL1)[7]蛋白主導(dǎo)的復(fù)合體進(jìn)行第一次加工切割，成為前體miRNA(pre-miRNA)；pre-miRNA被DCL1蛋白復(fù)合體再次切割形成成熟的miRNA/miRNA*雙鏈[8].雙鏈miRNA被HUA ENHANCER 1(HEN1)甲基化后[9]，其中的一條鏈與ARGONAUTE1(AGO1)蛋白結(jié)合[10]，參與到后續(xù)的效應(yīng)途徑[11].

盡管人們對(duì)miRNA生物合成途徑的認(rèn)識(shí)已經(jīng)比較完善，但對(duì)部分環(huán)節(jié)的理解仍然不是十分清楚.比如PolⅡ轉(zhuǎn)錄MIRNA基因是否受到特定轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控？我們通過(guò)EMS(甲基磺酸乙酯)誘變DCL1蛋白功能部分降低的擬南芥弱突變體dcl1-14，在篩選miRNA水平異常的突變體的過(guò)程中，我們分離得到了一個(gè)新的突變體m112.本研究克隆了M112基因，并對(duì)M112在miRNA產(chǎn)生途徑中發(fā)揮的功能展開(kāi)研究，完善對(duì)植物miRNA生物合成途徑的了解.

1 材料與方法

1.1 材料

模式生物為擬南芥(Arabidopsisthaliana)，其中野生型植株包括Col-0(Columbia)和Ler(Landsberg erecta)兩種生態(tài)型，突變體植株包括m112、sig6-2、sig6-3、sig2-2、sig3-2、sig4、sig5等(均為Col-0生態(tài)型背景)，轉(zhuǎn)基因植株包括MIRNA基因(MIR390a、MIR778、MIR172a1)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS轉(zhuǎn)基因植株，以上植株材料均由本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建或由其他課題組惠贈(zèng).大腸桿菌E.coliDH5α、農(nóng)桿菌AgrobacteriumtumefaciensGV3101、大腸桿菌過(guò)表達(dá)載體pEarleyGate101(經(jīng)過(guò)改造，去掉了GFP的標(biāo)簽)、大腸桿菌過(guò)表達(dá)載體p35S∶∶C3F(改造自pEarleyGate202，將原來(lái)的1×FLAG換成了3×FLAG)，由本實(shí)驗(yàn)室前期保存.所用引物或探針由上海生工生物工程有限公司合成.其他實(shí)驗(yàn)所用試劑為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純.

1.2 方法

1.2.1 圖位克隆

將突變體m112(Col-0生態(tài)型背景)與野生型(Ler生態(tài)型)進(jìn)行雜交，得到F1子代，F(xiàn)1代自交得到F2代，挑取F2代中表型為m112表型的植株作為樣品進(jìn)行編號(hào)，另外準(zhǔn)備Col-0、Ler及Col-0/Ler雜合植株作為參照組，提取基因組DNA.分別以上述基因組DNA為模板，使用特定的標(biāo)簽引物[12]進(jìn)行PCR反應(yīng).分析每個(gè)樣品的電泳結(jié)果，如果出現(xiàn)與參照組Col-0、Ler、Col-0/Ler一致的結(jié)果(條帶大小一致)，分別記為0、2、1點(diǎn).統(tǒng)計(jì)每個(gè)標(biāo)簽上所有樣品的點(diǎn)數(shù)總和，除以樣品總數(shù)，再除以2，即可得到每個(gè)標(biāo)簽對(duì)應(yīng)交換率，從而將突變基因M112鎖定在交換率為0的標(biāo)簽區(qū)域上.

1.2.2 全基因組測(cè)序分析及Sanger測(cè)序驗(yàn)證

將突變體m112的基因組DNA送到晶能生物技術(shù)公司進(jìn)行全基因組測(cè)序，然后對(duì)圖位克隆后鎖定的區(qū)域進(jìn)行分析，同時(shí)結(jié)合m112的表型以及TAIR網(wǎng)站上對(duì)于各個(gè)可能基因的描述，推測(cè)突變基因.為了驗(yàn)證猜測(cè)結(jié)果，我們提取m112的基因組DNA，并使用相應(yīng)的引物(表1)對(duì)推測(cè)基因所在的區(qū)段進(jìn)行Sanger測(cè)序，再將測(cè)序的結(jié)果與Col-0相對(duì)應(yīng)的序列進(jìn)行堿基比對(duì)，判斷在m112中該基因是否發(fā)生了無(wú)義突變或錯(cuò)義突變.

1.2.3 等位分析與轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)

在初步確認(rèn)m112的突變基因之后，為了進(jìn)一步驗(yàn)證其準(zhǔn)確性，我們拿到了M112等位基因已知的突變體，并將其與m112進(jìn)行雜交，收種后得到F1代的種子，將F1代的種子播下以后，觀察其表型，若表型與m112一致，則說(shuō)明判斷正確，反之則判斷錯(cuò)誤.另外，我們將M112構(gòu)建到p35S∶∶(無(wú)tag)和p35S∶∶C3F載體上，通過(guò)GV3101侵染M112基因的突變體，拿到純合且單拷貝插入的植株后，觀察其表型，若表型與Col-0一致，則說(shuō)明判斷正確，反之則判斷錯(cuò)誤.

1.2.4 Northern blot

使用TRIzol溶液提取目標(biāo)實(shí)驗(yàn)材料中的總RNA，然后使用5mol/L NaCl溶液和50% PEG8000溶液富集小分子RNA.接著將小分子RNA進(jìn)行聚丙烯酰胺尿素凝膠電泳，并使用轉(zhuǎn)膜儀將小分子RNA轉(zhuǎn)到尼龍膜上，紫外交聯(lián)并烘干，隨后使用小分子RNA探針(表2)雜交過(guò)夜.第2天雜交結(jié)束后進(jìn)行洗膜、封閉、染色、洗膜等一系列操作，最后顯色并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果.

1.2.5 小分子RNA深度測(cè)序

我們收集Col-0和m112的花序材料，送到晶能生物技術(shù)公司對(duì)其進(jìn)行小分子RNA的深度測(cè)序，共計(jì)兩批樣品即兩次生物學(xué)重復(fù).標(biāo)準(zhǔn)化后的數(shù)值使用RPTM(reads per ten million)進(jìn)行計(jì)算，且篩選reads數(shù)大于100的miRNA表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，分析結(jié)果.

1.2.6 熒光定量PCR

使用TRIzol溶液提取目標(biāo)實(shí)驗(yàn)材料中的總RNA，然后依次用DNaseⅠ、水飽和酚和氯仿對(duì)其進(jìn)行純化.接著使用OligodT引物、dNTP、DTT和RNA反轉(zhuǎn)錄酶將純化后的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再加入SYBR Green supermix和對(duì)應(yīng)的pri-miRNA引物(表3)進(jìn)行熒光定量PCR.反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)SYBR熒光表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析.

表3 qPCR所用引物

1.2.7 GUS染色

將MIRNA基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS轉(zhuǎn)基因植株與M112基因的突變體進(jìn)行雜交，得到純合的轉(zhuǎn)基因突變體植株.然后取其花序、幼苗或者葉片等材料，放入加有適量GUS染色液的EP管中.接著將EP管放入真空泵中，打開(kāi)EP管的蓋子，抽真空5min，使得擬南芥材料完全沒(méi)入到GUS染色液中.再將EP管放到37℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行染色.染色完成后倒掉染色液，用75%乙醇清洗3次，最后在體式顯微鏡下觀察并記錄染色結(jié)果.

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體m112的突變基因?yàn)镾IG6

在篩選擬南芥miRNA水平異常的突變體的過(guò)程中，我們分離得到了一個(gè)新的突變體m112，它在發(fā)育早期，會(huì)出現(xiàn)子葉黃化的表型，且生長(zhǎng)發(fā)育較野生型緩慢.通過(guò)圖位克隆，我們將突變基因M112鎖定在擬南芥第2條染色體15294K～15582K的區(qū)段中，如圖1(a)(見(jiàn)第172頁(yè))所示.隨后，我們將m112的基因組DNA進(jìn)行全基因組測(cè)序，并對(duì)上述區(qū)段之間所有編碼基因序列進(jìn)行分析，結(jié)合m112的表型以及TAIR網(wǎng)站上對(duì)于各可能基因的描述，我們猜測(cè)突變基因?yàn)锳T2G36990即SIG6.同時(shí)Sanger測(cè)序驗(yàn)證了在m112中，SIG6基因的第1680位堿基發(fā)生了C→T的突變，使得該基因的表達(dá)提前終止，即無(wú)義突變，如圖1(b)所示.

目前，關(guān)于SIG6基因已報(bào)道的突變體sig6-1和sig6-2分別是由于在SIG6基因第4個(gè)、第5個(gè)外顯子內(nèi)插入了T-DNA而導(dǎo)致基因無(wú)法正常表達(dá)，而突變體m112則是由于堿基突變，使其SIG6基因在第6個(gè)外顯子的末端表達(dá)終止，導(dǎo)致后3個(gè)外顯子缺失，如圖1(c)所示.為了后續(xù)研究的開(kāi)展，我們得到了sig6-2及其他sigma因子突變體的種子.我們發(fā)現(xiàn)sig6-2和m112兩者的形態(tài)學(xué)表型相似，在發(fā)育早期子葉會(huì)出現(xiàn)黃化，而將兩者進(jìn)行雜交，F(xiàn)1代仍然會(huì)出現(xiàn)黃化的表型，同時(shí)，我們將SIG6過(guò)表達(dá)質(zhì)粒通過(guò)GV3101侵染到sig6-2中，發(fā)現(xiàn)純合且單拷貝插入的植株不再出現(xiàn)黃化的表型，從兩方面證明m112的突變基因確實(shí)是SIG6，如圖1(d)、(e)所示.

圖1 突變基因M112的鑒定及突變體表型觀察Fig.1 Identification of the mutated gene M112 and observation of mutants(a) 突變基因M112在擬南芥第2條染色體上各引物標(biāo)簽所對(duì)應(yīng)的交換率，在F1O11和T2N18 2個(gè)標(biāo)簽之間的區(qū)段交換率為0；(b) 突變體m112的Sanger測(cè)序峰圖，圖中淡藍(lán)色框選中的堿基為突變堿基，該位點(diǎn)的堿基在野生型中為C，在突變體中突變?yōu)門(mén)；(c) sig6突變體的基因組示意圖，其中sig6-1和sig6-2是已報(bào)道的sig6突變體，分別在第4個(gè)、第5個(gè)外顯子中插入了T-DNA，m112則是在第6個(gè)外顯子的末端表達(dá)終止，紅色*表示m112的點(diǎn)突變位置；(d) Col-0、sig6-2、m112、sig6-2與m112的雜交F1代及SIG6轉(zhuǎn)基因過(guò)表達(dá)植株的苗期表型；(e) Col-0、sig6-2及m112的發(fā)育后期表型，其中Ⅰ為整體植株對(duì)比，Ⅱ?yàn)榛ㄐ驅(qū)Ρ龋鬄槿~片對(duì)比.

2.2 SIG6參與了miRNA的生物合成

為了確定sig6突變體中miRNA的累積是否出現(xiàn)了下調(diào)，我們首先進(jìn)行了Northern blot實(shí)驗(yàn).我們收集了包括Col-0、sig6-2、m112以及其他一系列sigma突變體的花序材料，在提取總RNA并富集小分子RNA后，進(jìn)行了Northern blot實(shí)驗(yàn)，分別檢測(cè)了U6(作為內(nèi)參)及miR168、miR159、miR167、miR171、miR319、miR165/6和miR173的表達(dá)量，如圖2(a)(見(jiàn)第173頁(yè))所示，發(fā)現(xiàn)在SIG6基因的兩個(gè)不同性質(zhì)的突變體中，所檢測(cè)miRNA的累積量相比于Col-0均出現(xiàn)了不同程度的下調(diào).

為了觀察在突變體sig6中miRNA的整體水平是否產(chǎn)生了變化，我們收集了兩批Col-0和m112的花序材料，進(jìn)行兩次生物學(xué)重復(fù)的小分子RNA深度測(cè)序.測(cè)序后將標(biāo)準(zhǔn)化的數(shù)值使用RPTM(reads per ten million)進(jìn)行計(jì)算，且篩選reads數(shù)大于100的miRNA表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)并分析結(jié)果.最終發(fā)現(xiàn)突變體m112的miRNA累積相比于野生型有明顯地下調(diào)，如圖2(b)所示，盒圖中線的縱坐標(biāo)數(shù)值接近-1即整體下調(diào)了近一半.此外，我們具體分析了第1批測(cè)序結(jié)果中miR168、miR159、miR167、miR171、miR319、miR165/6和miR173的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)m112中的這些miRNA相比于Col-0均有明顯的下調(diào)(但對(duì)于miRNA鏈的選擇并沒(méi)有受到影響)，如圖2(c)所示，與之前的Northern blot結(jié)果形成了相互印證.以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明突變體sig6中miRNA的累積下調(diào)，即SIG6在miRNA的生物合成中發(fā)揮作用.

2.3 SIG6影響了MIRNA基因的轉(zhuǎn)錄

為了探究SIG6具體影響了miRNA生物合成的哪一個(gè)步驟，我們首先檢測(cè)sig6突變體中pri-miRNA的累積量是否發(fā)生了變化.我們提取了Col-0、m112、sig6-2、hyl1-2的總RNA(HYL1會(huì)參與到pri-miRNA的后續(xù)加工中，因此突變體hyl1-2中pri-miRNA會(huì)累積，這里作為正對(duì)照組)，經(jīng)過(guò)純化和反轉(zhuǎn)錄得到各自的cDNA，并進(jìn)行了兩組熒光定量PCR(qPCR)實(shí)驗(yàn)，使用的引物為內(nèi)參UBQ5及各個(gè)pri-miRNA對(duì)應(yīng)的引物.結(jié)果發(fā)現(xiàn)相比于Col-0，m112和sig6-2中各個(gè)pri-miRNA的累積均出現(xiàn)了下調(diào)，如圖3(a)、(b)(見(jiàn)第174頁(yè))所示.由此我們猜測(cè)在sig6突變體中，MIRNA基因的轉(zhuǎn)錄受到了抑制或者pri-miRNA的降解速度變慢了.

為了驗(yàn)證上面的猜測(cè)是否正確，我們將MIRNA基因MIR390a、MIR778、MIR172a1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS轉(zhuǎn)基因植株雜交到sig6-2突變體的背景下，然后進(jìn)行GUS染色，并與Col-0背景下的染色結(jié)果進(jìn)行比較.如果是MIRNA基因的轉(zhuǎn)錄受到了影響，預(yù)期將看到sig6突變體中GUS的染色變淺.結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)在相同的染色條件下，sig6-2突變體的背景下GUS染色強(qiáng)度均明顯弱于Col-0背景下的GUS染色強(qiáng)度，如圖3(c)所示.表明在sig6-2突變體中，MIRNA基因的轉(zhuǎn)錄受到了抑制，亦即MIRNA基因啟動(dòng)子的活性受到了SIG6的正調(diào)控.

圖2 Northern blot及小分子RNA深度測(cè)序檢測(cè)sig6突變體中miRNA水平的變化Fig.2 Northern blot and small RNA sequencing to detect the changes of miRNA levels in sig6 mutants(a) Northern blot檢測(cè)Col-0、sig6-2、m112以及其他sigma突變體中部分miRNA的累積量，每張膜從左至右的樣品依次為Col-0、sig2、sig3、sig4、sig5、sig6和m112，使用的探針包括U6及miR168、miR159、miR167、miR171、miR319、miR165/6、miR173；(b) 小分子RNA深度測(cè)序分析Col-0和m112中成熟miRNA的水平，盒圖中縱坐標(biāo)是計(jì)算log2以后的m112/Col-0比值，橫坐標(biāo)的1、2分別指第1、2批測(cè)序樣品(花序RNA)；(c) 第1批測(cè)序樣品中Col-0與m112的miR159a的表達(dá)量比較，其中紅線為Col-0，黑線為m112；(d) 第1批測(cè)序樣品中Col-0與m112的miR167a的表達(dá)量比較，其中紅線為Col-0，黑線為m112；(e) 第1批測(cè)序樣品中Col-0與m112的miR173的表達(dá)量比較，其中紅線為Col-0，黑線為m112.

圖3 qPCR檢測(cè)sig6突變體中pri-miRNA的變化及不同背景下的proMIR∶∶GUS染色結(jié)果觀察Fig.3 qPCR to detect the changes of pri-miRNA levels in sig6 mutants and observation of proMIR∶∶GUS staining in different background(a) 熒光定量PCR檢測(cè)樣品中的pri-miRNA水平，其中所用材料為Col-0、m112以及hyl1-2，hyl1-2作為正對(duì)照，UBQ5作為內(nèi)參，檢測(cè)引物為pri-miR171a、pri-miR172a、pri-miR167a、pri-miR156a、pri-miR159a、pri-miR166a、pri-miR168a、pri-miR319a共8組，誤差線的數(shù)值為3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的STDEV計(jì)算值；(b) 熒光定量PCR檢測(cè)樣品中的pri-miRNA水平，其中材料為Col-0以及sig6-2，UBQ5作為內(nèi)參，檢測(cè)引物為pri-miR167a、pri-miR165a、pri-miR173a共3組，誤差線的數(shù)值為3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的STDEV計(jì)算值；(c) proMIR∶∶GUS染色結(jié)果顯示SIG6影響MIRNA基因啟動(dòng)子的活性，使用的轉(zhuǎn)基因植株包括MIR390a∶∶GUS、MIR778∶∶GUS和MIR172a1∶∶GUS，實(shí)驗(yàn)材料均為6 d的光下苗，GUS染色時(shí)間為5h.

3 討 論

擬南芥擁有超過(guò)300個(gè)MIRNA基因，從影響MIRNA基因整體轉(zhuǎn)錄的角度來(lái)看[13]，TATA盒的核心啟動(dòng)子元素和至少21個(gè)順式調(diào)控的motif被聚集到MIRNA的啟動(dòng)子序列上[14]，暗示了整體上MIRNA的轉(zhuǎn)錄受到很多轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控.MAC(MOS4-ASSOCIATED COMPLEX)是目前研究較多的影響MIRNA基因轉(zhuǎn)錄的蛋白復(fù)合體，在擬南芥中具有抵御外界環(huán)境和調(diào)控生長(zhǎng)發(fā)育的功能，其組分包括CDC5、PRL1、MAC7和MAC3等蛋白.DNA結(jié)合蛋白CDC5(a MYB-related protein)能夠結(jié)合到MIRNA基因上促進(jìn)PolⅡ的轉(zhuǎn)錄[15]；轉(zhuǎn)錄因子PRL1(PLEIOTROPIC REGULATORY LOCUS 1)是一種保守的WD-40蛋白，能夠與CDC5、DCL1、PolⅡ等蛋白產(chǎn)生互作，通過(guò)與pri-miRNA發(fā)生相互作用來(lái)使得miRNA的加工復(fù)合體更穩(wěn)定[16]；MAC7[17]、MAC3[18]和PRL1類(lèi)似，不影響MIRNA啟動(dòng)子的活性和pri-miRNA轉(zhuǎn)錄本的半衰期，但能夠通過(guò)影響HYL1的定位或促進(jìn)DCL1的活性來(lái)使得pri-miRNA更穩(wěn)定.目前，人們認(rèn)為MAC作為一個(gè)復(fù)合體，可以通過(guò)調(diào)控pri-miRNA的形成、加工和穩(wěn)定性來(lái)控制成熟miRNA的水平.除了MAC以外，常規(guī)的轉(zhuǎn)錄輔激活劑Mediator能夠使得PolⅡ被招募到MIRNA基因的啟動(dòng)子中，從而觸發(fā)真核生物中PolⅡ的轉(zhuǎn)錄激活[19].NOT2(NEGATIVE ON TATA LESS 2)能夠與PolⅡ的C端結(jié)構(gòu)域發(fā)生相互作用，從而促進(jìn)PolⅡ的轉(zhuǎn)錄功能[20].細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)的蛋白激酶(包括CDKF1和CDKDs等)也能夠通過(guò)介導(dǎo)調(diào)節(jié)PolⅡ大亞基的C末端結(jié)構(gòu)域(RNAPII-CTD)的磷酸化水平，起到調(diào)控MIRNA基因轉(zhuǎn)錄的作用[21].而我們的研究則發(fā)現(xiàn)在擬南芥中，質(zhì)體Sigma因子6能夠通過(guò)影響MIRNA基因啟動(dòng)子的活性去調(diào)控miRNA的生物合成.

目前已有的關(guān)于SIG6的研究表明，SIG6是Sigma因子家族中的一員，存在于質(zhì)體中，主要通過(guò)調(diào)控質(zhì)體基因的表達(dá)來(lái)參與葉綠體的早期發(fā)育[22].但是在擬南芥中，MIRNA基因的轉(zhuǎn)錄乃至pri-miRNA的后續(xù)加工均發(fā)生在細(xì)胞核中，那么存在于質(zhì)體中的SIG6是如何參與到miRNA的生物合成途徑中的呢？又如何能夠調(diào)控MIRNA基因啟動(dòng)子的活性？我們據(jù)此提出了兩種假設(shè)： 一是SIG6在質(zhì)體中能夠產(chǎn)生逆行信號(hào)反向地去調(diào)控細(xì)胞核的基因表達(dá)，即miRNA的產(chǎn)生可能受到質(zhì)體與細(xì)胞核的相互交流的調(diào)控，提示原核細(xì)菌衍生的葉綠體的基因轉(zhuǎn)錄體系可能在早期miRNA的進(jìn)化上具有一定的作用；二是猜測(cè)SIG6不僅僅存在于質(zhì)體中，在細(xì)胞核中也有一定的分布，并通過(guò)影響PolⅡ?qū)IRNA基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控miRNA的合成.這兩種假設(shè)的正確性需要我們進(jìn)一步地進(jìn)行探究.總體來(lái)說(shuō)，本研究的意義在于提供線索證明質(zhì)體因子能夠以某種機(jī)制影響細(xì)胞核基因的表達(dá)，從而為研究miRNA生物合成途徑提供了新的思路和視角.

致謝：感謝上海師范大學(xué)黃繼榮老師課題組提供的sigma突變體種子.