齊轉(zhuǎn)寧,許引虎,安長紅,彭寶林,王婧*
1(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅 蘭州,730070) 2(國家酵母技術(shù)研究推廣中心,湖北 宜昌,443003) 3(甘肅省葡萄與葡萄酒工程學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,甘肅 蘭州,730070)
白葡萄酒是典型的低酚類和低抗氧化性的酒精飲料,釀造過程中極易發(fā)生氧化褐變,導(dǎo)致不良色素形成,愉快香氣化合物減少[1]。SO2是葡萄酒釀造過程中常用的抗氧化劑與抑菌劑,但如果人體過量攝入會誘發(fā)部分敏感人群發(fā)生頭疼、哮喘、惡心等蓄積毒性,危害人體健康[2]。近年來葡萄酒釀造逐漸出現(xiàn)降低SO2用量的趨勢[3],因此尋找更安全和更有效的SO2替代物已勢在必行。
還原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)是一種重要的天然抗氧化劑,廣泛存在于生物細(xì)胞中,由L-谷氨酸、L-甘氨酸和半胱氨酸組成,其半胱氨酸上連接的巰基具有獨(dú)特的氧化還原與親核特性[1],能清除葡萄酒中的自由基,捕獲醌類物質(zhì),防止葡萄酒氧化褐變[4],減少一些酯類和萜烯類物質(zhì)的氧化損失,對葡萄酒果香與花香的保護(hù)具有重要作用[5]。2015年國際葡萄與葡萄酒組織允許GSH在葡萄酒釀造過程中應(yīng)用(最大添加量為20 mg/L)[6],但GSH具有不穩(wěn)定性,易被氧化,價格高昂,生產(chǎn)成本高的缺點(diǎn),這使其在葡萄酒中的應(yīng)用受到很大限制。
富含還原性谷胱甘肽的非活性干酵母制劑(glutathione-enriched inactive dry yeast preparations,g-IDYs)是將釀酒酵母經(jīng)二級擴(kuò)培后,在最后一級種子培養(yǎng)基中加入L-半胱氨酸、L-谷氨酸和甘氨酸,最終得到GSH含量較高的培養(yǎng)液,經(jīng)干燥處理得到的富含GSH的酵母干粉。這種GSH酵母衍生物制劑,不僅解決了GSH儲存不穩(wěn)定、易氧化、成本高等問題,也保持了酵母的天然活性營養(yǎng)成分。g-IDYs作為一種抗氧化劑在葡萄酒釀造中的應(yīng)用已引起國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。ANDUJAR-ORTIZ等[7]對g-IDYs在模擬酒中GSH釋放量進(jìn)行評價,證明添加質(zhì)量濃度0.3 g/L g-IDYs可釋放1~2 mg/L GSH;ANDUJAR-ORTIZ等[8]研究g-IDYs對歌海娜桃紅葡萄酒感官品質(zhì)的影響,證明與對照相比,g-IDYs可顯著提升葡萄酒的感官屬性;PIERGIORGIO[9]等研究不同抗氧化劑對白葡萄酒抗氧化性的影響,證明g-IDYs處理酒樣能有效清除DPPH·,延緩葡萄酒顏色的褐化。然而,g-IDYs對葡萄酒顏色和香氣的保護(hù)作用及效果還有待進(jìn)一步明確。
本試驗(yàn)以產(chǎn)自甘肅民勤釀酒葡萄種植基地的‘維歐尼’葡萄為試材,研究不同含量的谷胱甘肽酵母衍生物制劑對干白葡萄酒感官品質(zhì)的影響,旨在為谷胱甘肽酵母衍生物制劑在葡萄酒中的應(yīng)用及優(yōu)質(zhì)白葡萄酒的生產(chǎn)提供參考依據(jù)。
‘維歐尼’葡萄:2017年9月果實(shí)成熟期采摘于甘肅民勤釀酒葡萄種植基地(總糖24.5 °Brix,總酸8.63 g/L,pH 3.85)。
谷胱甘肽酵母衍生物制劑:FN401-GH(含4%谷胱甘肽的非活性干酵母,安琪酵母股份有限公司);FN502-GH(含10%谷胱甘肽的酵母抽取物,安琪酵母股份有限公司);F-G(含2%谷胱甘肽的非活性干酵母,法國樂福斯原料服務(wù)有限公司)。
活性干酵母BV818, 安琪酵母股份有限公司;果膠酶EX-V,法國Lallemand公司;2-辛醇(色譜純),美國Sigma公司;2,2-二苯基-1-苦肼(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl,DPPH),日本東京化成工業(yè)株式會社;2′-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(agreement of basic telecommunications services,ABTS),上海源葉生物科技有限公司。
氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(TRACE 1310)、單四級桿質(zhì)譜儀(ISQ)、紫外-可見分光光度儀(Genesis 10S),美國Thermo Scientific公司;色譜柱TG-WAX(60 m×0.25 mm,0.25 μm),美國Thermo Scientific公司;二乙基苯/碳分子篩/聚二甲基硅萃取頭(50/30 μm, diviny benzene/carboxne/poly dimenthyl-siloxane(DVB/CAR/PDMS)),美國Surpelco公司。
1.3.1 葡萄酒小容器發(fā)酵[10]
剔除葡萄原料中霉?fàn)€果、僵果、生青果并迅速破碎取汁,加入果膠酶(20 mg/L)及SO2(60 mg/L),24 h低溫(4 ℃)澄清。取清汁接種活性干酵母(200 mg/L),同時立即進(jìn)行谷胱甘肽酵母衍生物制劑處理,使之均勻分布于葡萄汁(取部分葡萄汁溶解谷胱甘肽酵母衍生物制劑,注入1 L發(fā)酵罐),并在17~19 ℃下進(jìn)行酒精發(fā)酵,當(dāng)發(fā)酵至還原糖質(zhì)量濃度低于4.0 g/L,及時將酒液和酒泥分離后裝入250 mL棕色瓶,補(bǔ)充SO2(60 mg/L)于17 ℃條件下密封保存120 d后取樣檢測。
谷胱甘肽酵母衍生物制劑添加量的篩選:葡萄汁接種活性干酵母(200 mg/L)后,立即添加不同質(zhì)量濃度梯度(100、200、300、400、500 mg/L)的3種谷胱甘肽酵母衍生物制劑,并以添加SO2為對照,待酒精發(fā)酵結(jié)束后,將處理所得澄清酒樣于30 ℃條件下加速氧化15 d,檢測氧化還原電位值,其值越低,葡萄酒抗氧化能力越強(qiáng)[11]。從中選出最低氧化還原電位值的用量即401-G 200 mg/L、502-G 400 mg/L、F-G 300 mg/L進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)(以上試驗(yàn)均設(shè)置3個平行)。釀酒試驗(yàn)在甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)葡萄與葡萄酒工程學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。
1.3.2 葡萄酒基本理化指標(biāo)測定
還原糖、酒精體積分?jǐn)?shù)、滴定酸和揮發(fā)酸含量測定參照GB/T15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[12];總酚含量測定參照李靜[13]的方法;褐變指數(shù)參照李慧琳[14]的方法。
1.3.3 抗氧化能力的測定
DPPH·清除率、ABTS·清除率和總還原力均參照李俊娥[15]的方法測定。
1.3.4 CIELab參數(shù)評價葡萄酒顏色
參考OIV-MA-AS2-11等[16-18]的方法。
1.3.5 揮發(fā)性成分分析
1.3.5.1 香氣成分富集
取8 mL酒樣于20 mL萃取瓶,加入2.5 g NaCl和10 μL 2-辛醇溶液(88.2 mg/L)作為內(nèi)標(biāo),密封,置于40 ℃水浴磁力攪拌30 min后頂空萃取30 min,取出萃取針并插入氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行解析。
1.3.5.2 GC-MS條件
參考魯榕榕[19]的方法。
1.3.5.3 香氣成分分析
定性分析:NIST-11、Wiley及香精香料譜庫檢索比對進(jìn)行定性,譜庫比對時要求匹配度大于800。
定量分析:采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行半定量分析,內(nèi)標(biāo)為2-辛醇。計算公式如式(1)和式(2)。
香氣物質(zhì)的質(zhì)量濃度=
(1)
(2)
1.3.6 感官分析
2.2.1 對基本理化指標(biāo)的影響
根據(jù)葡萄酒國家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 15037—2006),試驗(yàn)所得酒樣均屬于干型葡萄酒。由表1可知,F(xiàn)-G和401-G處理酒樣中還原糖含量顯著低于SO2處理(CK)(P<0.05),而502-G處理酒樣中還原糖含量與CK相比差異不顯著;3種不同谷胱甘肽酵母衍生物處理所得酒樣的酒精體積分?jǐn)?shù)、總酸、揮發(fā)酸和總酚均未發(fā)生顯著變化。
表1 不同谷胱甘肽酵母衍生物制劑處理酒樣的基本理化指標(biāo)
注:同列肩標(biāo)字母不同表示差異顯著(P<0.05);CK表示SO2處理;401-G表示富含4%的谷胱甘肽的非活性干酵母;502-G表示富含10%的谷胱甘肽的酵母提取物;F-G表示富含2%的谷胱甘肽非活性干酵母。下同。
2.2.2 谷胱甘肽酵母衍生物制劑對葡萄酒顏色的影響
2.2.2.1 對褐變指數(shù)的影響
葡萄酒的褐變指數(shù)越高,其酚類物質(zhì)被氧化的越多。由圖1所示,與SO2處理(CK)相比,葡萄汁中添加3種谷胱甘肽酵母衍生物制劑未顯示出對褐變的抑制作用。其中含有10%谷胱甘肽的酵母制劑502-G和富含2%的谷胱甘肽非活性酵母制劑F-G的處理組酒樣其褐變指數(shù)與對照相比,分別增加17.39%
圖1 不同谷胱甘肽酵母衍生物制劑處理酒樣的褐變指數(shù)
Fig.1 The browning index of different g glutathione-enriched inactive dry yeast preparations addition in wine sample
和8.70%,而富含4%的谷胱甘肽非活性酵母制劑401-G處理酒樣與對照的褐變指數(shù)差異不顯著。
2.2.2.2 對CIELab參數(shù)的影響
本試驗(yàn)采用CIELab系統(tǒng)來評價葡萄酒的顏色,其中參數(shù)a*表示紅綠色程度;b*表示黃藍(lán)色程度;L*表示明暗程度;C*表示飽和度;H*表示色調(diào),ΔE*表示總色差(即L*、a*、b*的綜合色差值),每一個樣品的顏色由L*、a*和b*三坐標(biāo)空間定義[21]。由表2可知,對照相比,3種不同谷胱甘肽酵母衍生物制劑處理的葡萄酒L*值分別顯著降低0.25%~1.14%,使葡萄酒顏色變暗;401-G、502-G處理a*值分別提高21.74%~29.19%,使葡萄酒色調(diào)向紅色方向移動,說明酒樣褐色素增多;502-G、F-G處理b*值分別顯著升高2.34%~5.34%,使色調(diào)向黃色方向移動,說明酒樣黃色素增多,而401-G處理黃色色調(diào)略有降低;ΔE*值在0.38~1.27,說明經(jīng)不同谷胱甘肽酵母衍生物制劑處理后葡萄酒顏色與對照相比存在微弱差異,因?yàn)閮H在ΔE*>3時,肉眼可直接觀察到酒樣之間的顏色差異[22]。
表2 不同谷胱甘肽酵母衍生物制劑處理酒樣的CIELab參數(shù)
2.2.3 對主要香氣揮發(fā)化合物的影響
3種不同谷胱甘肽酵母制劑處理的葡萄酒中共檢出75種香氣成分(表3)。包括18種醇類、34種酯類、9種酸類、4種酮類、3種酚類及7種萜烯類;供試酒樣香氣物質(zhì)總量在2 924.87~4 154.29 μg/L。與SO2處理(CK)相比,3種谷胱甘肽酵母衍生物制劑處理香氣物質(zhì)總含量分別顯著升高(P<0.05)26.77%~42.03%。因此,谷胱甘肽酵母衍生物制劑處理可顯著提高葡萄酒的香氣含量。
表3 不同谷胱甘肽酵母衍生物制劑處理酒樣的揮發(fā)性香氣化合物的GC-MS分析
續(xù)表3
序號香氣物質(zhì)香氣物質(zhì)質(zhì)量濃度/(μg·L-1)CK401-G502-GF-G B2710-十一烯酸乙酯-0.75±0.01--B283-羥基己酸乙酯-6.29±0.386.60±0.165.43±0.02B29棕櫚酸乙酯12.68±0.11b6.80±0.05e7.57±0.35c16.26±0.08aB30棕櫚酸異丙酯1.12±0.03a0.81±0.01b0.27±0.00c0.91±0.01bB31肉豆蔻酸異丙酯- 0.21±0.00--B32棕櫚酸甲酯-- -0.37±0.00B33油酸乙酯1.10±0.00- - -B34甲酸芳樟酯-- -0.48±0.01小計2 004.88±5.67b1 977.54±5.27c1 877.71±13.09d2 100.56±3.24a酸類C1乙酸6.92±0.04d12.26±0.24a8.94±0.09c10.38±0.07bC2己酸18.54±0.27d35.39±0.40b36.27±0.12a30.85±0.09cC3癸酸51.58±0.84d78.27±1.47b80.44±0.30a76.25±0.17cC4辛酸123.73±2.31d217.11±2.58b226.93±1.27a178.24±0.11cC59-癸烯酸8.24±0.09d15.73±0.09a14.43±0.06b13.76±0.10cC6(±)-3-羥基月桂酸-3.04±0.020.35±0.023.65±0.02C7順-5-十二碳烯酸-1.11±0.051.18±0.001.23±0.01C82-甲基己酸-6.55±0.076.47±0.03-C9異丁酸-- - -小計209.01±2.64c369.47±4.10a368.54±1.37a314.37±0.39b酮類-- - -D12-壬酮4.63±0.012.73±0.03-2.98±0.01D2甲基壬基甲酮1.23±0.02b3.06±0.01a2.03±0.03ab2.11±1.50abD32-十五烷酮0.09±0.00- - -D4香葉基丙酮-5.25±0.01--小計5.94±0.03b11.03±0.01a2.05±0.02c5.09±1.51b酚類F12,6-二叔丁基對甲酚16.56±0.11a9.46±0.17d10.38±0.30b9.84±0.08cF24-乙烯基-2-甲氧基苯酚0.67±0.03d1.58±0.01a1.24±0.02b0.86±0.02cF32,4-二叔丁基苯酚0.56±0.03a0.50±0.00b0.55±0.03a0.34±0.01c小計17.79±0.13a11.54±0.16c12.17±0.33b11.04±0.08d萜烯類G1香葉醇2.56±0.045.42±0.145.44±0.01-G2alpha-松油醇4.30±0.21d5.38±0.02b7.44±0.03a4.38±0.01dG3芳樟醇24.38±0.25c33.68±0.22a33.41±0.45a31.76±0.09bG4橙花醇-1.66±0.05--G5金合歡醇1.19±0.06- - -G6反式-橙花叔醇1.56±0.051.04±0.020.95±0.02-G7β-大馬士酮-- -1.23±0.04小計34.00±0.22c47.18±0.17a47.38±0.38a37.88±0.13b總計2 924.87±3.28c3 722.59±8.80ab3 733.79±9.78a3 707.98±11.10b
注:-表示未檢測出該香氣成分。
(1)酯類物質(zhì)。與CK相比,F(xiàn)-G處理葡萄酒酯類總含量顯著升高4.81%,而401-G與502-G處理分別顯著降低1.36%~6.31%(表3)。乙酸庚酯(玫瑰、梨與甜杏仁味)、反式-4-癸烯酸乙酯(蠟香、梨)等均僅在谷胱甘肽酵母衍生物制劑處理中檢測出;3種不同谷胱甘肽酵母衍生物制劑處理酒樣中癸酸乙酯含量分別顯著升高了1.04~2.26倍,且其氣味活性值(odorant activity value,OAV)大于1,賦予葡萄酒果香味。401-G與502-G處理水楊酸甲酯含量分別顯著升高29.15%~39.48%,而F-G處理降低6.27%;401-G與502-G處理乙酸苯乙酯含量分別顯著升高33.63%~46.73%,F(xiàn)-G處理顯著降低6.12%;但3種谷胱甘肽酵母衍生物制劑處理酒樣中辛酸乙酯、乙酸異戊酯、正己酸乙酯(OAV均大于1)含量均顯著降低;401-G與502-G處理苯乙酸乙酯含量均顯著升高,其賦予葡萄酒蜜蜂香味,401-G與F-G處理酒樣乙酸香葉酯含量均顯著升高。
(2)萜烯類。3種不同谷胱甘肽酵母衍生物制劑處理葡萄酒萜烯類總含量顯著高于CK,分別增加了11.42%~38.76%(表3)。與CK相比,401-G與502-G處理香葉醇含量均較高,但在F-G中未檢測出;401-G與502-G處理α-松油醇分別顯著升高25.12%~73.02%,F(xiàn)-G處理無顯著差異;3種不同谷胱甘肽酵母衍生物制劑處理酒樣的芳樟醇含量分別顯著增加30.27%~38.15%,其中401-G增加最多,502-G處理次之,此外其OAV值大于1,賦予葡萄酒玫瑰等花香。
2.2.4 主要香氣物質(zhì)的主成分分析
對供試酒樣的35種香氣物質(zhì)進(jìn)行主成分分析,結(jié)果表明2個主成分占總方差77.13%,分別占54.15%與22.98%。
A-各香氣化合物;B-谷胱甘肽酵母衍生物制劑處理酒樣圖2 各香氣化合物谷胱甘肽酵母衍生物制劑處理酒樣前兩個主成分分布圖
Fig.2 Biplot of principle component analysis of aroma components of all different white wine samples
如圖2-b所示,對照(CK)與圖2a主成分1負(fù)半軸的2,6-二叔丁基對甲酚的位置接近,說明CK中辛酸乙酯等香氣物質(zhì)貢獻(xiàn)更為突出,賦予葡萄酒香蕉等果香味,但圖2-b顯示其香氣物質(zhì)較少;3種谷胱甘肽酵母制劑處理的酒樣均分布于主成分1的正半軸(圖2-a),其中401-G分布在香氣較密集的區(qū)域,說明401-G處理增強(qiáng)酒樣香氣的復(fù)雜性。
2.2.5 ‘維歐尼’干白葡萄酒感官定量描述分析
如圖3所示,供試酒樣澄清度得分均大于4,說明葡萄酒澄清度良好,其中502-G處理澄清度最高,F(xiàn)-G處理澄清度最低;與SO2處理(CK)相比,3種谷胱甘肽酵母衍生物制劑處理葡萄酒香氣(純正度、優(yōu)雅度、協(xié)調(diào)度)、口感(純正度、余味)得分均升高,其中401-G處理口感(濃郁度、結(jié)構(gòu)、香氣持續(xù)性與余味)得分最高。
圖3 不同谷胱甘肽酵母衍生物制劑處理酒樣的感官定量描述分析
Fig.3 The sensory quantitative description analysis of different glutathione-enriched inactive dry yeast preparations addition in wine sample
2.2.6 谷胱甘肽酵母衍生物制劑對葡萄酒抗氧化性的影響
本試驗(yàn)用DPPH·清除率、ABTS·清除率與總還原力3種方法測定干白葡萄酒的總抗氧化性。由表4可知,與SO2處理(CK)相比,502-G與F-G處理酒樣的DPPH·清除率均顯著降低2.95%~3.36%;502-G與F-G處理總還原力降低9.68%~12.9%;401-G處理ABTS·清除率顯著降低6.87%。因此,酵母衍生物制劑處理酒樣總抗氧化性均弱于對照。
表4 不同谷胱甘肽酵母衍生物制劑處理酒樣的DPPH·清除率、還原力與ABTS·清除率
葡萄酒的氧化類型包括酶促氧化和非酶促氧化,前者一般發(fā)生在葡萄汁中,后者在葡萄汁及葡萄酒中均有發(fā)生,隨著發(fā)酵的進(jìn)行,主要以非酶氧化褐變?yōu)橹鱗2]。白葡萄酒中的酶促氧化褐變主要由羥基肉桂酸引起,其分布于細(xì)胞液泡中,多酚氧化酶分布于細(xì)胞質(zhì)中,當(dāng)漿果破碎后羥基肉桂酸暴露,與多酚氧化酶在氧氣存在的情況下,轉(zhuǎn)化為親電子的鄰醌[23],可與多酚、氨基酸和蛋白質(zhì)等發(fā)生聚合反應(yīng)形成褐色素,使葡萄酒的酒體變暗。但GSH可捕獲鄰醌,生成另一種酚酸S-glutathionyl caftaric acid(GRP),為無色物質(zhì)且非多酚氧化酶的底物,從而可減緩白葡萄酒的黃化。而非酶氧化主要是酚類物質(zhì)氧化產(chǎn)生H2O2,引發(fā)芬頓反應(yīng)(fenton reaction)生成氧化性極強(qiáng)的羥基自由基,將乙醇、酒石酸、糖等氧化為醛酮,其中生成的乙醛和乙醛酸可加深酒的氧化褐變[24]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,3種不同酵母衍生物制劑不同程度地促進(jìn)了葡萄酒顏色褐變(圖1與表2)。WEGMANN等[25]研究發(fā)現(xiàn),GSH不能抑制羧甲基橋聯(lián)(+)-兒茶素二聚體的形成,從而促進(jìn)黃色素生成。而SO2通過與H2O2反應(yīng)抑制羧甲基橋聯(lián)(+)-兒茶素二聚體的形成,從而抑制了黃色素的形成。另外,本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),谷胱甘肽酵母衍生物制劑對葡萄酒總酚含量無影響(表1),這與WEBBER等[26]在起泡基酒中添加GSH的研究結(jié)果類似。
葡萄酒中酯類物質(zhì)主要來自微生物產(chǎn)生醇類與酸類之間化學(xué)反應(yīng)及酒精發(fā)酵期間酵母活動產(chǎn)生[27],賦予葡萄酒花香及果香。研究表明葡萄酒酯類含量隨著儲存時間延長不斷降低[28],這種變化主要由酯化、水解和羥自由基氧化等反應(yīng)引起[29],僅F-G處理是葡萄酒酯類總含量顯著升高,從而提高白葡萄酒的新鮮感及果味特征。這可能是因?yàn)閹€基對葡萄酒香氣具有保護(hù)作用。葡萄中萜烯類物質(zhì)來自葡萄果皮、果?;蚍N子,屬于葡萄酒的品種香氣[30],賦予了葡萄酒愉快的花香及果香味,但這些物質(zhì)容易氧化[5]。本試驗(yàn)研究表明,401-G與502-G處理酒樣萜烯類物質(zhì)含量顯著高于SO2處理(CK)(表3),已有大量研究報道,添加GSH可抑制葡萄酒中萜烯類物質(zhì)含量的減少[28]。目前關(guān)于谷胱甘肽保護(hù)葡萄酒香氣的機(jī)理仍需進(jìn)一步研究。
白葡萄汁中添加富含還原性谷胱甘肽的酵母衍生制劑均能夠顯著增加葡萄酒中酯類與萜烯類物質(zhì)含量,顯著提升干白葡萄酒香氣品質(zhì),但對干白葡萄酒顏色褐變不具有抑制作用,添加10%谷胱甘肽的酵母抽取物制劑和2%谷胱甘肽的非活性干酵母制劑能夠使干白葡萄酒褐變程度增加,酒體亮度降低,黃色色調(diào)增加,綠色色調(diào)減弱;此外,不同谷胱甘肽酵母衍生制劑處理酒樣的抗氧化性低于SO2處理。