地膚子配方顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)*

胡輝，翟紅偉，劉源才，4

(1.勁牌生物醫(yī)藥有限公司，黃石 435000；2.勁牌有限公司，大冶 435100；3.勁牌研究院，黃石 435000；4.中藥保健食品質(zhì)量與安全湖北省重點實驗室，大冶 435100)

地膚子又名獨掃子、地埋、地葵、掃把子等[1-2]，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品。具有清熱利濕、祛風(fēng)止癢之功效，用于小便澀痛、陰癢帶下、風(fēng)疹、濕疹、皮膚瘙癢等證[3]。中藥配方顆粒是由單味中藥飲片經(jīng)水提、濃縮、干燥、制粒而成，在中醫(yī)臨床配方后供患者沖服使用。具有劑量小，服用、攜帶、貯存、運輸方便等特點，彌補了傳統(tǒng)飲片的不足，是對傳統(tǒng)中藥飲片的補充。中藥配方顆粒相比傳統(tǒng)飲片，具有質(zhì)量穩(wěn)定、可控的優(yōu)勢[4]。地膚子配方顆粒是藜科植物地膚[Kochiascoparia(L.) Schrad.] 的干燥成熟果實制成的配方顆粒，其有效成分和功效基本保持不變，由于地膚子配方顆粒缺乏可控的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，因此，建立標(biāo)準(zhǔn)具有必要性。本實驗參照2015年版《中華人民共和國藥典》相關(guān)方法[5]，首次建立了地膚子配方顆粒的標(biāo)準(zhǔn)，包括水分、粒度、溶化性、浸出物等的檢測及地膚子皂苷Ic的含量測定，并對10批地膚子配方顆粒進(jìn)行了檢測，制定了各檢測項的限度，為控制地膚子配方顆粒的質(zhì)量提供了科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試劑

1.1實驗儀器 德國Thermo Fisher UltiMate 3000系列高效液相色譜儀(包括LPG-3400SDN四元梯度泵，WPS-3000SL自動進(jìn)樣器，TCC-3000RS柱溫箱，VWD-3100檢測器，DAD-3000檢測器)；Sepax HP C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；Agilent SB Aq C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；Waters T3色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；純水機(ELGA PURELAB Classic，超純水系統(tǒng))；電子分析天平(Sartorius SQP QUINTIX125D-1CN，感量0.01 mg)；超聲提取器(SK8200HP，上海科導(dǎo)有限公司)。

1.2試劑 地膚子皂苷Ic對照品(中國食品藥品檢定研究院，含量83.6%，批號：111723-201404)；硅膠G薄層板(青島海洋化工廠分廠)；乙腈(美國Fisher公司，Lot：172009)；磷酸、乙酸為色譜純，水為超純水，其他試劑為分析純；地膚子飲片(湖北正光九資河藥業(yè)有限公司，批號：160101，經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所郭寶林教授鑒定)；10批地膚子配方顆粒(樣品批號：P20161023、P20161025、P20161027、P20161029、P20161030、P20161101、P20161102、P20161103、P20161105、P20161109，由勁牌生物醫(yī)藥有限公司提供，規(guī)格：每袋1.5 g)。

2 方法與結(jié)果

2.1薄層色譜鑒別 取地膚子配方顆粒粉末1 g，共3批，加甲醇10 mL，超聲處理30 min ，濾過，濾液作為供試品溶液。另取地膚子皂苷Ic對照品，加甲醇制成每毫升含0.5 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(通則0502)實驗，吸取上述兩種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水(16：9：2)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，熱風(fēng)吹至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的紫紅色斑點，結(jié)果見圖1。

2.2檢查

2.2.1水分測定 分別取10批地膚子配方顆粒樣品粉末(過孔徑850 μm篩)約2 g，精密稱定，參照《中華人民共和國藥典》2015年版四部通則0832項下水分測定法第一法進(jìn)行測定。地膚子配方顆粒水分測定結(jié)果為5.78%～6.50%(表1)，水分平均含量為6.06%，符合《中華人民共和國藥典》2015年版四部顆粒劑項下水分要求。

1.地膚子配方顆粒(P20161025)；2.地膚子配方顆粒(P20161030)；3.地膚子配方顆粒(P20161105)；4.地膚子皂苷Ic對照品(111723-201404)

圖1 地膚子配方顆粒薄層色譜圖

1.KochiaScopariadispensing granules(P20161025)；2.KochiaScopariadispensing granules(P20161030)；3.KochiaScopariadispensing granules(P20161105)； 4.momordin Ic(111723-201404)

Fig.1Thin-layerchromatogramofKochiaScopariadispensinggranules

表1 10批地膚子配方顆粒水分、粒度、裝量差異結(jié)果

Tab.1Resultsofwatercontent,particlesizeandcontentuniformityfortenbatchesofKochiaScopariadispensinggranules

%

2.2.2粒度測定 取地膚子配方顆粒樣品10批，參照《中華人民共和國藥典》2015年版四部通則0982第二法雙篩分法測定，結(jié)果見表1，10批地膚子配方顆粒的粒度均小于15%，符合《中華人民共和國藥典》2015年版四部顆粒劑項下粒度要求。

2.2.3溶化性測定 分別取供試品10 g，加入熱水200 mL，攪拌5 min ，立即觀察，清澈無異物或焦屑，說明10批地膚子顆粒劑的溶化性符合要求。

2.2.4裝量差異檢查 取地膚子配方顆粒樣品10批，參照《中華人民共和國藥典》2015年版四部通則0104顆粒劑項下單劑量包裝的顆粒劑裝量差異方法檢查，結(jié)果見表1，10批地膚子配方顆粒的裝量差異限度均在±8%(每袋1.5 g)范圍內(nèi)，符合裝量差異要求。

2.2.5微生物限度檢查 按照非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查，結(jié)果見表2，均符合要求：菌落總數(shù)≤1000 CFU·g-1；真菌及酵母菌≤100 CFU·g-1；大腸埃希菌不得檢出(1 g)。

表2 10批地膚子配方顆粒微生物限度檢查結(jié)果

Tab.2ResultsofmicrobiallimittestontenbatchesofKochiaScoparidispensinggranulesCFU·g-1

批號菌落總數(shù)真菌及酵母菌大腸埃希菌P2016102314938未檢出P2016102513735未檢出P201610278412未檢出P2016102916928未檢出P201610306423未檢出P201611015457未檢出P201611024467未檢出P201611034022未檢出P201611058333未檢出P2016110910758未檢出

2.3浸出物含量測定 分別取10批地膚子配方顆粒樣品粉末(過孔徑850 μm篩)約2 g，精密稱定，按《中華人民共和國藥典》2015年版四部通則2201項下的熱浸法進(jìn)行測定，用乙醇為溶劑，測得浸出物含量為27.44%～30.95%，平均28.85%。

2.4含量測定

2.4.1對照品溶液的制備 取地膚子皂苷Ic對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每毫升含0.5 mg的溶液，即得。

2.4.2供試品溶液的制備 取本品粉末約0.1 g，精密稱定，加70%甲醇定容至10 mL，放置過夜，超聲使其溶解后混勻，用直徑0.22 μm針頭過濾器濾過，即得。

2.4.3色譜條件與系統(tǒng)適用性實驗 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-1.3%醋酸溶液(85：15)為流動相；蒸發(fā)光散射檢測器檢測，漂移管溫度100 ℃，載氣流速2.5 L·min-1。理論板數(shù)按地膚子皂苷Ic峰計算應(yīng)不低于3000。

2.4.4專屬性實驗 取對照品溶液及供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)行分析。見圖2，結(jié)果表明，供試品溶液與對照品溶液在相同的保留時間上都有色譜峰。

1.地膚子皂苷Ic

圖2 對照品溶液(A)和供試品溶液(B)HPLC色譜圖

1.momordin Ic

Fig.2HPLCchromatographyofreferencesubstanceandtestsample

2.4.5線性關(guān)系考察 精密稱取對照品地膚子皂苷Ic17.96 mg，加甲醇溶解并定容至25 mL，搖勻，得濃度為600.5824 mg·L-1對照品儲備液，取對照品儲備液5 mL，加甲醇定容至10 mL，得濃度為300.291 2 mg·L-1的溶液。將該溶液稀釋2倍，以后濃度均以上一高濃度為母液次遞稀釋2倍，即得不同濃度的對照品溶液。在上述色譜條件下進(jìn)行色譜分析，得到各濃度色譜峰的峰面積，以色譜峰面積(A)的對數(shù)為橫坐標(biāo)，相對應(yīng)濃度的對數(shù)(C)為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線為：Y=0.660 48X+1.480 20，R2=0.999 5，結(jié)果表明地膚子皂苷Ic在18.768 2～600.582 4 mg·L-1呈良好的線性關(guān)系。

2.4.6精密度實驗 取“2.4.5”項中300.291 2 mg·L-1的對照品溶液作為精密度實驗的供試品溶液。取該溶液在上述色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣分析6次，得到各次分析時地膚子皂苷Ic的含量，計算得到地膚子皂苷Ic精密度實驗的RSD為0.84%。結(jié)果表明儀器的精密度良好。

2.4.7穩(wěn)定性實驗 取“2.4.5”項中300.291 2 mg·L-1的對照品溶液作為穩(wěn)定性實驗的供試品溶液，按上述色譜條件，分別于1，1.5，2，2.5，4，7 h進(jìn)樣，得到各時間對照品的峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算地膚子皂苷Ic含量并計算RSD值，得地膚子皂苷Ic穩(wěn)定性實驗的RSD為2.24%。結(jié)果表明地膚子皂苷Ic在7 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.8重復(fù)性實驗 取同一批號配方顆粒(P20161023)，按“2.4.2” 項方法制備供試品溶液6份，分別測定地膚子皂苷Ic的峰面積并計算含量，見表3。地膚子皂苷Ic的平均含量為0.978 6%，RSD值為0.90%。結(jié)果表明該方法的重復(fù)性良好。

表3 供試品溶液重復(fù)性實驗結(jié)果

Tab.3Dataofrepeatabilitytestoftestsamplesolutionn=6

稱樣量/mg供試品含量/(mg·L-1)含量/%95.0192.287 40.971 3100.2797.586 60.973 2101.8699.844 20.980 2100.4397.840 50.974 2102.38100.025 60.977 0101.75101.284 40.995 4

2.4.9加樣回收實驗 取已知含量的同一批樣品(P20161023)9份，精密稱定，分別精密加入各對照品溶液適量，按“2.4.2 ”項方法，制備供試品溶液，進(jìn)樣測定，見表4。地膚子配方顆粒中添加地膚子皂苷Ic的回收率為102.04%，RSD值為0.98%。結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確可靠。

表4 地膚子皂苷Ic加樣回收實驗結(jié)果

Tab.4DataofrecoverytestofmomordinIcmg，n=9

取樣量原有量加入量測得量回收率/%54.350.565 30.384 40.929 894.8254.600.568 40.384 40.933 995.0856.370.531 90.384 40.950 6108.9256.080.534 30.480 51.049 6107.2456.970.551 60.480 51.058 2105.4355.530.548 80.480 51.037 6101.7355.820.557 50.576 61.134 099.9855.950.543 40.576 61.148 3104.9155.070.546 30.576 61.124 6100.29

2.4.10樣品含量測定 分別取10批地膚子配方顆粒，按照上述含量測定方法操作，計算每批樣品中地膚子皂苷Ic的含量，見表5。結(jié)果表明10批樣品含量穩(wěn)定，地膚子皂苷Ic含量測定數(shù)據(jù)為0.97%～0.99%，根據(jù)測定結(jié)果，結(jié)合生產(chǎn)數(shù)據(jù)，暫定本品按干燥品計算，含地膚子皂苷Ic不得少于0.20%。

表5 10批樣品含量檢測結(jié)果

Tab.5Resultsofcontentdeterminationontenbatchesofsample%

樣品批號第1次第2次平均值P201610230.981 40.978 80.980 1P201610250.989 50.990 10.989 8P201610270.988 70.981 70.985 2P201610290.983 70.980 40.982 0P201610300.988 30.985 40.986 8P201611010.988 90.980 40.984 6P201611020.985 60.979 30.982 4P201611030.987 10.989 50.988 3P201611050.988 00.988 20.988 1P201611090.984 90.981 00.983 0

2.5指紋圖譜研究

2.5.1色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性實驗 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-0.1%磷酸溶液為流動相，按表6中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫；檢測波長為210 nm。理論板數(shù)按地膚子皂苷Ic峰計算應(yīng)不低于3000。

表6 梯度洗脫

2.5.2對照品溶液的制備 取地膚子皂苷Ic對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每毫升含地膚子皂苷Ic 0.5 mg的溶液，即得。

2.5.3供試品溶液的制備 取本品粉末約0.1 g，精密稱定，加20%甲醇定容至10 mL，超聲溶解后混勻，用孔徑0.22 μm針頭過濾器濾過，即得。

2.5.4測定法 分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定，即得。

2.5.5系統(tǒng)耐用性實驗 取同一樣品分別采用同一臺Thermo Fisher UltiMate 3000系列高效液相色譜儀、相同的色譜分析條件，不同的色譜柱對同一樣品進(jìn)行色譜分析。分析用的色譜柱如下：Sepax HP C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)、A gilent SB Aq C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Waters T3色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)。結(jié)果各色譜柱分離效果均較好，表明方法具有良好的系統(tǒng)耐用性。

2.5.6專屬性實驗 取對照品溶液及供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)行分析。見圖3。結(jié)果表明，供試品溶液與對照品溶液在相同的保留時間上都有色譜峰。

1.地膚子皂苷Ic

圖3 地膚子皂苷Ic對照品(A)、供試品(B)色譜圖比較

1.momordin Ic

Fig.3Comparisonofthechromatographybetweenreferencesubstance(A)andtestsample(B)ofmomordinIc

2.5.7精密度實驗 取同一供試品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次。其指紋圖譜及相似度計算結(jié)果相似度系數(shù)>0.99，符合指紋圖譜技術(shù)要求(≥0.95)，其結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.5.8穩(wěn)定性實驗 取同一樣品溶液分別在1.5，5，9，17，25，33 h進(jìn)樣，其考察圖譜及相似度計算結(jié)果相似度系數(shù)>0.96，符合指紋圖譜技術(shù)要求(≥0.95)。結(jié)果表明33 h內(nèi)測定，樣品溶液穩(wěn)定。

2.5.9重復(fù)性實驗 取同一批號的地膚子配方顆粒，按供試液制備方法及檢測方法操作6次，其指紋圖譜及相似度計算結(jié)果相似度系數(shù)在0.96以上，符合指紋圖譜技術(shù)要求(不小于0.95)。其結(jié)果表明方法重復(fù)性較好。

2.5.10樣品檢測 對收集的10批地膚子配方顆粒樣品進(jìn)行了指紋圖譜考察，圖譜見圖4，5。結(jié)果表明10批樣品均能檢出地膚子皂苷Ic，且相似度良好(表7，相似度系數(shù)>0.95)。

圖4 樣品的對照圖譜

圖5 10批樣品色譜圖

3 討論

地膚子為常用的中藥之一，具有較強的抗病原微生物、抗炎及抗變態(tài)反應(yīng)活性[6]，以地膚子為主的復(fù)方制劑可用于治療皮膚瘙癢等多種皮膚疾病，還能用于治療尿路感染、急性乳腺炎、前列腺炎等癥[7-10]。將地膚子制備成顆粒劑既保留原藥材的性味、有效成分和功能，又能提高使用的便捷性和調(diào)配的靈活性。

按照《中華人民共和國藥典》2015年版相關(guān)方法測定地膚子的粒度、水分、溶化性，結(jié)果均符合顆粒劑項下要求。

地膚子配方顆粒浸出物的測定采用醇溶性熱浸法，以乙醇為溶劑測定，結(jié)果10批地膚子配方顆粒的浸出物含量為27.44%～30.95%，平均含量為28.85%，根據(jù)結(jié)果，醇溶性浸出物按平均值下浮20%，擬定地膚子配方顆粒浸出物不得少23.08%。

表7 相似度測定結(jié)果

10批地膚子配方顆粒中地膚子皂苷Ic的含量為0.97%～0.99%，平均含量為0.98%，根據(jù)結(jié)果，地膚子皂苷Ic含量按平均值下浮20%，擬定地膚子配方顆粒含地膚子皂苷Ic不得少于0.7881%。10批次地膚子配方顆粒指紋圖譜，按中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)計算，相似度應(yīng)不低于0.90。

本研究建立的地膚子配方顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)方法操作簡便，準(zhǔn)確可靠，重復(fù)性好，可用于地膚子配方顆粒的質(zhì)量控制。地膚子配方顆粒指紋圖譜的建立，也能用于配方顆粒及所用藥材的質(zhì)量評價和鑒定[11-12]。