山西老陳醋中芽孢桿菌的RAPD分型及其與性狀之間的關(guān)系

賈瑞娟，陳旭峰，梁 楷，王如福，許 女*

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 晉中 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，山西 晉中 030801；3.山西紫林醋業(yè)股份有限公司，山西 太原 030400）

作為中國(guó)“四大名醋”之一的山西老陳醋，其采用傳統(tǒng)自然固體發(fā)酵并結(jié)合獨(dú)特熏、淋、曬等工藝，形成老陳醋獨(dú)特的酸、綿、香、甜風(fēng)味與口感[1]。老陳醋的獨(dú)特風(fēng)味得益于微生物菌群的生長(zhǎng)和代謝以及復(fù)雜的協(xié)同作用，芽孢桿菌（Bacillus）也是山西老陳醋發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程中的重要微生物種群，其在老陳醋風(fēng)味和功能成分的形成中起到重要作用。王進(jìn)龍[2]從山西老陳醋中分離出解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）、短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）、萎縮芽孢桿菌（Bacillus atrophaeus）、巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）。

芽孢桿菌具有很強(qiáng)的分泌蛋白的能力，能產(chǎn)生大量的淀粉酶、纖維素酶、蛋白酶等，提高原料的利用率[3]。史改玲[4]從山西老陳醋成熟醋醅中分離篩選出的甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicus）CP-1576淀粉酶活力最高（61.40 U/mL），球形賴(lài)氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillus sphaericus）CP-2436的纖維素酶活力最高（54.99 U/mL），地衣芽孢桿菌CP-1853的蛋白酶活力最高（22.80 U/mL）；王進(jìn)龍[2]從山西老陳醋大曲中分離出的芽孢桿菌BA8的糖化酶活力為41.01 U/mL，BP6的蛋白酶活力為28.29 U/mL。

乙偶姻是山西老陳醋重要功能成分川芎嗪的前體物質(zhì)[5]，而芽孢桿菌產(chǎn)乙偶姻的能力比乳酸菌、醋酸菌更強(qiáng)、更穩(wěn)定[6]。在國(guó)內(nèi)外，乙偶姻生產(chǎn)菌種的篩選、育種、發(fā)酵主要集中于芽孢桿菌。高文睿等[7]從涼州熏醋中篩選出高產(chǎn)乙偶姻（2.376 mg/mL）的芽孢桿菌Y4；張顯[8]采用傳統(tǒng)誘變方法對(duì)枯草芽孢桿菌JNA 3-10進(jìn)行復(fù)合誘變，獲得一株2,3-丁二醇脫氫酶（2,3-butanediol dehydrogenase，BDH）缺失型乙偶姻高產(chǎn)突變株JNA-UD-6，乙偶姻產(chǎn)量為53.9 g/L。芽孢桿菌在陳醋中除產(chǎn)乙偶姻外，還產(chǎn)多酚類(lèi)物質(zhì)，從而賦予山西老陳醋抗氧化的功能，郇阿梅等[9]從四川傳統(tǒng)麩醋醋醅中篩選出一株芽孢桿菌YB-32，培養(yǎng)24h后總酚產(chǎn)量為263.6 μg/mL。另外，芽孢桿菌的代謝產(chǎn)物與發(fā)酵體系中的其他物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，生成一些風(fēng)味物質(zhì)，可以很好地改善食醋風(fēng)味。

隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性脫氧核糖核酸（randomamplifiedpoly morphicdeoxyribonucleicacid，RAPD）技術(shù)是一種基于基因組聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）的多態(tài)性分析的分子分型技術(shù)[10]。近年來(lái)，RAPD用于保加利亞乳桿菌（Lactobacillusbulgaricus）和嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）分型的研究較多[11]，但關(guān)于芽孢桿菌菌種間基因分型的研究鮮有報(bào)道。本研究從山西老陳醋釀造過(guò)程的醋醅中分離芽孢桿菌，采用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)其進(jìn)行鑒定，并采用RAPD技術(shù)對(duì)其進(jìn)行菌株分型，明確山西老陳醋芽孢桿菌的主要種類(lèi)；在此基礎(chǔ)上，對(duì)芽孢桿菌的酶、乙偶姻、多酚、總酯的生產(chǎn)能力進(jìn)行測(cè)定，進(jìn)一步探討了型別與菌株特性之間的關(guān)系，從中篩選出優(yōu)良菌株，以期豐富山西老陳醋生產(chǎn)強(qiáng)化菌株，對(duì)食醋的營(yíng)養(yǎng)、功能、風(fēng)味、生產(chǎn)效率的提高等都具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

醋醅：取自山西東湖醋廠老陳醋醋酸發(fā)酵第0天、1天、3天、5天、7天、9天、11天醋醅缸中表層至底層20cm處的醋醅。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑

MRS培養(yǎng)基：青島高科園海博生物科技有限公司。

細(xì)菌DNA提取試劑盒：北京博邁德基因科技有限公司；PCR引物：由深圳華大基因公司合成；DNA Maker、MIX：上海生工生物工程有限公司；福林試劑、肌酸、沒(méi)食子酸（均為分析純）：北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

T100型PCR儀、Universial HoodⅡ型凝膠成像系統(tǒng)：美國(guó)Bio-Rad公司；DYY-6C型瓊脂糖凝膠電泳儀：北京六一儀器廠；5417R型高速冷凍離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf公司；722型可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 山西老陳醋中芽孢桿菌的分離

無(wú)菌條件下，稱(chēng)取25 g樣品于內(nèi)置玻璃珠的225 mL無(wú)菌生理鹽水中，室溫、140 r/min條件下振蕩培養(yǎng)20 min，使其混勻。對(duì)樣品進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)x取梯度為10-5、10-6、10-7的稀釋液涂布于MRS固體培養(yǎng)基平板中，37℃靜置培養(yǎng)1～2 d。選擇具有30～300個(gè)菌落的平板，并挑取平板上表面粗糙、菌落形態(tài)較大的單個(gè)菌落進(jìn)行分離純化。

1.3.2 山西老陳醋中芽孢桿菌的鑒定

對(duì)分離純化的菌株進(jìn)行革蘭氏染色，并觀察菌株的菌落和細(xì)胞形態(tài)，選取革蘭氏陽(yáng)性、有芽孢的桿狀菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。

采用細(xì)菌DNA提取試劑盒提取分離菌株的基因組，以其為模板，采用引物27F（5′-AGAGTITGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-ACGGYTACCTI'GTI'ACGACTY-3′）對(duì)細(xì)菌的16S rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增[12]。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)后進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果提交至美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（nationalcenterforbiotechnologyinformation，NCBI）的Genebank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)，選取同源性較高的菌株，利用MEGA5.1軟件中的鄰接（neighbor-joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.3.3 山西老陳醋中芽孢桿菌的基因分型

將分離純化的芽孢桿菌菌株分別接種于MRS液體培養(yǎng)基，37℃、140 r/min條件下培養(yǎng)24 h，以基因組DNA為模板，采用引物（GTG）5（5′-GTGGTGGTGGTGGTG-3′）[13]進(jìn)行PCR擴(kuò)增；PCR擴(kuò)增體系：引物3 μL，模板3.5 μL，2×MIX 15 μL，雙蒸水（ddH2O）10.5 μL；PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性4 min；94℃變性30 s，58℃退火1 min，72℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離，進(jìn)行RAPD分型分析。

1.3.4 山西老陳醋中優(yōu)良芽孢桿菌的篩選

將分離的30株芽孢桿菌接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃、140 r/min條件下培養(yǎng)24 h，發(fā)酵液經(jīng)8 000 r/min離心10 min，取上清，采用3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）比色法[14]測(cè)定芽孢桿菌發(fā)酵液的糖化酶酶活、纖維素酶酶活；采用福林-酚比色法測(cè)定蛋白酶酶活[15]、多酚含量[16]；采用O'Meara-比色法[17]測(cè)定乙偶姻含量；采用氫氧化鈉皂化法[18]測(cè)定總酯含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 山西老陳醋中芽孢桿菌的分離與鑒定

從山西老陳醋醋酸發(fā)酵過(guò)程的醋醅中共分離得到30株芽孢桿菌，分別為菌株10、18、19、28、33、38、59、61、140、146、250、253、277、285、290、510、665、670、804、936、1145、1146、1463、1576、1882、1918、1959、1986、2035、2372，其中6株典型芽孢桿菌的菌落和細(xì)胞形態(tài)見(jiàn)圖1和表1。

由圖1和表1可知，菌株665的菌落呈圓形，邊緣齒狀，中間凹陷，乳白色；菌株1882的菌落邊緣褶皺，中間凸起成雪花狀，淡黃色；菌株2035的菌落近似圓形，扁平，邊緣平整，干燥；菌株1576的菌落呈圓形，邊緣齒狀，中間凸起成圈，乳白色；菌株936的菌落邊緣褶皺，中間凹陷，扁平，淡黃色；菌株670菌落呈圓形，邊緣褶皺，中間凹陷，扁平，乳白色。菌落形態(tài)多不透明，細(xì)胞均呈桿狀，革蘭氏陽(yáng)性（G+）。經(jīng)菌落和細(xì)胞形態(tài)觀察，初步鑒定30株分離菌株均為芽孢桿菌屬（Bacillus）。

圖1 山西老陳醋中典型芽孢桿菌的菌落（A）和細(xì)胞形態(tài)（1 000×）（B）Fig.1 Colony morphology(A)and cell morphology(1 000×)(B)of typicalBacillusfrom Shanxi aged vinegar

表1 山西老陳醋中典型芽孢桿菌的菌落和細(xì)胞形態(tài)結(jié)果Table 1 Results of colony and the cell morphology of typicalBacillus from Shanxi aged vinegar

30株芽孢桿菌經(jīng)16S rDNA測(cè)序比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 山西老陳醋中芽孢桿菌的16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree ofBacillusfrom Shanxi aged vinegar based on the 16S rDNA sequences

由圖2可知，菌株10、18、19、28、1146、1959、253、277、285、290、665與模式菌株BacilluslicheniformisstrainKW55P（MH424451.1）、BacilluslicheniformisstrainDC3-1（EU257697.1）、BacilluslicheniformisstrainSPB22（KY082733.1）聚于一支，親緣關(guān)系最近，可達(dá)99%，因此，鑒定這些菌株為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）；菌株33、59、1463、1986、2035、2372與模式菌株Bacillus subtilisstrain SY1（JX489618.1）、BacillussubtilisstrainS12（MH234565.1）、Bacillussubtilisstrain Y27（KF641814.1）聚于一支，親緣關(guān)系最近，因此，鑒定這些菌株為枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）；菌株38、146、250、510、804、1145、1882、1918與模式菌株Bacillus amyloliquefaciensstrain CD2901（KC492052.1）聚于一支，親緣關(guān)系也較近，鑒定為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）；同理，鑒定菌株140、1576為甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicus）；菌株61、936為短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）；菌株670為沙福芽孢桿菌（Bacillus safensis）。

綜上，30株芽孢桿菌中11株為地衣芽孢桿菌，8株為解淀粉芽孢桿菌，6株為枯草芽孢桿菌，2株為甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌，2株為短小芽孢桿菌及1株為沙福芽孢桿菌，分別占芽孢桿菌的36.67%、26.67%、20.00%、6.67%、6.67%、3.33%。

2.2 山西老陳醋中芽孢桿菌的基因分型

為了解山西老陳醋中芽孢桿菌種內(nèi)菌株的基因多樣性，采用RAPD技術(shù)對(duì)30株芽孢菌菌株進(jìn)行基因分型，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 山西老陳醋中芽孢桿菌的RAPD基因分型結(jié)果Fig.3 RAPD genotyping results ofBacillusfrom Shanxi aged vinegar

由圖3A可知，11株地衣芽孢桿菌主要呈現(xiàn)Ⅰ、Ⅱ2個(gè)型別，Ⅰ型又分為Ⅰ-Ⅰ、Ⅰ-Ⅱ2個(gè)亞型，其中菌株10、18、19、28為Ⅰ-Ⅰ型，菌株1146、1959為Ⅰ-Ⅱ型，其余菌株253、277、285、290、665均為Ⅱ型。由圖3B可知，8株解淀粉芽孢桿菌也被分成Ⅰ、Ⅱ2個(gè)型別，菌株38為Ⅰ型，而菌株146、250、510、804、1145、1882、1918被歸屬為Ⅱ型。由圖3C可知，6株枯草芽孢桿菌被分成Ⅰ、Ⅱ2個(gè)型別，Ⅰ型又分為Ⅰ-Ⅰ、Ⅰ-Ⅱ2個(gè)亞型，其中菌株33為Ⅰ-Ⅰ型，菌株59為Ⅰ-Ⅱ型，菌株1463、1986、2035、2372均為Ⅱ型。由圖3D可知，2株甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌菌株為同一基因型。由圖3E可知，2株短小芽孢桿菌屬于不同的型別。綜上所述，來(lái)源于老陳醋醋酸發(fā)酵過(guò)程中的30株芽孢桿菌具有菌株基因多樣性，為菌株的特性篩選提供了遺傳基礎(chǔ)。

2.3 山西老陳醋中優(yōu)良芽孢桿菌的篩選

2.3.1 芽孢桿菌產(chǎn)糖化酶能力的測(cè)定

淀粉酶可以催化淀粉及糖原水解，生成葡萄糖和麥芽糖。用淀粉酶做糖化劑來(lái)釀造食醋，可以提高食醋原料利用率，提高產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本，縮短食醋生產(chǎn)周期[19]。淀粉酶主要有α-淀粉酶和糖化酶，α-淀粉酶是將大分子淀粉水解成中等和低分子物質(zhì)，產(chǎn)生大量新的非還原性末端，糖化酶則將α-淀粉酶水解出的一些中、低分子產(chǎn)物水解為可直接利用的葡萄糖。芽孢桿菌能夠分泌產(chǎn)生糖化酶，研究較多的芽孢桿菌有解淀粉芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌等[20]。30株芽孢桿菌糖化酶活力測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 山西老陳醋中芽孢桿菌糖化酶活力的測(cè)定結(jié)果Fig.4 Determination results of glucoamylase activity ofBacillusfrom Shanxi aged vinegar

由圖4可知，30株芽孢桿菌的糖化酶酶活在20～120U/mL范圍內(nèi)，其中解淀粉芽孢桿菌1145（112.45 U/mL）、解淀粉芽孢桿菌38（89.68 U/mL）、沙福芽孢桿菌670（84.24 U/mL）的糖化酶活較高，但低于徐穎[21]從土壤中篩選的枯草芽孢桿菌的糖化酶酶活（784 U/mL），不同來(lái)源的芽孢菌菌株產(chǎn)糖化酶的能力顯著不同，這與菌株的生境直接相關(guān)，但醋醅中分離、篩選的土著優(yōu)良高產(chǎn)糖化酶芽孢桿菌對(duì)陳醋釀造環(huán)境的適應(yīng)性，具有其他來(lái)源菌株無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)。另外，Ⅱ型地衣芽孢桿菌的糖化酶酶活性（38～64U/mL）顯著高于Ⅰ型（18～36 U/mL）；相似地，Ⅱ型枯草芽孢桿菌的糖化酶酶活（59～68 U/mL）也顯著高于Ⅰ型（31～45 U/mL），表明同種同型別芽孢桿菌產(chǎn)糖化酶的能力具有相似性，同種不同型別芽孢桿菌產(chǎn)糖化酶的能力具有差異性。

2.3.2 芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶能力的測(cè)定

在食醋制作過(guò)程中，蛋白酶分解原料中的蛋白成分，提高陳醋中氨基氮的含量，同時(shí)提高了老陳醋的澄清度和穩(wěn)定性[22]。蛋白酶主要來(lái)源于微生物，其中芽孢桿菌是蛋白酶的重要生產(chǎn)菌株。30株芽孢桿菌的蛋白酶活力測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 山西老陳醋中芽孢桿菌蛋白酶活力的測(cè)定結(jié)果Fig.5 Determination results of protease activity ofBacillusfrom Shanxi aged vinegar

由圖5可知，30株芽孢桿菌發(fā)酵液的蛋白酶酶活在3～35 U/mL范圍內(nèi)，其中解淀粉芽孢桿菌38（34.53 U/mL）、甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌1576（27.75 U/mL）、甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌140（21.62U/mL）發(fā)酵液的蛋白酶酶活較高，但低于黃家駟等[23]從酒曲中篩選出的地衣芽孢桿菌的酶活（180U/mL）。這可能與芽孢菌的來(lái)源不同有關(guān)。Ⅰ型地衣芽孢桿菌的蛋白酶酶活（6～16 U/mL）顯著高于Ⅱ型（4～9 U/mL）；同理，Ⅰ型解淀粉芽孢桿菌的蛋白酶酶活（34.53 U/mL）高于Ⅱ型（13～19 U/mL），結(jié)果表明，不同型別芽孢桿菌的特性差異性較大，而同型別菌株特性相似。

2.3.3 芽孢桿菌產(chǎn)纖維素酶能力的測(cè)定

纖維素酶是一種具有催化纖維素分解成葡萄糖的生物活性蛋白質(zhì)，纖維素酶能破壞植物細(xì)胞壁，便于淀粉、蛋白質(zhì)、脂肪類(lèi)物質(zhì)的釋放，高粱作為陳醋生產(chǎn)原料，其纖維素含量高達(dá)4%～10%，纖維素酶可以加快發(fā)酵速度，提高食醋的產(chǎn)量和原料利用率。本研究中30株芽孢桿菌的纖維素酶活力測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖6。

由圖6可知，30株芽孢桿菌的纖維素酶酶活在9～35 U/mL范圍內(nèi)，其中沙福芽孢桿菌670、解淀粉芽孢桿菌510、枯草芽孢桿菌2372的纖維素酶活較高，分別為35.38 U/mL、33.61 U/mL、33.02 U/mL，纖維素酶酶活均高于董丹等[24]從酒醅中篩選出的枯草芽孢桿菌XWS-1（26.4U/mL）。從菌株基因分型來(lái)看，Ⅱ型枯草芽孢桿菌產(chǎn)纖維素酶（22～33U/mL）的能力明顯高于Ⅰ型（20～21U/mL），其余同種不同型別的芽孢桿菌、同種同型別的芽孢桿菌產(chǎn)纖維素酶能力相似。

圖6 山西老陳醋中芽孢桿菌纖維素酶活力的測(cè)定結(jié)果Fig.6 Determination results of cellulase activity ofBacillusfrom Shanxi aged vinegar

2.3.4 芽孢桿菌產(chǎn)乙偶姻能力的測(cè)定

乙偶姻是山西老陳醋中重要功能成分川芎嗪的前體物質(zhì)，國(guó)內(nèi)外產(chǎn)乙偶姻菌株的篩選、育種、發(fā)酵集中于芽孢桿菌。30株芽孢桿菌乙偶姻生產(chǎn)能力的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖7 山西老陳醋中芽孢桿菌產(chǎn)乙偶姻能力的測(cè)定結(jié)果Fig.7 Determination results of acetoin production ability of Bacillusfrom Shanxi aged vinegar

由圖7可知，30株芽孢桿菌的乙偶姻產(chǎn)量在0.3～1.2 mg/mL范圍內(nèi)，其中甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌1576的乙偶姻產(chǎn)量最高，為1.15 mg/mL，其次是高產(chǎn)糖化酶和蛋白酶的解淀粉芽孢桿菌38（1.05 mg/mL），顯著高于王霜等[25]從兼香型白酒酒醅中篩選到的地衣芽孢桿菌LS9的乙偶姻生產(chǎn)能力（0.065mg/mL）。Ⅰ型解淀粉芽孢桿菌的乙偶姻產(chǎn)量（1.05 mg/mL）顯著高于Ⅱ型（0.52～0.94 mg/mL），而且Ⅰ型枯草芽孢桿菌的乙偶姻產(chǎn)量（0.69～0.76 mg/mL）也同樣高于Ⅱ型（0.52～0.58 mg/mL），進(jìn)一步表明，同種同型別的芽孢桿菌的優(yōu)良特性具有相似性，不同型別的芽孢菌其特性具有差異性。

2.3.5 芽孢桿菌產(chǎn)多酚能力的測(cè)定

多酚類(lèi)物質(zhì)具有抗氧化、強(qiáng)化血管壁、促進(jìn)腸胃消化、降低血脂肪、抑制細(xì)菌與癌細(xì)胞生長(zhǎng)等多種生理活性功能[16]。30株芽孢桿菌的多酚產(chǎn)量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖8。

圖8 山西老陳醋中芽孢桿菌產(chǎn)多酚能力的測(cè)定結(jié)果Fig.8 Determination results of polyphenols production ability of Bacillusfrom Shanxi aged vinegar

由圖8可知，30株芽孢桿菌的多酚產(chǎn)量在120～430μg/mL范圍內(nèi)，其中解淀粉芽孢桿菌804（428.35μg/mL）、解淀粉芽孢桿菌1145（407.07μg/mL）、地衣芽孢桿菌1146（403.71μg/mL）的多酚產(chǎn)量較高，而高產(chǎn)糖化酶、纖維素酶和乙偶姻的解淀粉芽孢桿菌38產(chǎn)多酚能力次之，產(chǎn)量為401.36μg/mL。Ⅰ-Ⅱ型地衣芽孢桿菌的多酚產(chǎn)量在320～400 μg/mL范圍內(nèi)，而Ⅱ型地衣芽孢桿菌在260～325 μg/mL范圍內(nèi)。

2.3.6 芽孢桿菌產(chǎn)總酯能力的測(cè)定

芽孢菌代謝產(chǎn)生的乳酸、蘋(píng)果酸、酒石酸、丙酮酸等有機(jī)酸，可以與醇類(lèi)物質(zhì)酯化生成酯類(lèi)物質(zhì)，豐富老陳醋味感與口感。30株芽孢桿菌的總酯生產(chǎn)能力測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖9。

圖9 山西老陳醋中芽孢桿菌產(chǎn)總酯能力的測(cè)定結(jié)果Fig.9 Determination results of total esters production ability of Bacillusfrom Shanxi aged vinegar

由圖9可知，30株芽孢桿菌的總酯產(chǎn)量在6.98～9.62 g/100 mL范圍內(nèi)，其中解淀粉芽孢桿菌38產(chǎn)總酯能力（9.62 g/100 mL）最強(qiáng)；其次為解淀粉芽孢桿菌1882、解淀粉芽孢桿菌1145，分別為9.54 g/100 mL、9.05 g/100 mL。

綜上，30株芽孢桿菌中解淀粉芽孢桿菌38產(chǎn)糖化酶、蛋白酶、乙偶姻、多酚和總酯的能力均較高，為優(yōu)良菌株。

3 結(jié)論

從山西老陳醋醋酸發(fā)酵過(guò)程的醋醅中共分離出30株芽孢桿菌，經(jīng)分子生物學(xué)鑒定，其中11株為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis），8株為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens），6株為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），2株為甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌（Bacillusmethylotrophicus），2株為短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus），1株為沙福芽孢桿菌（Bacillus safensis）。采用RAPD技術(shù)對(duì)其進(jìn)行基因分型，發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌種內(nèi)具有基因多樣性。另外對(duì)30株芽孢桿菌產(chǎn)酶、乙偶姻、多酚、總酯的能力進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)同種同型別的芽孢桿菌產(chǎn)酶、乙偶姻、多酚、總酯的能力具有相似性；但同種不同型別的芽孢桿菌的特性具有差異性，并且篩選出1株產(chǎn)糖化酶（89.68U/mL）、蛋白酶（34.53U/mL）、乙偶姻（1.05 mg/mL）、多酚（401.36 μg/mL）、總酯（9.62 g/100 mL）能力均較高的解淀粉芽孢桿菌38，證明了芽孢桿菌作為山西老陳醋強(qiáng)化直投式發(fā)酵劑具有巨大的開(kāi)發(fā)潛力。