擬南芥生態(tài)型Zu-0減少主莖分枝的遺傳機(jī)理探究

張 強(qiáng)，潘芳芳，蔡曉蕓，荀道健，張 寧，李 鑫，黃雪清

(1.復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，上海 200438; 2.復(fù)旦大學(xué) 遺傳工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200438)

分枝在植物形態(tài)建成中占有十分重要的地位.高等植物的分枝發(fā)育決定著植物地上株型系統(tǒng)，并與其適應(yīng)環(huán)境的能力密切相關(guān)，直接影響植物的生存競(jìng)爭(zhēng)能力；同時(shí)分枝也是影響作物生物量和結(jié)實(shí)量的重要農(nóng)藝性狀[1].通常農(nóng)作物的分枝通過(guò)影響作物結(jié)實(shí)的多少來(lái)影響產(chǎn)量，比如水稻通過(guò)控制有效分蘗數(shù)目的多少來(lái)提高產(chǎn)量[2]，而玉米則在馴化過(guò)程中通過(guò)減少側(cè)枝數(shù)而增加產(chǎn)量[3].在實(shí)際生產(chǎn)中人們通過(guò)棉花整枝，果樹修剪，增加水稻和小麥分蘗數(shù)，減少玉米分枝數(shù)等措施來(lái)達(dá)到增產(chǎn)的目的.因此徹底闡明植物分枝發(fā)育的調(diào)控機(jī)理，將有助于通過(guò)分子生物學(xué)手段來(lái)改良植物的株型結(jié)構(gòu)，從而提高作物產(chǎn)量，增加植物觀賞性等，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上具有重要意義[4].

植物的莖干系統(tǒng)是由胚胎發(fā)育時(shí)期的主莖頂端分生組織(Shoot Apical Meristem, SAM)以及種子萌發(fā)后形成的其他分生組織形成的.通常植物分枝的形成需兩步完成： 葉腋分生組織起始后形成腋芽和腋芽的生長(zhǎng)[5].植物的側(cè)枝發(fā)生在位于主莖軸葉片的葉腋部位，葉腋分生組織(Axillary Meristem, AM)起始后形成腋芽(側(cè)芽)(axillary bud)，隨后，腋芽有可能繼續(xù)生長(zhǎng)形成一個(gè)側(cè)枝，但也可以進(jìn)入休眠狀態(tài).這兩種狀態(tài)可以相互轉(zhuǎn)換，休眠的腋芽可以被環(huán)境信號(hào)或響應(yīng)發(fā)育程序重新激活，進(jìn)而生長(zhǎng)成側(cè)枝；活動(dòng)狀態(tài)下的腋芽，也可能由于不利其發(fā)育的因素而轉(zhuǎn)變?yōu)樾菝哐?因此植物最終的分枝程度不僅取決于葉腋分生組織的數(shù)量，還取決于腋芽的最終激活生長(zhǎng)數(shù).

近十幾年來(lái)，人們?cè)诜?Solanumlycopersicum)、豌豆(Pisumsativum)、矮牽牛(Petuniahybrida)、玉米(Zeamays)、水稻(Oryzasativa)和擬南芥(Arabidopsisthaliana)中相繼發(fā)現(xiàn)了一系列可以調(diào)控側(cè)芽形成以及打破側(cè)芽休眠后期生長(zhǎng)的關(guān)鍵基因.按照葉腋分生組織形成的過(guò)程可以將這些相關(guān)基因分為三大類.第一類是與葉腋分生組織起始相關(guān)的基因，包括番茄的LS[6]、BL[7]、GOB[8]，擬南芥的LAS[9]、RAX1-3[10]、REV/IFL1[11]、CUC1-3[12]、ROX[13]，水稻的MOC1[14]、LAX[15]，玉米的BA1[16].這類基因一旦突變則不能形成葉腋分生組織[1].第二類是與側(cè)芽生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的基因.屬于這類基因的有擬南芥的AXR1[17]、BRC1[18]、MAX1-4[1]，玉米的TB1[3]，豌豆的RMS1-6[19-20]，矮牽牛的DAD1-3[21-22]以及水稻的D3[23]、HTD1[24-25]、D10[26]、FC1[27].這類基因隱性突變后，不影響側(cè)芽數(shù)量，但不再抑制側(cè)芽的活性，使得側(cè)芽打破休眠開始后期生長(zhǎng)，這也使得這些突變體的分枝數(shù)量遠(yuǎn)多于野生型[5].第三類是與葉腋分生組織起始和后期生長(zhǎng)相關(guān)的基因.現(xiàn)發(fā)現(xiàn)擬南芥中SPS[28]屬于這類.相較于野生型，該基因突變體會(huì)有非常多的分枝，究其原因： 一是在一個(gè)葉腋位置會(huì)產(chǎn)生多個(gè)葉腋分生組織；二是該基因的突變解除了對(duì)腋芽的抑制，使得腋芽生長(zhǎng)成為分枝.

植物分枝發(fā)育，其涉及的調(diào)控途徑多，存在著許多的上位效應(yīng)，誘導(dǎo)突變已無(wú)法滿足其全面研究.而擬南芥的不同生態(tài)型中存在著許多自然遺傳變異，這些變異是擬南芥遺傳研究中巨大的突變體庫(kù)[29]，利用QTL(Quantitative Trait Locus)定位分析，通過(guò)等位基因重組，使得發(fā)現(xiàn)這些被上位效應(yīng)所掩蓋的基因的可能性大大增加.對(duì)分枝性狀進(jìn)行QTL定位分析，能夠從整體上了解調(diào)控側(cè)枝的影響因素，發(fā)現(xiàn)新的基因位點(diǎn)，如Ungerer等定位到與分枝數(shù)相關(guān)的QTL-DF.184在第五染色體[30]；El-Lithy等定位到6個(gè)與主莖分枝數(shù)相關(guān)的QTL和4個(gè)與蓮座分枝相關(guān)的QTL[31].Huang等利用AMPRIL群體檢測(cè)到8個(gè)減少主莖分枝的QTL[32].

已有的研究發(fā)現(xiàn)，減少主莖分枝(Reduced Stem Branching, RSB)表型與開花時(shí)間密切相關(guān)，RSB表型只出現(xiàn)在晚花植株中.由于實(shí)驗(yàn)室常用的擬南芥生態(tài)型Col、Ler、Ws等均為早花背景，加上較低的自然變異率，在晚花背景的擬南芥生態(tài)型中，RSB表型也較為罕見(jiàn).Kalinina等曾在2002年報(bào)道起源于瑞士的擬南芥生態(tài)型Zurich-0(Zu-0)也有相似的RSB表型，主莖上缺少分枝，葉腋處沒(méi)有AM[33].但迄今為止Zu-0中有關(guān)RSB表型的分子遺傳機(jī)制尚未被報(bào)道.我們將其和Col-0雜交構(gòu)建重組自交系(Recombinant Inbred Lines, RIL)群體，以期找到新的有關(guān)RSB的QTL，為進(jìn)一步了解分枝形成的分子遺傳機(jī)制提供新思路.

1 材料和方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)所使用的植物材料主要是擬南芥Col-0(Columbia-0)生態(tài)型和Zu-0(Zurich-0)生態(tài)型為親本構(gòu)建的重組自交系群體.這些材料均由本實(shí)驗(yàn)室保存.

1.2 方法

1.2.1 擬南芥的種植

擬南芥種子4℃春化2～3d后，點(diǎn)播在吸好水的混合營(yíng)養(yǎng)土表面，覆蓋保鮮罩以保持濕度，在溫室(溫度22℃，濕度60%，光周期： 16h光照/8h黑暗)中培養(yǎng)，等發(fā)芽后取下罩子，10周左右果莢呈褐黃色并開裂，可收取種子.

1.2.2 構(gòu)建RIL群體

Col-0×Zu-0雜交得到的F2代種植237株，種植后每個(gè)單株均自交，得到有效F4代植株共192株，最終在F4代建立含有192株的RIL群體.

1.2.3 RSB表型統(tǒng)計(jì)方式

擬南芥始花后一周左右，測(cè)定主莖上的側(cè)枝數(shù)和葉腋數(shù)，RSB=主莖分枝數(shù)/主莖葉腋數(shù)，RSB=0代表主莖上沒(méi)有分枝，RSB=1代表主莖每個(gè)葉腋都長(zhǎng)出了側(cè)枝.

1.2.4 分離群體分組分析法(Bulked Segregant Analysis, BSA)鑒定基因型

由于調(diào)控花期的基因和控制著主莖分枝數(shù)的基因存在著一些上位效應(yīng)[32,34]，RSB頻率分布統(tǒng)計(jì)圖并不是標(biāo)準(zhǔn)的正態(tài)分布，故利用BSA(晚花遺傳背景下選擇多側(cè)枝(RSB=1)和無(wú)側(cè)枝(RSB≈0)作為2個(gè)基因池(gene pool))篩選與RSB性狀相關(guān)緊密連鎖的分子標(biāo)記，再使用Duncan test統(tǒng)計(jì)分析將這些緊密連鎖的分子標(biāo)記在晚花背景下的群體中進(jìn)行標(biāo)記-表型連鎖分析驗(yàn)證，得到初定位QTL.

1.2.5 物理圖譜構(gòu)建

使用Map Chart作圖軟件，根據(jù)已篩選出的雙親間具有多態(tài)性SSR分子標(biāo)記，及該分子標(biāo)記所在的染色體及物理位置，繪制Col-0×Zu-0群體的物理圖譜.

1.2.6 總RNA提取和實(shí)時(shí)定量RT-PCR分析

將已在短日照下生長(zhǎng)28d的植株，移至長(zhǎng)日照下，取葉腋尖端帶提取總RNA.根據(jù)植物總RNA提取試劑盒(TIANGEN)的使用說(shuō)明提取RNA，總RNA保存在-80℃，總RNA用M-MLV(TaKaRa)反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，保存在-20℃.實(shí)時(shí)定量PCR使用的試劑為SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(TaKaRa)，定量實(shí)驗(yàn)在Bio-Rad CFX96TM儀器上運(yùn)行，得到數(shù)據(jù)后分析.

1.2.7 QTL定位結(jié)果的驗(yàn)證

從RIL群體中挑選出只在各自目標(biāo)QTL區(qū)雜合而在其他QTL區(qū)純合的株系，通過(guò)自交構(gòu)建雜合自交家系(Heterogeneous Inbred Families, HIF)群體.統(tǒng)計(jì)HIF各株系的RSB性狀，并鑒定其基因型，驗(yàn)證QTL的等位基因效應(yīng).

2 結(jié)果與分析

2.1 親本及F4群體RSB性狀表型值的描述性統(tǒng)計(jì)

我們對(duì)Zu-0生態(tài)型和Col-0生態(tài)型進(jìn)行了RSB性狀的表型值測(cè)定和相關(guān)的分析.如圖1所示，Zu-0主莖上的葉腋基本上沒(méi)有長(zhǎng)出側(cè)枝(RSB平均值為0.24，n=25)；與Zu-0相比，Col-0主莖上的葉腋處大都長(zhǎng)出了側(cè)枝(RSB平均值為1，n=32)，說(shuō)明RSB表型在雙親之間差異比較明顯.

1) 所統(tǒng)計(jì)株數(shù)均≥15株，使用Duncan test統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05.

此外，我們對(duì)F4群體RSB表型均值頻數(shù)分布分析(圖2(a))，RSB性狀在F4群體中并不呈現(xiàn)正態(tài)分布.這是因?yàn)榛ㄆ谂c分枝形成存在著上位效應(yīng)[32].兩親本的開花時(shí)間具有明顯差異，Zu-0比Col-0平均晚40d開花(表1).該群體的早花的植株的RSB均為1，只有晚花植株的RSB出現(xiàn)分離(圖2(b)).因此，我們利用BSA法來(lái)進(jìn)行QTL初定位.

圖1 Zu-0和Col-0關(guān)于RSB性狀的比較Fig.1 Comparison of the RSB phenotype between Zu-0 and Col-0箭頭表示其主莖大部分葉腋處沒(méi)有分枝.

圖2 F4群體RSB表型分析Fig.2 Analysis of RSB phenotype in F4 population(a) RSB表型在F4群體中的頻率分布圖；(b) 在F4中，花期和RSB的性狀分離.

2.2 擬南芥物理圖譜的構(gòu)建及RSB性狀QTL的定位與遺傳分析

在F4中，晚花遺傳背景下，挑選出多側(cè)枝(RSB=1)和無(wú)側(cè)枝(RSB≈0)，各12株，提取基因組DNA，混合，組成Zu-0池和Col-0池.從Tair中(http：∥www.arabidopsis.org/)選出均勻覆蓋擬南芥全基因組5條染色體的SSR引物，篩選出71個(gè)在兩親本之間存在多態(tài)性的SSR分子標(biāo)記.按照各SSR在Col生態(tài)型基因組序列中的物理位置，繪制出物理圖譜(圖3).71個(gè)SSR分子標(biāo)記覆蓋擬南芥5條染色體，每條染色體上的標(biāo)記數(shù)目在12～19之間，平均每條染色體上有14.2個(gè)標(biāo)記；物理圖譜總長(zhǎng)度119.63Mb，相鄰兩個(gè)標(biāo)記間的平均圖距為1.7Mb，最大圖距為3.3Mb，最小圖距為0.5Mb.用這71個(gè)標(biāo)記在兩基因池中鑒定出與RSB性狀相關(guān)緊密連鎖的分子標(biāo)記有13個(gè)，然后再用這13個(gè)分子標(biāo)記對(duì)F2群體做標(biāo)記-表型連鎖分析，以排除假陽(yáng)性標(biāo)記.最終定位到與RSB性狀相關(guān)的4個(gè)QTL，分別是qRSBZu-1(位于2號(hào)染色體末端，跨度3.0Mb)、qRSBZu-2(位于4號(hào)染色體上端，跨度2.7Mb)、qRSBZu-3(位于5號(hào)染色體上端，跨度3.7Mb)、qRSBZu-4(位于5號(hào)染色體中下部，跨度4.2Mb)(圖3).

圖3 物理圖譜及與RSB性狀相關(guān)QTLFig.3 The physical map and QTL which showed significant correlation with RSB phenotype

2.3 QTL定位結(jié)果的分析和驗(yàn)證

對(duì)4個(gè)QTL進(jìn)行初步分析后，發(fā)現(xiàn)qRSBZu-1區(qū)域含有與已知的減少分枝形成相關(guān)基因AGL6[34]，但對(duì)Zu-0AGL6的ORF測(cè)序，并沒(méi)有在其外顯子中找到有義突變，我們進(jìn)一步測(cè)定了AGL6在生殖生長(zhǎng)發(fā)育不同時(shí)期的表達(dá)量(圖4)，發(fā)現(xiàn)Col-0和Zu-0之間并沒(méi)有明顯的差異，因此我們推測(cè)在qRSBZu-1中是其他基因引起了RSB性狀.

圖4 AGL6在形態(tài)發(fā)育階段的相對(duì)表達(dá)量Fig.4 The relative expression level of AGL6 in different development stage總RNA提取于擬南芥發(fā)育的不同時(shí)期的經(jīng)過(guò)短日照到長(zhǎng)日照處理的SAM，ACTIN8作為內(nèi)參.

在qRSBZu-2中包含了FRI[35]，qRSBZu-3包含了FLC[36-37]，F(xiàn)RI和FLC是開花時(shí)間調(diào)控的關(guān)鍵基因，它們控制開花時(shí)間的同時(shí)也調(diào)控減少主莖分枝表型[32].在本研究中，親本Zu-0是晚花生態(tài)型，Col-0是早花生態(tài)型，在它們的F2群體中，早花植株沒(méi)有表現(xiàn)出RSB性狀，只有在晚花背景下RSB性狀才出現(xiàn)分離.我們推測(cè)qRSBZu-2和qRSBZu-3的候選基因就是FRI和FLC基因，并對(duì)其ORF測(cè)序，發(fā)現(xiàn)qRSBZu-2和qRSBZu-3在Zu-0和Col-0之間確實(shí)存在著突變.

qRSBZu-4也包含了與分枝形成相關(guān)基因CUC2[38]，對(duì)Zu-0CUC2的ORF測(cè)序，并沒(méi)有在其外顯子中找到有義突變，因此我們推測(cè)在qRSBZu-4中CUC2啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)生了突變或者還有其他基因引起了RSB性狀.

圖5 QTL的等位基因效應(yīng)驗(yàn)證Fig.5 The validation for the allele effect of QTL(a) 構(gòu)建zb52 HIF群體驗(yàn)證qRSBZu-1;(b) 構(gòu)建zb67 HIF群體驗(yàn)證qRSBZu-4.每個(gè)表型所統(tǒng)計(jì)株數(shù)均≥15株，使用Duncan test統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05.

我們選擇了感興趣的qRSBZu-1和qRSBZu-4進(jìn)行驗(yàn)證.在F4群體中找到了zb52(qRSBZu-1雜合，其他QTL區(qū)純合)和zb67(qRSBZu-4雜合，其他QTL區(qū)純合)株系，分別使它們自交，建立HIF群體，觀察統(tǒng)計(jì)HIF各株系的RSB性狀，并鑒定其基因型，目標(biāo)QTL驗(yàn)證結(jié)果見(jiàn)圖5.在每個(gè)群體內(nèi)目標(biāo)QTL區(qū)間，具有Col-0等位基因的植株表型均值與具有Zu-0等位基因的植株表型均值存在著顯著差異.這一結(jié)果反映出我們定位到的QTL結(jié)果是可靠的.我們可以在此基礎(chǔ)上對(duì)目標(biāo)QTL進(jìn)行精細(xì)定位和圖位克隆，進(jìn)一步開展RSB性狀的分子遺傳機(jī)理的研究.

3 討 論

我們選取了實(shí)驗(yàn)室常用擬南芥生態(tài)型Col-0和主莖上沒(méi)有側(cè)枝的Zu-0作為親本材料，構(gòu)建了共有192個(gè)株系的RIL群體，但由于上位作用的存在，RSB的頻率分布不呈正態(tài)分布，故使用BSA法實(shí)現(xiàn)了對(duì)RSB的QTL定位，共定位到RSB相關(guān)性狀QTL4個(gè)，分別是qRSBZu-1、qRSBZu-2、qRSBZu-3、qRSBZu-4.

qRSBZu-1和2012年Huang等定位到的同樣與RSB表型相關(guān)的QTL——RSB1[34]重疊，qRSBZu-2和FRIGIDA(FRI)[35]重疊，qRSBZu-3和FLC[36-37]重疊，間接證明了我們QTL定位結(jié)果是可信的、真實(shí)的.同時(shí)，我們構(gòu)建HIF群體，對(duì)qRSBZu-1和qRSBZu-4進(jìn)行等位基因效應(yīng)驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果進(jìn)一步提高了我們的QTL定位結(jié)果的可信度.本研究的結(jié)果在擬合了先前研究結(jié)果的基礎(chǔ)上有新的發(fā)現(xiàn)，說(shuō)明本研究選取的親本材料在控制RSB相關(guān)性狀上具有更多、更復(fù)雜的遺傳多樣性，從而能得到更多的遺傳信息.

我們對(duì)qRSBZu-1中的Zu-0AGL6測(cè)序，其外顯子沒(méi)有找到有義突變，并且相較于Col-0，Zu-0的AGL6在生殖生長(zhǎng)發(fā)育不同時(shí)期表達(dá)量沒(méi)有顯著性差異；另外Zu-0的qRSBZu-1相對(duì)Col-0呈隱性，而C24中AGL6相對(duì)Col-0呈顯性[34].因此我們有理由相信在qRSBZu-1中還存在著其他基因參與了RSB性狀的調(diào)控.

qRSBZu-4中包含了已經(jīng)被報(bào)道的調(diào)控分枝發(fā)育的CUC2基因[38].然而在cuc-2突變體中，表型是主莖的節(jié)點(diǎn)顯著性減少，在主莖和蓮座的葉腋處形成額外的腋芽[12]，這無(wú)法完全解釋Zu-0主莖處的葉腋無(wú)法形成并且節(jié)點(diǎn)沒(méi)有明顯減少的表型.且對(duì)Zu-0的CUC2的ORF測(cè)序，在外顯子區(qū)域沒(méi)有找到有義突變.我們將測(cè)定Zu-0中CUC2在生殖生長(zhǎng)發(fā)育不同時(shí)期的表達(dá)量，以此排除CUC2作為qRSBZu-4的候選基因的可能性.

下一步的研究主要集中在對(duì)qRSBZu-1和qRSBZu-4的精細(xì)定位，用分子遺傳學(xué)手段對(duì)qRSBZu-1和qRSBZu-4進(jìn)行克隆和鑒定.進(jìn)一步綜合運(yùn)用生理生化，分子生物和組學(xué)等現(xiàn)代生物技術(shù)手段對(duì)qRSBZu-1和qRSBZu-4在植物分枝調(diào)控中的作用機(jī)理進(jìn)行全面深入的研究，以期豐富植物調(diào)控分枝的特異性分子網(wǎng)絡(luò)，為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)分子育種提供理論依據(jù).