利用綠色熒光蛋白報(bào)告基因篩選植物乳桿菌強(qiáng)啟動(dòng)子

薩初拉，吳青海，，白蘇樂，其布日，，高 娃，，連海飛，蘇少鋒，常 琰，付紹印，呼 和

（1.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031；2.天津科技大學(xué)，天津 300457；3.巴彥淖爾市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，內(nèi)蒙古 臨河區(qū) 015000）

乳酸菌被公認(rèn)為是安全的食品級(jí)微生物（GRAS）［1-2］，植物乳桿菌在發(fā)酵飼料、青貯飼料、微生態(tài)制劑、醫(yī)藥及食品等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用［3-5］。 使用基因工程手段修飾改造植物乳桿菌， 可釋放更大的應(yīng)用潛力。 植物乳桿菌具有高氧耐受能力和生長(zhǎng)發(fā)酵穩(wěn)定性， 作為宿主表達(dá)重組蛋白方面的應(yīng)用越來(lái)越受到人們的重視［6-8］。 隨著基因工程技術(shù)的迅猛發(fā)展，目前綜合利用基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)及細(xì)胞工程手段［9-10］提高化合物、代謝產(chǎn)物及酶產(chǎn)量的研究已成為熱點(diǎn)［11］。 Van Kranenburg 等［12］對(duì)來(lái)自植物乳桿菌隱蔽質(zhì)粒pWCFS101、pWCFS102進(jìn)行了分析，同時(shí)利用其復(fù)制子構(gòu)建了克隆載體。在植物乳桿菌表達(dá)系統(tǒng)中， 研究比較成熟的是pSIP 系統(tǒng)。 S?rvig 等［13-14］在pSIP300 和pSIP400 系列基礎(chǔ)上構(gòu)建了通用表達(dá)載體。在此基礎(chǔ)上，通過(guò)引入乳桿菌素A 及乳桿菌素P 基因的啟動(dòng)子進(jìn)一步構(gòu)建了pSIP500 系列載體。 pSIP 系統(tǒng)是以細(xì)菌素Sakacin A 為誘導(dǎo)物的誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng)，該表達(dá)系統(tǒng)避免了宿主細(xì)胞過(guò)表達(dá)而中毒及新陳代謝的干擾，但需要添加細(xì)菌素Sakacin A 誘導(dǎo)表達(dá)，因此，不適合應(yīng)用于飼料及食品的發(fā)酵和腸道環(huán)境［15］。

國(guó)內(nèi)植物乳桿菌作為外源基因表達(dá)宿主的研究起步較晚， 近些年來(lái)的研究主要集中在植物乳桿菌內(nèi)含質(zhì)粒研究及利用pSIP 系統(tǒng)表達(dá)異源蛋白上， 而自主研發(fā)植物乳桿菌表達(dá)載體方面報(bào)道較少。 鐘澤民等［16］以商品化乳桿菌表達(dá)載體pIAβ8 為骨架， 結(jié)合干酪乳桿菌超強(qiáng)組成型啟動(dòng)子SCP 以及M6 前體蛋白信號(hào)肽SP、豬表皮生長(zhǎng)因子pEGF 基因等元件， 構(gòu)建可以表達(dá)具有生物學(xué)活性pEGF 的植物乳桿菌表達(dá)載體pSCPS。 但表達(dá)載體pSCPS 的骨架pIAβ8 含有來(lái)源于大腸桿菌的復(fù)制子、 氨芐青霉素抗性基因和氯霉素抗性基因，不符合食品級(jí)應(yīng)用要求［17］。

微生物基因表達(dá)水平主要與啟動(dòng)子強(qiáng)度［18］、基因拷貝數(shù)［19］、表達(dá)蛋白分泌到胞外效率［20］等有關(guān)。 組成型啟動(dòng)子即持續(xù)性啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，可用作調(diào)控元件構(gòu)建表達(dá)載體，實(shí)現(xiàn)目的蛋白在胞內(nèi)外大量表達(dá)。 但目前在植物乳桿菌基因工程改造中， 可實(shí)際應(yīng)用的組成型啟動(dòng)子資源很有限。為構(gòu)建植物乳桿菌高效特異表達(dá)載體，該研究以綠色熒光蛋白基因（GFP）作為報(bào)告基因，使用啟動(dòng)子Pefp（來(lái)自布赫內(nèi)氏乳桿菌）、Ptuf34（來(lái)自布赫內(nèi)氏乳桿菌）、Ptuf33 （來(lái)自植物乳桿菌）、P11（來(lái)自植物乳桿菌）替換pMG36e 載體原有P32 啟動(dòng)子。隨后將該載體轉(zhuǎn)化至植物乳桿菌H18 中，檢測(cè)啟動(dòng)子在植物乳桿菌中啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的有效性、廣泛性和強(qiáng)弱特性， 從而為后續(xù)構(gòu)建高表達(dá)植物乳桿菌載體提供良好的研究基礎(chǔ)和基因元件。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌種大腸桿菌Top10 感受態(tài)細(xì)胞（CB104）購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；植物乳桿菌H18 由內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心提供。

1.1.2 主要試劑紅霉素（A600192）購(gòu)自上海生工生物工程 （上海） 股份有限公司，LB 培養(yǎng)基（HB0128）和MRS 培養(yǎng)基（HB0384）購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司， 瓊脂 （N8290） 和瓊脂糖（A8201） 購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，EcoRⅠ限 制 性 內(nèi) 切 酶 （1611），Hind Ⅲ限 制 性 內(nèi) 切 酶（1615） 購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù) （北京） 有限公司。pMG36e 表達(dá)載體（VECT75336）購(gòu)自北京興華越洋生物科技有限公司， 中量質(zhì)粒提取試劑盒（DP106）購(gòu)自天根生化科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 序列合成與測(cè)序委托南京金斯瑞生物科技有限公司依照表1 完成序列合成， 一代測(cè)序由上海生工生物工程（北京）股份有限公司完成。 合成的正確片段于-20 ℃保存，用于后續(xù)載體構(gòu)建。

表1 啟動(dòng)子、熒光素酶報(bào)告基因及引物的合成

1.2.2 亞克隆的制備及鑒定將合成的正確片段利用EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切連接至pMG36e 載體，轉(zhuǎn)化至Top10 感受態(tài)細(xì)胞，利用含有紅霉素的LB 瓊脂培養(yǎng)基篩選陽(yáng)性克隆。 取生長(zhǎng)的陽(yáng)性克隆進(jìn)行擴(kuò)培， 進(jìn)一步利用天根質(zhì)粒提取試劑盒依照說(shuō)明書進(jìn)行質(zhì)粒提取。 取約300 ng 質(zhì)粒， 利用EcoRⅠ和HindⅢ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行37 ℃水浴酶切40 min，將質(zhì)粒和酶切產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。 將電泳正確的克隆質(zhì)粒送至上海生工北京分部進(jìn)行目的片段的測(cè)序，測(cè)序正確的克隆質(zhì)粒于-20 ℃保存，用于后續(xù)植物乳桿菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 植物乳桿菌感受態(tài)制備取20 mL 培養(yǎng)至OD600nm值為0.6 左右的經(jīng)甘氨酸處理的H18 植物乳桿菌培養(yǎng)物，離心收集菌體，用冷的SG 緩沖液洗滌并離心收集菌體，重復(fù)2 次。 利用500 μL SG緩沖液重懸菌體， 每離心管分裝60 μL，-80 ℃冷凍保存，待用。

1.2.4 H18感受態(tài)轉(zhuǎn)化取約1 μg 測(cè)序正確的質(zhì)粒與H18 植物乳桿菌感受態(tài)混合， 利用伯樂電轉(zhuǎn)儀， 選擇1.5 kV、400 Ω、25 μF 參數(shù)進(jìn)行植物乳桿菌的電轉(zhuǎn)。 電轉(zhuǎn)物重懸于MRS 培養(yǎng)基內(nèi)，32 ℃培養(yǎng)2 h 后涂布于含有紅霉素抗性的MRS 瓊脂固體培養(yǎng)基，32 ℃培養(yǎng)篩選。

1.2.5 H18重組子鑒定利用天根質(zhì)粒提取試劑盒對(duì)長(zhǎng)出的克隆進(jìn)行質(zhì)粒提取， 并利用36echeck1-1 引物檢測(cè)目的片段。

1.2.6 熒光強(qiáng)度的測(cè)定取1 mL PCR 檢測(cè)呈陽(yáng)性的H18 植物乳桿菌重組子培養(yǎng)物， 離心收集菌體后利用生理鹽水洗滌收集菌體，200 μL 生理鹽水重懸菌體。取少量重懸菌體利用Nikon 熒光顯微鏡觀察綠色熒光表達(dá)情況， 結(jié)果如圖3 所示。 取100 μL 重懸菌液至96 孔板，利用Thermo Varioskan Flash 酶標(biāo)儀在激發(fā)光395 nm 和發(fā)射光509 nm 條件下測(cè)定熒光強(qiáng)度，同時(shí)檢測(cè)600 nm 下的OD 值。通過(guò)計(jì)算單位OD600nm下的熒光強(qiáng)度獲得樣本的相對(duì)熒光強(qiáng)度（RFI），野生型H18 為陰性對(duì)照。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)分析利用GraphPad Prism 軟件對(duì)測(cè)得的熒光強(qiáng)度值進(jìn)行Ordinary One-Way ANOVA分析，并標(biāo)注顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 亞克隆質(zhì)粒鑒定

由圖1 可知， 所有合成片段獲得酶切正確的陽(yáng)性克隆。 通過(guò)測(cè)序結(jié)果得知構(gòu)建的表達(dá)載體均含有序列完全正確的陽(yáng)性克隆。

圖1 pMG36e-promoter-GFP 載體質(zhì)粒及酶切產(chǎn)物電泳圖

2.2 植物乳桿菌重組子的鑒定

由圖2 可知，PCR 結(jié)果顯示每個(gè)表達(dá)載體均獲得部分陽(yáng)性克隆。 革蘭陽(yáng)性細(xì)菌具有特殊的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)， 所以提取高純度和濃度的質(zhì)粒有一定難度，部分陽(yáng)性克隆條帶較弱。

圖2 H18 重組子目的片段PCR 產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)圖

2.3 植物乳桿菌重組子熒光檢測(cè)

由圖3 可知， 在熒光顯微鏡下可以觀察到植物乳桿菌重組子均有熒光信號(hào)， 除了轉(zhuǎn)化pMG36e_Pefp-GFP 質(zhì)粒的H18 重組子均具有較強(qiáng)的熒光信號(hào)。 為更好地定量熒光信號(hào)，利用酶標(biāo)儀檢測(cè)600 nm 下的OD 值， 并據(jù)此計(jì)算相對(duì)熒光強(qiáng)度， 結(jié)果如圖4 所示。 由結(jié)果可知轉(zhuǎn)化pMG36e_Ptuf33-GFP 和pMG36e_Ptuf34-GFP 質(zhì)粒H18 重組子相對(duì)熒光信號(hào)最強(qiáng)， 其相對(duì)熒光強(qiáng)度平均值分別為3.35 和3.51， 極顯著 （P<0.01）高于其他組。 而轉(zhuǎn)化pMG36e_P11-GFP 質(zhì)粒H18 重組子平均相對(duì)熒光強(qiáng)度為2.699，同樣極顯著（P<0.01）高于轉(zhuǎn)化pMG36e_Pefp-GFP 質(zhì)粒H18 重組子和陰性對(duì)照組的相對(duì)熒光強(qiáng)度。該研究中轉(zhuǎn)化pMG36e_Pefp-GFP 質(zhì)粒H18 重組子相對(duì)熒光強(qiáng)度與陰性對(duì)照無(wú)顯著差異，說(shuō)明Pefp 啟動(dòng)子無(wú)法在植物乳桿菌H18 中強(qiáng)表達(dá)目的基因。

圖3 酶標(biāo)儀檢測(cè)H18 植物乳桿菌重組子綠色熒光結(jié)果

3 討論

已知原核微生物基因的表達(dá)水平主要與啟動(dòng)子強(qiáng)度［18］、基因拷貝數(shù)［19］、表達(dá)蛋白分泌到胞外效率［20］等有關(guān)。 已報(bào)道的乳酸菌表達(dá)系統(tǒng)中所用啟動(dòng)子大多為誘導(dǎo)型啟動(dòng)子， 如細(xì)菌素Sakacin A、木糖等誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。 雖然這些誘導(dǎo)物為食品級(jí)的，但在大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)中，誘導(dǎo)物的添加往往會(huì)使得工藝變得繁瑣，生產(chǎn)成本增加。而組成型啟動(dòng)子在這方面具有一定的優(yōu)勢(shì)，能夠簡(jiǎn)化工藝，節(jié)約成本。 強(qiáng)啟動(dòng)子P11 是植物乳桿菌WCSF1 的rRNA 啟動(dòng)子， 應(yīng)用于pSIP 表達(dá)系統(tǒng)。 Ptuf33 和Ptuf34 分別為植物乳桿菌CD033 和布氏乳桿菌（L. buchneri）CD034 轉(zhuǎn)錄延伸因子TU（translation elongation factor TU）基因啟動(dòng)子序列。Pefp 為布氏乳桿菌（L.buchneri）CD034 延伸因子P（translation elongation factor P）基因啟動(dòng)子序列。 為更好地檢測(cè)啟動(dòng)子特性， 選擇了具有廣泛寄主特性的pWVO1 復(fù)制子的乳酸菌穿梭表達(dá)載體pMG36e［21］。依照Tauer 等［22］的報(bào)道，啟動(dòng)子SD 序列與報(bào)告基因起始?jí)A基的距離最佳為8 bp， 所以在該研究中為更好地比較啟動(dòng)子特性， 設(shè)計(jì)此間隔序列為8 bp 進(jìn)行合成。 由圖4 可知，啟動(dòng)子P11、Ptuf33 和Ptuf34 所表達(dá)GFP 熒光信號(hào)顯著高于Pefp 和對(duì)照組，而啟動(dòng)子Pefp 所表達(dá)GFP 熒光信號(hào)與對(duì)照組無(wú)顯著差異，說(shuō)明啟動(dòng)子Pefp 不能在植物乳桿菌中有效表達(dá)目的基因。 Ptuf33 與Ptuf34 啟動(dòng)子在該研究中顯著高于P11 啟動(dòng)子表達(dá)報(bào)告基因，雖然這兩個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子取自不同的植物乳桿菌種，但其轉(zhuǎn)錄效率無(wú)顯著差異， 這可能是由于它們?cè)醋韵嗤颉?/p>

圖4 酶標(biāo)儀檢測(cè)H18 植物乳桿菌重組子綠色熒光結(jié)果

4 結(jié)論

通過(guò)該研究可知P11、Pefp、Ptuf33 和Ptuf34 4個(gè)啟動(dòng)子中轉(zhuǎn)錄延伸因子TU 基因啟動(dòng)子Ptuf33和Ptuf34 在受體植物乳桿菌中表達(dá)目的基因水平顯著高于其他啟動(dòng)子， 可以作為后續(xù)構(gòu)建高表達(dá)植物乳桿菌載體的基因元件， 為開發(fā)植物乳桿菌高效表達(dá)系統(tǒng)奠定良好的研究基礎(chǔ)。

綜上所述， 植物乳桿菌的基因工程展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。然而，植物乳桿菌表達(dá)系統(tǒng)還處于研究和完善階段， 缺少有效的商業(yè)化的表達(dá)載體和受體菌株， 建立一種高效表達(dá)外源蛋白且達(dá)到食品級(jí)的表達(dá)系統(tǒng)是使其發(fā)揮更重要作用的關(guān)鍵。該研究主要對(duì)植物乳桿菌啟動(dòng)子進(jìn)行研究，從而為通過(guò)提高啟動(dòng)子強(qiáng)度和復(fù)制子的拷貝數(shù)提升工程菌的表達(dá)水平提供理論依據(jù)。