高效液相色譜法同時測定小兒補腎固表顆粒中6種成分的含量

楊輝， 潘東明， 戚歡陽， 黃亦琦， 羅友華， 張青玲， 薛征， 虞堅爾， 褚克丹

小兒反復呼吸道感染簡稱復感，是兒科的多發(fā)病和常見病，其發(fā)病與免疫功能低下密切相關(guān)[1]。小兒補腎固表顆粒是由補骨脂、黃芪、防風、黃芩、柴胡等中藥組成[2]，具有補腎益元氣、固表實肺衛(wèi)之功效，用于肺腎不足，余邪未盡所致的小兒反復呼吸道感染[3-4]?？捎行Ц纳萍毎庖呒绑w液免疫功能的紊亂狀態(tài)，提高免疫功能，是一種安全、有效的防治小兒復感藥物[5-7]。

本品化學成分復雜，補骨脂和黃芪共為方中君藥，補骨脂中主要成分補骨脂素和異補骨脂素均有抗菌、免疫調(diào)節(jié)等作用[8-9]；黃芪中黃酮類成分具有提高免疫力的作用，其中毛蕊異黃酮葡萄糖苷為其主要有效成分[10]。防風為方中臣藥，升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷是防風中重要的有效成分[11]，具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎等作用[12]；黃芩為方中佐藥，其中的黃芩苷等黃酮類成分具有抗炎活性[13-14]，是黃芩中最重要的活性成分之一。單一指標成分控制不能保證中藥復方制劑的整體療效。為了更全面的對小兒補腎固表顆粒的質(zhì)量進行控制，本文建立了高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)法同時測定其6種活性成分的含量，為小兒補腎固表顆粒質(zhì)量標準規(guī)范化研究提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器 Agilent 1260高效液相色譜儀，四元泵，自動進樣器，恒溫箱，DAD紫外檢測器，Chem station色譜工作站(美國Agilent公司)，Agilent Zorbox Eclipse XDB C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，美國Agilent公司)；XS205電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司，d=0.01 mg)；KQ-500VDB型三頻數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器公司)。

1.2 藥品 甲醇(批號：13080417，色譜純，Tedia公司)；乙腈(批號：13020466，色譜純，Tedia公司)；甲酸(批號：20100605，分析純，廣東光華化學廠公司)；哇哈哈飲用純凈水(批號：20171114，廈門哇哈哈飲料公司)。對照品(升麻素苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、黃芩苷、補骨脂素和異補骨脂素，成都曼斯特生物科技公司，批號：MUST-18040310，MUST-18031920，MUST-18031502，MUST-18010410，MUST-17092820，MUST-17062204，純度均≥98%)。小兒補腎固表顆粒為廈門市醫(yī)藥研究所自制，3批(批號：20180401，20180424，20180425)。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件色譜柱 Agilent Zorbox Eclipse XDB C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為乙腈(A)-0.2%甲酸水溶液(B)梯度洗脫(0～5 min，10%～15% A；5～7 min，15%～16% A；7～9 min，16%～16.2% A；9～15 min，16.2%～16.3% A；15～22 min，16.3%～17.5% A；22～25 min，17.5%～31% A；25～42 min，31%～40% A；42～54 min，40%～60% A；54～65 min，60%～95% A)，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，進樣量10 μL，檢測波長254 nm和280 nm。

1.3.2 對照品溶液的配制

1.3.2.1 對照品儲備液的配制 分別精密稱取升麻素苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、黃芩苷、補骨脂素和異補骨脂素對照品適量于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，制成濃度分別為0.882、0.304、0.860、3.010、0.762、1.016 g/L的升麻素苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、黃芩苷、補骨脂素和異補骨脂素對照品儲備液。

1.3.2.2 混合對照品溶液的配制 分別精密量取上述對照品儲備液適量，加甲醇定容，分別制成濃度為88.20、30.40、86.00、1 204.00、60.96、81.28 mg/L的升麻素苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、黃芩苷、補骨脂素和異補骨脂素混合對照品溶液。

1.3.3 供試品溶液的制備 取小兒補腎固表顆粒樣品1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加20 mL甲醇，稱定質(zhì)量，超聲處理(頻率80 Hz，功率100%)40 min，放冷，稱量，用甲醇補足減失質(zhì)量，搖均，過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

1.3.4 陰性對照樣品溶液的制備 按小兒補腎固表顆粒處方比例及工藝，分別制備缺少防風、黃芪、黃芩、補骨脂及空白的陰性對照樣品，并按“1.3.3”項下方法制備各陰性對照樣品溶液。

1.4 專屬性 分別移取“1.3.2～1.3.4”項下的各溶液適量，依次注入高效液相色譜儀，按“1.3.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。

1.5 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“1.3.2.2”項下的混合對照品溶液用甲醇稀釋成6個不同質(zhì)量濃度的對照品溶液，分別按“1.3.1”項下色譜條件各進樣10 μL，記錄相應峰面積，以各成分對照品質(zhì)量濃度(mg/L)為橫坐標(X)，以峰面積(Y)為縱坐標繪制標準曲線，得到回歸方程及相關(guān)系數(shù)。將混合對照品溶液稀釋至一定濃度進樣，使S/N為3及10的各成分對照品質(zhì)量即為檢測下限及定量下限。

1.6 精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液，按“1.3.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄峰面積。

1.7 重復性試驗 取同一批次樣品(批號：20180424)，按“1.3.3”項下方法平行制備供試品溶液6份，于“1.3.1”項下色譜條件進行分析。以外標法計算樣品中升麻素苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、黃芩苷、補骨脂素和異補骨脂素的平均質(zhì)量分數(shù)和記錄峰面積。

1.8 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液(批號：20180424)，在室溫下放置，分別在0、2、4、8、12、24 h后在“1.3.1”項下色譜條件進行分析，記錄峰面積。

1.9 加樣回收率試驗 精密稱取已測知含量的同一批號(批號：20180424)樣品9份，每份約1 g，分成3組，每組3份，分別加入高、中、低3個質(zhì)量濃度的對照品混合液，按照“1.3.3”項下方法制備供試品溶液，按照“1.3.1”項下色譜條件進行測定，計算加樣回收率。

1.10 樣品含量測定 取各批號的小兒補腎固表顆粒樣品，精密稱定，按“1.3.3”項下方法制備供試品溶液，于“1.3.1”項下色譜條件進行測定，采用回歸方程計算含量。

2 結(jié)果

2.1 各樣品色譜測定結(jié)果 升麻素苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、黃芩苷、補骨脂素、異補骨脂素的專屬性較強，陰性對照溶液圖譜顯示陰性樣品無干擾，該方法專屬性較好，見圖1(封三)。

2.2 6種成分的線性關(guān)系考察結(jié)果 見表1。

表1 6種成分的線性關(guān)系考察結(jié)果

表1結(jié)果表明，6種成分在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與峰面積呈較好的線性關(guān)系。

2.3 精密度試驗結(jié)果 樣品中升麻素苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、黃芩苷、補骨脂素和異補骨脂素峰面積的RSD分別為1.37%、1.01%、1.16%、0.69%、1.22%、0.87%，表明儀器精密度良好。

2.4 重復性試驗結(jié)果 樣品中升麻素苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、黃芩苷、補骨脂素和異補骨脂素的平均質(zhì)量分數(shù)分別為0.56、0.14、0.45、13.71、0.34、0.86 mg/g；RSD分別為2.21%、2.32%、2.31%、2.05%、2.10%、1.34%。

2.5 穩(wěn)定性試驗結(jié)果 樣品中升麻素苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、黃芩苷、補骨脂素和異補骨脂素峰面積的RSD分別為2.40%、1.88%、2.26%、1.14%、1.64%、1.65%，結(jié)果表明供試品溶液室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 樣品含量測定結(jié)果 3批次中黃芩苷含量最高，且不同批次中該成分含量差異較大，其余5種成分含量較低，在不同批次中成分含量差異較小，見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果(mg/g)

2.7 加樣回收率試驗結(jié)果 本測定方法的加樣回收率良好,見表3。

3 討論

本研究首次建立了HPLC法同時測定小兒補腎固表顆粒中6種指標成分的方法，該方法高效、準確，為小兒補腎固表顆粒的質(zhì)量控制提供了研究基礎。

中藥復方的藥效物質(zhì)基礎是十分復雜的，單指標的含量測定難以客觀體現(xiàn)全方的藥效成分，相對而言多成分指標的定量測定更適合中藥復方的質(zhì)量評價。本實驗中6種成分的選擇是基于2015年版《中國藥典》[15]并參考相關(guān)文獻方法[8-14]。一方面考慮到其藥理活性，具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎等活性，另一方面是參考藥典中相關(guān)藥材的指標性成分，最終確定補骨脂中指標成分為補骨脂素及異補骨脂素，黃芪的指標成分為毛蕊異黃酮葡萄糖苷，防風的指標成分為升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷，黃芩的指標成分為黃芩苷，通過多成分含量測定客觀反應小兒補腎固表顆粒的質(zhì)量。

表3 6種加樣回收率試驗結(jié)果

本實驗測定的小兒補腎固表顆粒中的6種成分涉及3類成分，包括黃酮類、香豆素類及色原酮類，各自的最大吸收范圍為238～280 nm。參考2015版藥典中相關(guān)成分檢測波長的選擇[10]及經(jīng)全波長掃描并兼顧6種成分最大吸收波長，確定檢測波長，升麻素苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、補骨脂素和異補骨脂素為254 nm，黃芩苷為280 nm，以建立色譜條件。由于黃芪中黃芪甲苷及柴胡中柴胡皂苷a、柴胡皂苷d等皂苷類成分是紫外末端吸收，最大吸收波長是203 nm左右，干擾較大，常運用蒸發(fā)光散射檢測器測定，考慮在下一步實驗中采用蒸發(fā)光散射檢測器對小兒補腎固表顆粒中的皂苷類成分進行測定，因而本實驗并未采用紫外檢測器對該類成分進行測定。

對供試品溶液制備條件進行了系統(tǒng)考察。首先對超聲、冷浸、加熱回流3種提取方式進行考察，其中超聲提取的方式最為簡便、高效；其次分別選取甲醇、乙醇、水為溶劑，對同一樣品超聲提取40 min，比較待測化合物的峰面積，發(fā)現(xiàn)甲醇做提取溶劑時，各色譜峰的峰面積總和較大。綜合分析最終確定了采用甲醇超聲提取的方式。

對色譜條件的選擇進行了系統(tǒng)考察。本實驗首先考察了甲醇-水，乙腈-水等不同流動相體系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙腈-水溶液洗脫體統(tǒng)下各成分分離度較佳，且梯度洗脫過程中基線平穩(wěn)，因此選擇乙腈-水系統(tǒng)。為了改善峰形，把流動相調(diào)整為弱酸性，提高分離度。其次考察了在水相中添加0.1%、0.15%、0.2%、0.4%的甲酸溶液，結(jié)果發(fā)現(xiàn)0.2%的甲酸溶液可以達到改善峰形及提高分離度的效果，因此選用0.2%磷酸水溶液作為流動相的水相。最后考察了5、10、15、20 μL進樣量，結(jié)果表明10 μL進樣量時峰形好，基線平穩(wěn)。