新型芹菜素納米脂質(zhì)體對糖尿病心肌病大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響

章雅丹

(寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院藥劑科，寧波 315040)

糖尿病已經(jīng)成為危害人類健康的重大疾病之一[1-2]。糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是糖尿病患者心肌細(xì)胞原發(fā)性損傷引起的心臟結(jié)構(gòu)以及功能的障礙，已經(jīng)成為患者致死的主要原因[3]。糖尿病引起的高血糖、高脂血癥可以造成心肌細(xì)胞凋亡，是DCM的主要病理特征之一，可進(jìn)一步引起左心室功能紊亂以及心肌細(xì)胞纖維化[4]。研究顯示，芹菜素能夠顯著降低糖尿病動物血糖及血脂水平，是潛在的防治DCM的藥物[5]。然而，由于其存在溶解性低、在體應(yīng)用難吸收等問題限制了臨床應(yīng)用[6]。脂質(zhì)體是一種新型的被動靶向藥物遞送載體，應(yīng)用脂質(zhì)體包載難溶性藥物，能夠提高藥物溶解度，同時促進(jìn)藥物的細(xì)胞膜滲透性，增加藥物的吸收[7-8]，從而實現(xiàn)難溶性藥物在體臨床應(yīng)用。筆者制備新型納米脂質(zhì)體包載難溶性藥物芹菜素，考察其對于DCM大鼠心肌細(xì)胞凋亡的預(yù)防作用及相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 健康雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量為180～220 g，清潔級，由溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心購自上海斯萊克實驗動物有限公司。實驗動物使用許可證號：SYXK(浙)2015-0001，合格證號：wydw2013-0050，飼養(yǎng)條件符合實驗動物管理與使用指南。

1.2主要試劑 芹菜素(Sigma-Aldrich 公司，含量≥99%，CAS號：520-36-5)，注射級蛋黃卵磷脂(上海艾韋特醫(yī)藥科技有限公司，CAS號：93685-90-6)，戊巴比妥鈉(Sigma-Aldrich 公司，CAS號：57-33-0)，鏈脲佐菌素(Sigma-Aldrich 公司，CAS號 ：18883-66-4)，TUNEL凋亡試劑盒(Roche Applied Science，批號：11684795910)，Bcl-2蛋白(Santa Cruz Biotechnology，批號：sc-71957)以及Bax一抗(Santa Cruz Biotechnology，批號：sc-70407)，辣根過氧化酶標(biāo)記羊抗兔二抗(Santa Cruz Biotechnology，批號：sc-2004)，血糖試紙(德國羅氏活力型血糖儀專用試紙，批號：Accu-Chek Performa test strips)。

1.3芹菜素納米脂質(zhì)體的制備及其性質(zhì)考察 參考JIN等[9]介紹的方法制備新型芹菜素納米脂質(zhì)體：芹菜素1 mg，蛋黃卵磷脂10 mg，加入到處方量無水乙醇中完全溶解，將上述溶液在真空條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)乙醇，形成載藥脂質(zhì)薄膜，然后加入適量純化水水化12 h，形成膠體溶液。將上述膠體溶液在室溫(25 ℃)及高壓(73.5 MPa)條件下，超聲分散15 s(循環(huán)3次)，制備芹菜素納米脂質(zhì)體。應(yīng)用上述方法同時制備空白納米脂質(zhì)體。

采用掃描電子顯微鏡考察載藥脂質(zhì)體表觀形態(tài)，同時應(yīng)用動態(tài)光衍射法測定載藥及空白脂質(zhì)體的粒徑和Zeta電位分布。

包封率測定：將上述制備載藥脂質(zhì)體溶液放入透析袋(截留相對分子質(zhì)量10 000～12 000)，室溫透析2 h，除去未包封藥物及他制備輔料。然后甲醇破壞脂質(zhì)體，應(yīng)用高效液相色譜(HPLC)法測定載藥脂質(zhì)體中藥物含量。

載體包封率(%)=載藥脂質(zhì)體中藥物含量/最開始加入藥物×100%。

1.4糖尿病實驗動物模型建立及給藥方法 采用隨機(jī)數(shù)字表法將60只大鼠分為正常對照組、模型對照組、空白脂質(zhì)體組、芹菜素脂質(zhì)體組，每組15只。飼養(yǎng)1周后，參考ZHAO等[10]介紹的方法建立大鼠1型糖尿病模型，腹腔注射1%鏈脲佐菌素(70 mg·kg-1)，正常對照組腹腔注射同劑量0.9%氯化鈉溶液。于注射后第3天、第7天以及第14天尾靜脈取血測定血糖。3次測定結(jié)果均大于16.7 mmol·L-1且實驗動物明顯出現(xiàn)多飲、多食、多尿以及體質(zhì)量下降等現(xiàn)象即說明造模成功。此后芹菜素脂質(zhì)體組尾靜脈給予芹菜素納米脂質(zhì)體(30 μg·kg-1)，空白脂質(zhì)體組尾靜脈給予等劑量空白納米脂質(zhì)體，每周3次，持續(xù)給藥12周。模型對照組以及正常對照組每周尾靜脈給予同劑量0.9%氯化鈉溶液。12周之后處死大鼠，迅速開胸，取出心臟，在左心室中部沿橫軸切取厚度為0.5 cm的心肌組織，放置在4%多聚甲醛中，剩余心肌細(xì)胞-80 ℃保存。

1.5心肌細(xì)胞TUNEL染色 按照羅氏TUNEL凋亡試劑盒說明書，將組織切片脫蠟、乙醇梯度浸洗，Proteinase K工作液透化，在切片上加TUENEL反應(yīng)液，蓋膜，37 ℃孵育60 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，DAB室溫顯色10 min，PBS沖洗3次，每次5 min，乙醇梯度脫水、透明和封片，于光鏡下觀察，每只大鼠做切片3張，每張切片隨機(jī)計數(shù)無重疊、具有代表性的5個400倍視野，以平均每100個細(xì)胞核中含凋亡細(xì)胞的數(shù)量作為心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)(apoptosis index，AI)。

1.6Western blotting檢測 將組織從-80 ℃冰箱中取出，在裂解緩沖液中勻漿，4 ℃離心，取上清液，高速離心，沉淀用Triton X-100緩沖液1 mL溶解，二喹啉甲酸試劑盒測定蛋白濃度備用。

每組按20 μg蛋白的溶液體積上樣，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電壓設(shè)為90 V，根據(jù)Maker移動情況適時終止電泳。進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，封閉，洗膜，加入1：5000稀釋的Bax以及Bcl-2一抗，4 ℃孵育過夜。TBST洗膜3次，加二抗室溫孵育1 h。以β-actin為參照，DAB顯色后應(yīng)用凝膠成像分析儀分析。

2 結(jié)果

2.1芹菜素納米脂質(zhì)體的性狀表征 掃描電鏡觀察空白及載藥納米脂質(zhì)體如圖1所示，空白及載藥納米脂質(zhì)體的形態(tài)圓整、分散性好、無粘連。動態(tài)光衍射法測定載藥及空白脂質(zhì)體的粒徑和Zeta電位分布結(jié)果顯示：空白及載藥納米脂質(zhì)體的平均粒徑分別(98.3±1.3)和(103.4±1.2) nm，說明載藥前后納米脂質(zhì)體的粒徑無明顯變化。同時空白及載藥納米脂質(zhì)體的多分散系數(shù)(polydispersity index,PDI)分別為0.102和0.108，均<0.2，說明載藥及空白納米脂質(zhì)體穩(wěn)定性好，粘連少。Zeta電位測定結(jié)果顯示：空白及載藥納米脂質(zhì)體的Zeta電位分別為(-23.8±1.6)和(19.8±1.3)mV，絕對值均大于15 mV。包封率是評價納米載體的重要質(zhì)量指標(biāo)，本次研究制備的納米脂質(zhì)體的包封率測定結(jié)果為(93.42±3.41)%，說明新型納米脂質(zhì)體能夠較好地實現(xiàn)對于芹菜素的包載。

2.2心肌細(xì)胞TUNEL凋亡染色結(jié)果 各組實驗大鼠TUNEL染色結(jié)果見圖2所示：正常心肌細(xì)胞核呈藍(lán)色，凋亡細(xì)胞核呈棕褐色，箭頭所示為凋亡心肌細(xì)胞的細(xì)胞核。與正常對照組比較，模型對照組大鼠及空白脂質(zhì)體干預(yù)組12周之后心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著升高(P<0.05)。與模型對照組及空白脂質(zhì)體組比較，經(jīng)過連續(xù)12周芹菜素脂質(zhì)體治療的實驗大鼠心肌細(xì)胞凋亡水平顯著下降(P<0.05)。

A.空白納米脂質(zhì)體；B.芹菜素納米脂質(zhì)體

A.blank nanoliposomes；B.apigenin-loaded nanoliposomes

Fig.1Blankanddrug-loadednanoliposomesobservedbyscanningelectronmicroscope

2.3心肌細(xì)胞Western blotting檢測結(jié)果 各實驗組大鼠心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2及Bax的Western blotting結(jié)果分析如圖3所示。與正常對照組比較，糖尿病大鼠及空白納米脂質(zhì)體干預(yù)大鼠心肌凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2顯著降低(P<0.01)，Bax顯著升高(P<0.01)。

A.正常對照組；B.模型對照組；C.空白脂質(zhì)體組；D.芹菜素脂質(zhì)體組。與正常對照組比較，*1P<0.05；與芹菜素脂質(zhì)體組比較，*2P<0.05

圖2 4組大鼠心肌細(xì)胞凋亡情況(n=15)

A.normal control group；B.model control group；C.blank nanoliposome group；D.apigenin loaded nanoliposome group.Compared with normal control group,*1P<0.05；compared with apigenin-loaded nanoliposome group,*2P<0.05

Fig.2Myocardialapoptosisinfourgroupsofrats(n=15)

A.正常對照組；B.模型對照組；C.空白脂質(zhì)體組；D.芹菜素納米脂質(zhì)體組。與正常對照組比較，*1P<0.01；與芹菜素脂質(zhì)體組比較，*2P<0.01

圖3 4組大鼠心肌Bcl-2及Bax的表達(dá)情況(n=15)

A.normal control group；B.model control group；C.blank nanoliposome group；D.apigenin-loaded nanoliposome group.Compared with normal control group,*1P<0.01；compared with apigenin-loaded nanoliposome group,*2P<0.01

Fig.3ExpressionofBcl-2andBaxinmyocardiuminfourgroupsofrats(n=15)

與模型對照組大鼠及空白納米脂質(zhì)體組比較，芹菜素納米脂質(zhì)體治療組的心肌Bcl-2含量顯著升高(P<0.01)，Bax含量顯著降低(P<0.01)。

3 討論

糖尿病引起的高血糖能夠通過氧化應(yīng)激損傷及Bax途徑等誘導(dǎo)患者心肌細(xì)胞凋亡，加重DCM的進(jìn)程[11-12]，最終導(dǎo)致患者死亡。芹菜素是一種天然的抗氧化劑[13]，能夠改善脂肪肝患者的血脂異常以及肥胖型糖尿病動物的的胰島素抵抗，降低其血糖水平[14]。同時芹菜素還能夠顯著降低缺血-再灌注損傷大鼠心肌細(xì)胞凋亡水平[15]。然而芹菜素存在溶解度低及在體吸收差等生物藥動學(xué)參數(shù)缺陷，限制了其臨床應(yīng)用。

載體質(zhì)量考察結(jié)果顯示，空白及載藥納米脂質(zhì)體的形態(tài)圓整，載藥前后形態(tài)無明顯變化。多分散系數(shù)PDI均小于0.2，說明本次實驗制備的載藥納米脂質(zhì)體分散性好，粘連少。粒徑分析及Zeta電位測定顯示，載藥及空白納米脂質(zhì)體的粒徑接近100 nm，Zeta電位絕對值均大于15，說明載藥及空白納米脂質(zhì)體的穩(wěn)定性好[16]。另外包封率測定結(jié)果顯示：芹菜素納米脂質(zhì)體的包封率高，說明采用薄膜水合結(jié)合超聲分散法能夠較好地實現(xiàn)對于芹菜素的包載。

12周之后模型對照組大鼠及空白脂質(zhì)體干預(yù)大鼠心肌細(xì)胞的凋亡指數(shù)顯著高于正常對照組(P<0.05)，說明各組大鼠DCM動物模型成功，其心肌細(xì)胞出現(xiàn)明顯凋亡。而經(jīng)過芹菜素納米脂質(zhì)體持續(xù)干預(yù)12周之后的糖尿病大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著低于模型對照組大鼠(P<0.05)，接近正常水平，說明芹菜素脂質(zhì)體能夠有效降低DCM引起心肌凋亡。

另外，本次實驗研究還初步考察了芹菜素納米脂質(zhì)體對于降低DCM大鼠心肌細(xì)胞凋亡水平的作用機(jī)制。研究表明，在目前已知的凋亡調(diào)節(jié)蛋白中，Bcl-2蛋白家族在各類刺激信號引起的凋亡中起到關(guān)鍵作用。Bcl-2和Bax蛋白水平的高低與凋亡調(diào)控直接相關(guān)，Bax升高，促進(jìn)細(xì)胞凋亡；Bcl-2增高，抑制細(xì)胞凋亡[17]。本次研究應(yīng)用Western blotting技術(shù)檢測了各組大鼠心肌細(xì)胞Bcl-2及Bax的蛋白含量。結(jié)果顯示，模型對照組大鼠及空白納米脂質(zhì)體組大鼠的心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax含量顯著提高(P<0.01)，抗凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2含量顯著降低(P<0.01)；與糖尿病及空白納米脂質(zhì)體組大鼠比較，經(jīng)過劑量芹菜素納米脂質(zhì)體干預(yù)后的糖尿病大鼠心肌細(xì)胞Bcl-2含顯著升高(P<0.01)，而Bax含量顯著下降(P<0.01)，說明芹菜素納米脂質(zhì)體可能通過調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax途徑降低DCM大鼠的心肌細(xì)胞凋亡水平。

本實驗證實了芹菜素納米脂質(zhì)體能夠有效抑制糖尿病引起的大鼠心肌細(xì)胞凋亡，為臨床DCM患者的防治提供了一種新的思路。