殼聚糖山苓祛斑凝膠的高效液相指紋圖譜*

陳軍，熊鑫，余南才

(武漢市第一醫(yī)院藥學(xué)部，武漢 430022)

殼聚糖山苓祛斑凝膠是由茯苓、白芷、白術(shù)、白芨、當(dāng)歸、丁香等12味藥材組成，臨床上主要用于治療黃褐斑，為我院中醫(yī)部周利副主任醫(yī)師經(jīng)驗(yàn)方，具有活血行氣、祛斑養(yǎng)顏的功效，本方臨床使用多年，用于治療黃褐斑，療效確切。本方涉及多味中藥，化學(xué)成分較復(fù)雜，且還受各味藥材的產(chǎn)地、用藥部位和制備工藝的影響，僅以尿囊素、羥基紅花黃色素A的含量測(cè)定作為質(zhì)量控制的方法，難以全面準(zhǔn)確地反映該制劑的質(zhì)量。而指紋圖譜能在一定程度上反映其質(zhì)量的可控性、穩(wěn)定性及真實(shí)性。質(zhì)量控制方式及技術(shù)體系[1-7]能全面地反映制劑的內(nèi)在特征。本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜(HPLC)法建立殼聚糖山苓祛斑凝膠的指紋圖譜檢測(cè)方法，為提高殼聚糖山苓祛斑凝膠的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)和全面的質(zhì)量檢查提供參考。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Waters e2695高效液相色譜儀(紫外檢測(cè)器，四元泵，柱溫箱)，BP211D電子天平(德國(guó)賽多利斯公司，Max210g ，d=0.01mg)。

1.2試藥 歐前胡素(批號(hào)：110826-201616)、異歐前胡素(批號(hào)：110827-201611)、阿魏酸(批號(hào)：110773-201614)、丁香酚(批號(hào)：110725-201615)均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；殼聚糖山苓祛斑凝膠自制，批號(hào)分別為：20170510，20170512，20170520，20170525，20170527，20170601，20170603，20170605，20170610，20170613，甲醇為色譜純(美國(guó)TEDIA公司)，二氯甲烷、磷酸為分析純(天津市白世化工有限公司)，純化水自制。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 AgilentC18色譜柱(4.6 mm×200 mm，5 μm)，流動(dòng)相為甲醇(A)-0.1%磷酸(B)，梯度洗脫(0～10 min，25%A；>10～28 min，25%A→55%A；>28～45 min，55%A→85%A；>45～50 min，85%A→25%A)[8-14]，檢測(cè)波長(zhǎng)286 nm，流速1.0 mL·min-1，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL。

2.2溶液的制備

2.2.1對(duì)照品溶液制備 分別精密稱取減壓干燥至恒重的歐前胡素、異歐前胡素、阿魏酸、丁香酚對(duì)照品適量至量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，再分別精密移取上述對(duì)照品適量至同一量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得混合對(duì)照品溶液(歐前胡素123.5 μg·mL-1、異歐前胡素108.4 μg·mL-1、阿魏酸122.9 μg·mL-1、丁香酚96.6 μg·mL-1)。

2.2.2試品溶液制備 精密稱取本品(批號(hào)：20170510)5 g至燒杯中，加入純化水15 mL溶解后轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，加二氯甲烷萃取3次，每次20 mL，合并二氯甲烷，水浴蒸干，殘?jiān)眉状既芙獠⒍ㄈ萦?5 mL量瓶中，經(jīng)孔徑0.45 μm 微孔濾膜濾過(guò)，作為供試品溶液，備用[15-17]。

2.3方法學(xué)考察

2.3.1精密度實(shí)驗(yàn) 取殼聚糖山苓祛斑凝膠(批號(hào)：20170510)，按“2.2.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件連續(xù)自動(dòng)進(jìn)樣6次進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，以阿魏酸為參照峰，測(cè)得樣品各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD<1.0%，相對(duì)峰面積RSD<3.0%，說(shuō)明該儀器的精密度良好。

2.3.2穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取殼聚糖山苓祛斑凝膠(批號(hào)：20170510)，按“2.2.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定，分別于0，3，5，10，15，20 h自動(dòng)進(jìn)樣，記錄色譜圖，以阿魏酸為參照峰，測(cè)得樣品各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD<2.0%，相對(duì)峰面積RSD<5.0%，表明供試品溶液在20 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.3重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批號(hào)(20170510)殼聚糖山苓祛斑凝膠，按“2.2.2”項(xiàng)方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖，以阿魏酸為參照峰，測(cè)得樣品各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD<3.0%，相對(duì)峰面積RSD<5.0%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.4指紋圖譜的建立及分析

2.4.1指紋圖譜的建立 取10批殼聚糖山苓祛斑凝膠的供試品，分別按“2.2.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液10份，按“2.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖，將10批殼聚糖山苓祛斑凝膠的液相色譜圖導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”(2010版)軟件進(jìn)行評(píng)價(jià)，建立殼聚糖山苓祛斑凝膠的指紋圖譜[18-19]，并生成對(duì)照色圖譜R(圖1)。

圖1 10批殼聚糖山苓祛斑凝膠HPLC指紋圖譜及對(duì)照?qǐng)D譜

Fig.1HPLCfingerprintandreferencefingerprintoftenbatchesofchitosanShanlingQubangel

2.4.2共有峰的標(biāo)定及參照峰的選擇 對(duì)供試品溶液的色譜圖進(jìn)行分析，標(biāo)定了殼聚糖山苓祛斑凝膠中出峰時(shí)間穩(wěn)定、特征明顯的10個(gè)共有峰為特征峰(圖2)，并確定了其中2，5，7，9號(hào)峰分別為歐前胡素、阿魏酸、異歐前胡素、丁香酚(圖3)。其中5號(hào)峰阿魏酸的保留時(shí)間居中，分離度好，峰面積大，易于辨認(rèn)，故選為本品指紋圖譜的參照峰。

圖2 共有峰色譜圖

Fig.2Commonpeaksofthechromatogram

2.歐前胡素；5.阿魏酸；7.異歐前胡素；9.丁香酚

2.4.3指紋圖譜相似度評(píng)價(jià) 對(duì)10批殼聚糖山苓祛斑凝膠所測(cè)得的色譜圖采用國(guó)家藥典委員會(huì)頒布的“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”(2010版)軟件進(jìn)行分析，進(jìn)過(guò)數(shù)據(jù)匹配，以中位法建立指紋圖譜，得10批樣品和對(duì)照指紋圖譜的相似度均>0.9(表1)。并以5號(hào)峰阿魏酸為參照物，計(jì)算各共有色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，見表2，3。

3 討論

3.1波長(zhǎng)的選擇 本制劑中所含的大部分藥材在2015版《中華人民共和國(guó)藥典》及其他文獻(xiàn)均無(wú)或極少HPLC檢測(cè)方法，故選取白芷、當(dāng)歸、柴胡、丁香、紅花等有HPLC法的幾味藥材來(lái)選定檢測(cè)波長(zhǎng)，其中，柴胡和紅花的檢測(cè)波長(zhǎng)分別為210和403 nm，紫外光吸收少，殼聚糖山苓祛斑凝膠樣品的整體峰吸收較差，不利于制劑指紋圖譜的采集，故參考文獻(xiàn)，選取白芷中歐前胡素、異歐前胡素、當(dāng)歸中阿魏酸、丁香中丁香酚結(jié)合全波長(zhǎng)掃描來(lái)選取檢測(cè)波長(zhǎng)，其中286 nm處色譜峰信息豐富，基線平穩(wěn)，特征峰明顯，故選取286 nm作為殼聚糖山苓祛斑凝膠指紋圖譜的檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2流動(dòng)相的選擇 本制劑考察了乙腈-磷酸、甲醇-磷酸等常用的指紋圖譜流動(dòng)相系統(tǒng)，其中在甲醇-磷酸條件下，色譜峰峰型良好，特征峰多，并結(jié)合梯度洗脫，色譜峰分離度好，故選擇甲醇-磷酸作為殼聚糖山苓祛斑凝膠指紋圖譜的檢測(cè)流動(dòng)相。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)10批殼聚糖山苓祛斑凝膠的指紋圖譜進(jìn)行相似度計(jì)算，10批殼聚糖山苓祛斑凝膠的相似度、相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積均在合理的范圍內(nèi)，表明殼聚糖山苓祛斑凝膠各批次成分間性質(zhì)穩(wěn)定，說(shuō)明該制劑的制備工藝純熟，本實(shí)驗(yàn)建立的殼聚糖山苓祛斑凝膠指紋圖譜方法簡(jiǎn)單，易操作，可用于完善其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究。

表1 10批殼聚糖山苓祛斑凝膠指紋圖譜相似度結(jié)果

表2 10批殼聚糖山苓祛斑凝膠共有峰的相對(duì)保留時(shí)間

表3 10批殼聚糖山苓祛斑凝膠共有峰的相對(duì)峰面積