鹵料提取物對(duì)氧化誘導(dǎo)鴨肉肌原纖維蛋白功能特性和結(jié)構(gòu)的影響

梅甜恬，唐潔，夏楊毅,2*，唐棋，張建華，張國(guó)星

1(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶，400715) 2(重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，重慶，400715)

蛋白氧化包括直接被活性物質(zhì)誘導(dǎo)和間接與氧化應(yīng)激副產(chǎn)物反應(yīng)引起共價(jià)修飾[1]，是一個(gè)自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)過(guò)程，主要由羥自由基(·OH)、肌紅蛋白自由基和脂類(lèi)次級(jí)氧化產(chǎn)物誘導(dǎo)引發(fā)，其中·OH被認(rèn)為是活性氧自由基中氧化能力最強(qiáng)的自由基[2]。在肉制品加工貯藏過(guò)程中，肌原纖維蛋白(myofibrillar protein, MP)容易受到自由基攻擊發(fā)生氧化，致使結(jié)構(gòu)和功能特性發(fā)生變化，從而降低肉類(lèi)品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，如嫩度和持水性下降[3]，影響蛋白質(zhì)消化吸收[4]等。

二丁基羥基甲苯(butylated hydroxytoluene,BHT)、丁基羥基茴香醚(butyl hydroxyanisole,BHA)等[5]是常用的合成抗氧化劑，具有較好的抗氧化效果，但對(duì)人體有潛在危害，如誘發(fā)畸形和癌癥[6-7]。香辛料是一類(lèi)具有芳香和辛香等風(fēng)味的天然植物，主要用于改善食品風(fēng)味，包括增加香氣、著色及消除異味等。同時(shí)，還具有抗氧化[8]的生理功能，可以作為天然抗氧化劑，如桂皮[9]、八角[10]、迷迭香[11]、丁香[12]等。復(fù)配香辛料在食品加工、餐飲等行業(yè)應(yīng)用眾多，其中復(fù)合香辛料鹵制是醬鹵肉制品重要的加工環(huán)節(jié)之一，賦予了鹵肉制品獨(dú)特的風(fēng)味，但對(duì)鹵料的抗氧化特性研究較少。實(shí)驗(yàn)以醬鹵肉制品鹵料配方為參照，分析鹵料對(duì)肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)和功能特性的影響，探討鹵制過(guò)程中鹵料抗氧化作用，也為鹵料作為抗氧化劑應(yīng)用于醬鹵肉制品保藏提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鴨腿肉，重慶北碚永輝超市，放入-18 ℃低溫冰箱凍藏；肉桂、良姜、八角等香辛料，重慶市天生農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

K2HPO4、疊氮鈉、二硝基苯肼、三氯乙酸:分析純，成都市科隆化工試劑廠；乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA)、鹽酸胍、乙二胺四乙酸(EDTA)、十二烷基磺酸鈉(SDS)：分析純，Biosharp公司；牛血清蛋白：分析純，上海伯奧生物科技有限公司； SDS-PAGE凝膠制備試劑盒，北京索來(lái)寶科技有限公司。

1.2 儀器設(shè)備

水浴恒溫振蕩器(SHZ-B)，上海龍躍儀器設(shè)備有限公司；超低溫冰箱(DW-25W518)，青島海爾電器有限公司；可見(jiàn)分光光度計(jì)(722-P)，上海現(xiàn)科儀器有限公司；冷凍離心機(jī)(Avanti J-30I)，美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司；內(nèi)切式勻漿機(jī)(XHF-D)，寧波新芝生物科技有限公司；漩渦混勻器(XW-80A)，上海青浦滬西儀器廠；拉曼光譜儀(DXR2)，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；醫(yī)用冷凍離心機(jī)(TGL-16)，四川蜀科儀器有限公司；小型垂直電泳槽(Power Pac Basic)，美國(guó)Bio-Rad公司；凝膠成像系統(tǒng)(G:BOX)，美國(guó)基因公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

1.3.1.1 鹵料提取物制備

鹵料配方F參考武蘇蘇等[13]方法略作修改。肉桂、良姜12%；八角、香葉、山奈、白芷、小茴香、甘草、陳皮、草果8%；砂仁、豆蔻4%；辣椒3%；丁香1%。

提取方法參考賈娜等[14]方法略作修改。鹵料洗凈后烘干，搗碎，過(guò)60目篩，分別取50 g到三角瓶中，按料液比1∶8添加蒸餾水/體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇，在55 ℃水浴搖床中搖勻12 h，用0.45 μm濾膜真空抽濾，按料液比1∶7向殘?jiān)屑尤胝麴s水/體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇，重提12 h后過(guò)濾。合并濾液并在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮，最后分別用蒸餾水/體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇定容至100 mL，得到鹵料提取物(質(zhì)量濃度相當(dāng)于500 g/L)，將醇提物和水提物分別標(biāo)記為FC、FS，保存于4 ℃冰箱中待用。

1.3.1.2 肌原纖維蛋白提取

參考CAO等[15]的方法略有修改。稱(chēng)取 10 g鴨肉絞碎，加入4倍體積冰浴緩沖液 A(20 mmol/L磷酸鹽緩沖液，100 mmol/L NaCl，2 mmol/L EGTA，10 mmol/L K2HPO4，pH 6.25)混合均勻。紗布過(guò)濾除去筋腱結(jié)締組織，10 000 r/min勻漿 60 s，5 500 r/min，4 ℃，離心10 min取沉淀，重復(fù)以上操作2次。離心后向沉淀中加入 4倍體積冰浴緩沖液 B(100 mmol/L NaCl，1 mmol/L NaN3，pH 6.25)，2 000 r/min勻漿 60 s。5 500 r/min，4 ℃，離心10 min，棄上清液取沉淀，重復(fù)上述操作，最后所得沉淀即為MP膏體。

1.3.1.3 肌原纖維蛋白氧化誘導(dǎo)

用pH值6.25的磷酸鹽緩沖溶液稀釋MP膏體，雙縮脲法測(cè)定蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度并調(diào)節(jié)至40 mg/mL。將其分為5組，第1組不添加抗氧化劑也不進(jìn)行氧化處理(記為NonOx組)，其余4組進(jìn)行氧化處理，其中第2組不添加抗氧化劑(記為Ox組)，第3～5組分別添加體積分?jǐn)?shù)0.05%(以蛋白終濃度計(jì))的FC、FS和0.01%BHT(分別記為Ox+FC組、Ox+FS組和Ox+0.01%BHT組)，攪拌均勻后加入Feton氧化體系(10 μmol/L FeCl3，100 μmol/L抗壞血酸，1 mmol/L H2O2)于4 ℃氧化12 h，用冷凍離心機(jī)8 000 r/min離心10 min，取沉淀。

1.3.2 指標(biāo)測(cè)定

1.3.2.1 多酚含量測(cè)定

采用Folin-酚法[16]測(cè)定多酚含量。以沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，將其配制質(zhì)量濃度為100 μg/mL沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。分別吸取0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于10 mL比色管中，加入0.2 mL Folin-酚試劑，混勻，再加入0.5 mL飽和Na2CO3溶液，用蒸餾水稀釋至10 mL，27 ℃水浴1 h后，在波長(zhǎng)765 nm處測(cè)量吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程Y=0.009 7x+0.062 5，R2=0.998 3。

準(zhǔn)確吸取0.5 mL鹵料提取物于10 mL比色管中，根據(jù)上述方法測(cè)定吸光度值。通過(guò)回歸方程計(jì)算多酚含量，以每克復(fù)合香辛料計(jì)，單位為mg/g。

1.3.2.2 還原力測(cè)定

參考袁婭等[17]的測(cè)定方法略有改動(dòng)。分別吸取0.4 mL 5 mg/mL的FC、FS和BHT溶液(由體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇配制，且體積分?jǐn)?shù)為0.01%、0.02%)于試管中。依次加入1.8 mL 0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液(pH 6.6)和1 mL 10%鐵氰化鉀溶液。混合均勻后于50 ℃水浴30 min，急速冷卻。加入1 mL 10%三氯乙酸溶液，4 000 r/min離心15 min。取1 mL上清液，依次加入2 mL蒸餾水和0.2 mL質(zhì)量濃度為1 mg/mL的三氯化鐵溶液，混合均勻。放置10 min后，在波長(zhǎng)700 nm處測(cè)吸光度，以吸光度值(A700nm)表示還原能力大小。

1.3.2.3 羰基含量測(cè)定

參考OLIVE[18]等的方法略作改動(dòng)。用雙縮脲法測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度并調(diào)節(jié)至5.0 mg/mL。取2 mL樣品溶液于離心管中，加入2 mL 10 mmol/L的2,4-二硝基苯肼(對(duì)照組加入 2 mol/L HCl，其余操作相同)，室溫暗處?kù)o置1 h(每隔10 min漩渦1次)。隨后加入2 mL 20%三氯乙酸，10 000 r/min離心15 min，取沉淀。用2 mLV(乙醇乙酯)∶V(乙醇)=1∶1混合液洗滌沉淀3次，加入5 mL pH 6.5鹽酸胍溶液，37℃下溶解沉淀20 min，于10 000 r/min離心5 min，去除不溶性部分。樣品在370 nm處測(cè)定吸光值，羰基濃度用摩爾消光系數(shù)22.0 mo1/(L·cm)來(lái)計(jì)算，羰基含量表示為nmol/mg。

1.3.2.4 總巰基含量測(cè)定

參考SIMPLICIO[19]等的方法。取1 mL質(zhì)量濃度4 mg/mL的樣品溶液，加入8 mL Tris-甘氨酸溶液，然后經(jīng)均質(zhì)和10 000 r/min離心15 min，除去不溶性蛋白。取4.5 mL上清液加入0.5 mL 10 mmol/L Ellman試劑，30 min后在412 nm處測(cè)定吸光值。空白不加蛋白溶液，其他方法相同。巰基濃度計(jì)算使用摩爾消光系數(shù)13 600 M-1·cm-1，計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

其中A，樣品在412 nm處的吸光度；C，樣品的蛋白的濃度，mg/mL。

1.3.2.5 濁度測(cè)定

參考韓敏義等[20]的方法測(cè)定，用冰浴磷酸鹽緩沖溶液(0.6 mol/L NaCl，50 mmol/L Na2HPO4，pH 6.25)溶解肌原纖維蛋白，2 800 r/min混合勻漿36 s，最終稀釋為質(zhì)量濃度2.5 g/L的溶液。在室溫下放置20 min后，以磷酸鹽緩沖液為空白，在波長(zhǎng)340 nm處測(cè)定吸光值，以該吸光值為肌原纖維蛋白的濁度。

1.3.2.6 溶解度測(cè)定

參考AGYARE等[21]的方法測(cè)定，將1.3.2.5中得到的2.5 mg/mL的蛋白質(zhì)溶液在4 ℃下靜置1 h，5 500 r/min 4 ℃離心15 min，取上清液，用雙縮脲法測(cè)定肌原纖維蛋白溶液的濃度，空白用未添加肌原纖維蛋白的磷酸鹽緩沖液替代。肌原纖維蛋白溶解度的計(jì)算公式為：

(2)

1.3.2.7 疏水性測(cè)定

參考CHIN等[22]的方法測(cè)定，用冰浴20 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH 6.25)溶解肌原纖維蛋白，2 800 r/min混合勻漿36 s，最終稀釋為質(zhì)量濃度5 g/L的蛋白溶液。取1 mL樣液于離心管中并加入200 μL 1mg/mL溴酚藍(lán)，室溫漩渦10 min，8 000 r/min離心10 min，取上清液，稀釋10倍后在波長(zhǎng)595 nm處測(cè)定吸光值，空白用未添加肌原纖維蛋白的磷酸鹽緩沖液替代。肌原纖維蛋白表面疏水性的計(jì)算如公式(3)所示：

(3)

1.3.2.8 SDS-PAGE電泳分析

采用SDS-PAGE凝膠制備試劑盒制備凝膠，電泳樣品用樣品溶解液(內(nèi)含4% SDS，10% β-巰基乙醇，20%甘油，0.02%溴酚藍(lán)，0.125 mol/L Tris-HCl緩沖液，pH 6.8)配制成最終質(zhì)量濃度為5 mg/mL的溶液，漩渦混合1 min，100℃煮沸3 min，于10 000 r/min離心10 min備用。分離膠為12%，濃縮膠為5%，將制好的膠板取下，安裝至電泳槽，上樣量15 μL，MAKER上樣5 μL。開(kāi)始電流為15 mA，待樣品進(jìn)入分離膠后改為恒流25 mA，當(dāng)指示劑遷移至距離膠下端1 cm處關(guān)閉電源。染色1 h后脫色12 h，用凝膠系統(tǒng)成像。

1.3.2.9 拉曼光譜分析

取氧化誘導(dǎo)后的肌原纖維蛋白膏，用于拉曼光譜分析。激光波長(zhǎng)785 nm，功率120 mW，曝光時(shí)間60 s，掃描3次，測(cè)試范圍400～3 050 cm-1，測(cè)試完成后以苯丙氨酸(1 004 cm-1)為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行歸一化，Peakfit擬合分峰；用OMNIC對(duì)拉曼光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行平滑、基線校正。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Microsoft Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)處理；采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)；采用Origin Pro 9.0作圖。所有試驗(yàn)均做3次重復(fù)測(cè)定，試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹵料提取物的多酚含量

香辛料的抗氧化活性與其多酚含量密切相關(guān)，且多酚與蛋白質(zhì)相互作用會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能特性產(chǎn)生影響[23]。由圖1可知，F(xiàn)C和FS多酚含量分別為35.64、29.09 mg/g，F(xiàn)C多酚含量顯著高于FS(P<0.05)。有研究發(fā)現(xiàn)，單一香辛料的丁香醇提物多酚含量低于水提物、桂皮醇提物多酚含量高于水提物[24-25]，表明香辛料提取物的多酚含量隨提取方式的不同而有所差異。香辛料中含有多酚、鞣酸等多酚類(lèi)物質(zhì)，可通過(guò)清除自由基、螯合金屬離子及還原能力達(dá)到抗氧化效果[24]。來(lái)源不同的香辛料所含抗氧化物質(zhì)不同，如丁香中的丁香子酚、姜中的姜黃素、桂皮中的桂皮酚等[8]，其抗氧化效果也有所差異，研究發(fā)現(xiàn)，香辛料提取物的抗氧化效果隨著濃度的升高而增加[24]。因此，鹵料提取物的多酚含量受復(fù)配比例及提取條件影響，提取工藝仍有待進(jìn)一步優(yōu)化。

圖1 不同鹵料提取物的多酚含量

Fig.1 Polyphenol content of different halogen extracts注：不同小寫(xiě)字母表示不同組間差異顯著(P<0.05)，下同。

2.2 鹵料提取物的還原力

在鐵氰化鉀體系吸光度值越高代表著試驗(yàn)物質(zhì)的還原能力越強(qiáng)。由圖2可知，F(xiàn)C、FS與0.01% BHT、0.02% BHT的還原力大小順序?yàn)?.02% BHT>FC>0.01% BHT>FS，其中0.02% BHT的還原力顯著高于FC、FS和0.01% BHT(P<0.05)，0.01% BHT的還原力顯著高于FS(P<0.05)，但與FC差異不顯著(P>0.05)，表明5 mg/mL的FC和FS的還原力與0.01% BHT相似，因此選擇0.01% BHT為對(duì)照進(jìn)行試驗(yàn)。

圖2 鹵料提取物與BHT的還原力比較

Fig.2 Comparison of reducing force of brine extracts andBHT

2.3 鹵料提取物對(duì)氧化誘導(dǎo)肌原纖維蛋白羰基含量的影響

羰基含量被普遍認(rèn)為是判斷蛋白氧化程度的指標(biāo)之一，且蛋白質(zhì)的氧化程度隨著羰基含量增加而升高[26]。由圖3可知，Ox組羰基含量顯著高于NonOx組(P<0.05)，·OH可與蛋白質(zhì)直接作用，誘導(dǎo)蛋白質(zhì)肽鏈斷裂及側(cè)鏈基團(tuán)氧化形成羰基化合物[27]，導(dǎo)致氧化后蛋白質(zhì)羰基含量升高。Ox+FC、Ox+FS和Ox+0.01%BHT組羰基含量與Ox組相比顯著降低了5.80%、6.16%、4.35%(P<0.05)，顯著高于NonOx組(P<0.05)，但3者之間差異不顯著(P>0.05)。有研究發(fā)現(xiàn)[28]，丁香提取物可抑制·OH氧化誘導(dǎo)的豬肉肌原纖維蛋白羰基含量的上升，這與本研究結(jié)果相似。香辛料中的多酚含有羥基氫，可與·OH反應(yīng)，降低蛋白質(zhì)的氧化程度，從而抑制羰基的生成。因此，鹵料的抗氧化效果與0.01%BHT類(lèi)似，均可抑制羰基生成。

圖3 鹵料提取物對(duì)氧化誘導(dǎo)MP羰基含量的影響

Fig.3 Effect of halogen extracts on the carbonyl content of oxidized myofibrillar protein

2.4 鹵料提取物對(duì)氧化誘導(dǎo)肌原纖維蛋白總巰基含量的影響

由圖4可知，Ox組總巰基含量顯著低于NonOx組(P<0.05)，可能原因是氧化導(dǎo)致埋藏在蛋白質(zhì)內(nèi)部的巰基暴露出來(lái)，轉(zhuǎn)化為二硫鍵[29]，或巰基進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為次磺酸或其他氧化產(chǎn)物[2]。Ox+FC、Ox+FS和Ox+0.01%BHT組總巰基含量均顯著低于NonOx組(P<0.05)，Ox+FC組總巰基含量顯著高于Ox組(P<0.05)，Ox+FS、Ox+0.01%BHT組的總巰基含量高于Ox組，但差異不顯著(P>0.05)，Ox+FC組總巰基含量顯著高于Ox+0.01%BHT組(P<0.05)，但與Ox+FS組差異不顯著(P>0.05)。復(fù)合香辛料中的多酚可與MP中的巰基相互作用，形成復(fù)合物，從而抑制了巰基的轉(zhuǎn)化[30]，因此添加復(fù)合香辛料組的巰基含量高于Ox組，在本研究中添加FC可減少蛋白質(zhì)的巰基的轉(zhuǎn)化，且其效果優(yōu)于0.01%BHT。

圖4 鹵料提取物對(duì)氧化誘導(dǎo)肌原纖維蛋白總巰基含量的影響

Fig.4 Effects of halogen extracts on total thiols content of oxidized myofibrillar proteins

2.5 鹵料提取物對(duì)氧化誘導(dǎo)肌原纖維蛋白表面疏水性、濁度和溶解度的影響

由表1可知，Ox組的表面疏水性和濁度顯著高于NonOx組(P<0.05)，而溶解度顯著低于NonOx組(P<0.05)，出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是氧化使蛋白質(zhì)分子的表面疏水基團(tuán)暴露出來(lái)，MP的疏水性增加[31];濁度可以反映蛋白質(zhì)的聚集程度，蛋白質(zhì)疏水性增加、二硫鍵形成均會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)之間發(fā)生交聯(lián)聚集[32]，使得濁度增加，而蛋白質(zhì)表面疏水性和濁度的提高會(huì)導(dǎo)致其溶解性下降。

氧化誘導(dǎo)后，Ox+FC和Ox+0.01%BHT組的表面疏水性和濁度顯著低于Ox組(P<0.05)，與NonOx組差異不顯著(P>0.05)，且Ox+FC和Ox+0.01%BHT組差異不顯著(P>0.05)。而Ox+FS組的疏水性顯著高于NonOx組(P<0.05)，低于Ox組，但差異不顯著(P>0.05)，濁度高于NonOx組，但顯著低于Ox組(P<0.05)。Ox+FC、Ox+FS和Ox+0.01%BHT組的溶解度均顯著低于NonOx組(P<0.05)，顯著高于Ox組(P<0.05)，且Ox+FC組的溶解度顯著高于Ox+FS和Ox+0.01%BHT組(P<0.05)。賈娜等[33]研究發(fā)現(xiàn)0.1%肉桂、丁香提取物可降低蛋白質(zhì)表面疏水性，改善豬肉糜冷藏過(guò)程中蛋白質(zhì)溶解度的下降，這與本研究的結(jié)果相似。與Ox組相比，添加鹵料提取物后，蛋白質(zhì)的表面疏水性和濁度下降，溶解性提高的原因可能是，鹵料所含多酚的芳香環(huán)可以通過(guò)疏水作用與蛋白質(zhì)上的氨基酸疏水性側(cè)鏈形成復(fù)合物，阻止了疏水性基團(tuán)的暴露[34]，從而導(dǎo)致可與MP結(jié)合的溴酚藍(lán)含量減少，降低了MP的疏水性，其聚集程度隨之下降，濁度降低，溶解度提高。綜上所述，添加FC可以明顯降低蛋白質(zhì)的表面疏水性和濁度，改善蛋白質(zhì)的溶解度，其抗氧化效果與添加0.01%BHT類(lèi)似，均優(yōu)于添加FS。

表1 鹵料提取物對(duì)氧化誘導(dǎo)肌原纖維蛋白表面疏水性、濁度和溶解度的影響

2.6 SDS-PAGE電泳分析

肌原纖維蛋白的分子量較為廣泛，肌原纖維蛋白中肌球蛋白重鏈(myosin heavy chain, MHC)、肌動(dòng)蛋白(actin)、原肌球蛋白(tropomyosin)和肌原蛋白(troponin)含量較多，副肌球蛋白(paramyosin)和肌球蛋白輕鏈(myosin light chain, MLC)含量較少。由圖5可知，與NonOx組相比，其余4個(gè)組MHC條帶密度明顯減弱，表明氧化后，肌原纖維蛋白的MHC和MLC發(fā)生了聚合或降解。

圖5 不同組氧化誘導(dǎo)MP的SDS-PAGE電泳分析

Fig.5 SDS-PAGE electrophoresis analysis of myofibrillar proteins from different treatment groups

氧化后Ox組明顯沒(méi)有MLC條帶，但Ox+FC、Ox+FS和Ox+0.01%BHT組的MLC條帶仍然存在，只是較NonOx組淺，表明鹵料抗氧化效果與0.01%BHT類(lèi)似，可保護(hù)蛋白質(zhì)，減緩蛋白質(zhì)的氧化降解。

2.7 鹵料提取物對(duì)氧化誘導(dǎo)肌原纖維蛋白拉曼光譜的影響

拉曼光譜的酰胺I帶(1 655±5 cm-1)可以有效反映肌原纖維蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)[35]。由圖6可知，氧化前后，拉曼光譜的酰胺I帶吸收峰強(qiáng)度減弱，且Ox組的酰胺I帶吸收峰較其他組低，說(shuō)明·OH誘導(dǎo)的氧化可以導(dǎo)致蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。從表2可以看出，與NonOx組相比，Ox組的α-螺旋(1 645～1 657 cm-1)含量顯著降低(P<0.05)，β-折疊(1 665～1 680 cm-1)含量顯著增加(P<0.05)。當(dāng)?shù)鞍装l(fā)生氧化后，蛋白質(zhì)的酰胺I帶向長(zhǎng)波長(zhǎng)移動(dòng)，α-螺旋解旋而部分轉(zhuǎn)化成β-折疊，肽鏈重排，蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[36]。由于蛋白的結(jié)構(gòu)緊密程度和構(gòu)象穩(wěn)定性大大降低，包埋于分子內(nèi)部的疏水性殘基暴露出來(lái)，增強(qiáng)了肌球蛋白分子間的疏水相互作用，引起蛋白質(zhì)的聚合[37]，因此氧化后，蛋白質(zhì)表面疏水性和濁度升高。

圖6 鹵料提取物對(duì)氧化誘導(dǎo)MP拉曼光譜的影響

Fig.6 Raman spectroscopic analysis of oxidation inducedmyofibrillar treated by halogen extracts

Ox+FC和Ox+0.01%BHT組的α-螺旋含量均顯著高于Ox組(P<0.05)，低于NonOx組，但差異不顯著(P>0.05)，β-折疊含量均顯著低于Ox組(P<0.05)，高于NonOx組，但差異不顯著(P>0.05)。Ox+FS組的α-螺旋含量顯著低于Ox+FC組(P<0.05)，β-折疊含量則顯著高于Ox+FC組(P<0.05)。多酚在一定程度上可以延緩酰胺I帶的位移，抑制蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化，降低蛋白氧化聚合程度，從表2可知，添加FC與0.01%BHT的效果類(lèi)似，可以較好的保護(hù)α-螺旋結(jié)構(gòu)，減少β-折疊結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生，從而降低蛋白質(zhì)的表面疏水性和濁度，這與上述疏水性和濁度結(jié)果一致。

表2 鹵料對(duì)氧化誘導(dǎo)MP二級(jí)結(jié)構(gòu)含量的影響

3 結(jié)論

FC的多酚含量顯著高于FS(P<0.05)。FC和FS均可抑制羰基生成，保護(hù)巰基，降低蛋白質(zhì)的表面疏水性和濁度，提高其溶解度，但FC的抗氧化效果更好。綜合SDS-PAGE電泳及拉曼光譜分析，添加FC比FS更能有效延緩蛋白的酰胺I帶向長(zhǎng)波長(zhǎng)移動(dòng)，保護(hù)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，能有效抑制蛋白質(zhì)氧化降解、變性聚集?？偟膩?lái)說(shuō)，F(xiàn)C的蛋白質(zhì)抗氧化效果與0.01%BHT類(lèi)似，優(yōu)于FS的蛋白抗氧化效果。今后，鹵料的提取工藝有待進(jìn)一步優(yōu)化，鹵料提取物的質(zhì)量濃度對(duì)蛋白質(zhì)的抗氧化效果的影響仍需繼續(xù)研究，相應(yīng)的抗氧化性能及其機(jī)理仍需詳細(xì)探討，并可以研究對(duì)醬鹵肉制品貯藏品質(zhì)的影響。