乳酸脫氫酶與葡萄糖脫氫酶偶聯(lián)催化合成D-苯基乳酸

羅希，楊澤鋒，臧瑜，李寧，王鑫情，付永前

(臺(tái)州學(xué)院 生物質(zhì)資源研究所，浙江 臺(tái)州，318000)

D-苯基乳酸(D-phenyllactic acid,D-PLA)，是一種由乳酸菌等微生物產(chǎn)生的天然抑菌物質(zhì)，安全無(wú)毒，具有抗菌譜廣、水溶性好、穩(wěn)定性高、有效pH范圍寬等特點(diǎn)，在食品工業(yè)中有著廣闊的應(yīng)用前景[1-4]。D-PLA用于化妝品中，不僅能有效防止微生物污染引起的感染，而且具有去皺、亮膚的功效[5]。D-PLA可作為動(dòng)物飼料添加劑取代抗生素，減少家畜大腸內(nèi)大腸桿菌的數(shù)量，提高家畜體內(nèi)免疫相關(guān)類血細(xì)胞的數(shù)量，促進(jìn)個(gè)體生長(zhǎng)[6-7]。D-PLA可作為單體生產(chǎn)高分子聚合物聚苯乳酸，具有高水平的紫外吸收特性[8-9]。除此之外，D-PLA是丹參素衍生物，臨床上可治療冠心病[10-11]，也可作為化學(xué)原料合成非蛋白氨基酸、抗HIV試劑和降血糖劑等[12-13]。D-PLA在食品、化妝品、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、化學(xué)工業(yè)等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用且具有巨大的市場(chǎng)需求。

乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)是D-PLA酶法合成的關(guān)鍵酶，可催化苯丙酮酸鈉(sodium phenylpyruvate, PPA)還原生成D-PLA。大腸桿菌(E.coli) BL21是外源蛋白表達(dá)通用宿主，易于操作和控制，近年來(lái)多株LDH重組大腸桿菌被構(gòu)建，以PPA為底物不對(duì)稱還原合成D-PLA，但LDH基因來(lái)源較少，主要集中在乳桿菌屬[14-16]Wickerhamiafluorescens[17]，Pediococcusacidilactici[18]，Pediococcuspentosaceus[19]等少數(shù)微生物菌種。ZHU等對(duì)LactobacilluspentosusD-乳酸脫氫酶進(jìn)行定點(diǎn)突變，以E.colipET28a-ldhY52V為催化劑在水-正辛烷兩相介質(zhì)中催化合成D-PLA，時(shí)空產(chǎn)率達(dá)到310.08 g/(L·d)，為目前已知的最高生產(chǎn)強(qiáng)度[20]。除對(duì)已有LDH進(jìn)行分子改造提高催化效率外，新酶的發(fā)現(xiàn)也是生物催化領(lǐng)域的重要課題。LDH屬于氧化還原酶家族，其催化活性依賴于煙酰胺輔酶[nicotinamide adenine nucleotide (phosphate), NAD(P)H]，輔酶將氫和電子傳遞給底物羰基，使底物還原[21]。而煙酰胺類輔酶價(jià)格昂貴，穩(wěn)定性低，難以重復(fù)利用，增加了反應(yīng)成本，極大地制約了乳酸脫氫酶的工業(yè)化應(yīng)用。因此，煙酰胺輔酶的再生效率在工業(yè)生物催化中起著至關(guān)重要的作用[22-23]。為了克服輔酶的供應(yīng)問題，葡萄糖脫氫酶(glucose dehydrogenase, GDH)常被用于輔酶的再生[24-26]。本實(shí)驗(yàn)挖掘了1株新型LDH，與GDH偶聯(lián)，在實(shí)現(xiàn)輔酶再生的同時(shí)催化合成D-PLA(圖1)。

圖1 雙酶耦聯(lián)不對(duì)稱還原PPA合成D-PLA

Fig.1 Asymmetric reduction of PPA to D-PLA bycoupled LDH and GDH

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

TaqDNA聚合酶、PfuDNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶:Takara；胰蛋白胨和酵母粉:Oxoid；DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒、PCR產(chǎn)物清潔試劑盒、基因組提取試劑盒、限制性內(nèi)切酶、苯丙酮酸鈉、D-苯基乳酸、輔酶NADH和pUCm-T質(zhì)粒:生工生物科技有限公司；菌種Lactobacillusrossiae、E.coliBL21 (DE3)、E.coliBL21 (DE3)/pET-28a-esgdh、質(zhì)粒pET28a(+):本實(shí)驗(yàn)室保藏；色譜純乙腈、甲醇、甲酸、三氟乙酸:百靈威科技有限公司；其他化學(xué)試劑均為市售分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

CHA-SA氣浴恒溫振蕩器,上海江星；LC-20A高效液相色譜儀，島津；HICO21小型高速離心機(jī)，上海生工；Avanti J-E高速冷凍離心機(jī)，Beckman；BPMJ-70F恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒。

1.3 乳酸脫氫酶基因克隆

根據(jù)Lactobacillusrossiae乳酸脫氫酶(LDH，GenBank: AZFF01000004.1)核苷酸序列設(shè)計(jì)引物(LDH-F: CCATGGGCATGGAGGTGTCTGCATTGA; LDH-R: CTCGAGCTAGTTAAAGGCCACAACA T)。以L.rossiae基因組DNA為模板進(jìn)行PCR，克隆基因片段。PCR反應(yīng)體系(總體積100 μL)：10×PfuDNA Polymerase Buffer 10 μL(Mg2+)，引物L(fēng)DH-F和LDH-R各1 μL (50 μmol/L)，dNTP mixture 1 μL(10 mmol/L)，基因組DNA 1 μL，PfuDNA Polymerase 1 μL，去離子水85 μL。PCR程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min，經(jīng)過35個(gè)循環(huán)(94 ℃ 0.5 min，56 ℃ 0.5 min，72 ℃ 1.5 min)，72 ℃延伸 10 min，4 ℃保溫。瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)是否獲得目的條帶并膠回收目的基因。

1.4 乳酸脫氫酶重組基因工程菌的構(gòu)建

目的基因與pUCm-T質(zhì)粒連接，構(gòu)建的重組T質(zhì)粒和pET28a(+)質(zhì)粒用相同的限制性內(nèi)切酶(NcoI/XhoI)切割，產(chǎn)生的黏性末端用T4 DNA連接酶連接，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-ldh，轉(zhuǎn)化BL21(DE3)大腸桿菌感受態(tài)，構(gòu)建重組菌E.coliBL21 (DE3)/pET28a-ldh。將乳酸脫氫酶重組菌接種至含30 μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)至發(fā)酵液OD600值為0.8，加入終質(zhì)量濃度為5 g/L的乳糖，28 ℃，150 r/min誘導(dǎo)12 h，離心收集菌體，磷酸緩沖液(100 mmol/L，pH 7.0)懸浮，超聲破碎并冷凍離心，取上清，SDS-PAGE凝膠電泳分析。

1.5 乳酸脫氫酶重組菌誘導(dǎo)表達(dá)條件優(yōu)化

接種E.coli/pET28a-ldh至含有30 μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)10 h，再以體積分?jǐn)?shù)4%接種到含有30 μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至菌液OD600值為0.8，加入乳糖，在28 ℃，150 r/min下誘導(dǎo)，分別對(duì)誘導(dǎo)劑乳糖的質(zhì)量濃度2、4、6、8、10、12 g/L和誘導(dǎo)時(shí)間2、4、6、8、10 h進(jìn)行優(yōu)化。離心收集菌體、測(cè)生物量，計(jì)算比酶活。

生物量測(cè)定：取1.0 mL發(fā)酵液，離心收集菌體，并用生理鹽水洗滌2次后，置于80 ℃烘箱中干燥至恒重并稱量。

重組乳酸脫氫酶活力測(cè)定：誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體細(xì)胞用磷酸緩沖液(100 mmol/L，pH 7.0)懸浮，菌體質(zhì)量濃度以干菌體計(jì)為20 g/L，超聲破碎并離心，取上清作為粗酶液。酶活檢測(cè)體系由上述粗酶液、0.5 mmol/L NADH和0.5 mmol/L苯丙酮酸鈉構(gòu)成，總體積為200 μL，置于30 ℃、150 r/min下反應(yīng)10 min，液相測(cè)定苯基乳酸含量，并計(jì)算比酶活。

酶活單位(U)定義為：在30 ℃、pH值7.0條件下，1 min還原生成1 μmolD- PLA所需要的酶量定義為1 U。比酶活定義：1 g干菌體所具有的活力單位數(shù)。

1.6 乳酸脫氫酶/葡萄糖脫氫酶偶聯(lián)催化體系的構(gòu)建與反應(yīng)條件的優(yōu)化

E.coli/pET28a-ldh和E.coli(DE3)/pET28a-esgdh兩菌種分別在優(yōu)化后的條件下進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，收集的菌體按一定干重比混合后，用100 mmol/L磷酸緩沖液懸浮，菌體總質(zhì)量濃度以干菌體計(jì)，為20 g/L，超聲破碎。取破碎液10 mL加入10 g/L PPA和一定濃度葡萄糖，在200 r/min下反應(yīng)30 min。分別對(duì)催化反應(yīng)pH(6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)，溫度(27、30、35、40、45 ℃)，LDH和葡萄糖脫氫酶重組菌質(zhì)量比(1、2、3、4、5)，葡萄糖與PPA摩爾濃度之比(0.5、1、1.5、2、3、4、5)進(jìn)行優(yōu)化。反應(yīng)生成PLA濃度和對(duì)映體過量值(enantiomeric excess,ee)用高效液相色譜檢測(cè)。

1.7 雙酶耦聯(lián)催化反應(yīng)時(shí)間進(jìn)程

取上述混合破碎液50 mL，分別加入10、20、30 g/L PPA及2倍摩爾濃度的葡萄糖至100 mL圓底燒瓶中。在30 ℃、磁力攪拌轉(zhuǎn)速為300 r/min下反應(yīng)，流加1 mol/L Na2CO3溶液使反應(yīng)液pH維持在7.0。每20 min取樣，液相檢測(cè)PLA濃度和ee。

1.8 液相檢測(cè)方法

PLA的濃度采用Hypersil ODS C18分析柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)檢測(cè)，流動(dòng)相為V(乙腈)∶V(0.1%甲酸水溶液)=1∶ 4，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量20 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，柱溫40 ℃。

ee采用Chiralcel OJ-RH分析柱(4.6 mm×150 mm, 5 μm)檢測(cè)，流動(dòng)相為V(乙腈)∶V(甲醇)∶V(三氟乙酸)∶V(水)=50∶50∶1.5∶898.5，流速0.6 mL/min，進(jìn)樣量20 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，柱溫40 ℃。

1.9 ee計(jì)算方法

(1)

式中：ρD和ρL分別為D-PLA和L-PLA的質(zhì)量濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸脫氫酶重組工程菌的構(gòu)建

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，在約1 000 bp處顯示了明亮條帶(圖2-a)，與目標(biāo)基因長(zhǎng)度(1 014 bp)一致。將擴(kuò)增獲得的基因片段插入pET-28a(+)，構(gòu)建重組表達(dá)載體pET-28a-ldh轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)測(cè)序確認(rèn)，成功構(gòu)建了重組大腸桿菌E.coli/pET28a-ldh。對(duì)誘導(dǎo)后的LDH重組菌破碎上清進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，以無(wú)重組載體的E.coliBL21 (DE3)作空白對(duì)照，如圖2-b所示，獲得約40 kDa條帶，與LDH預(yù)測(cè)大小一致(37.8 kDa)，表明LDH重組菌成功表達(dá)。

圖2 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳(a)；SDS-PAGE凝膠電泳(b)

Fig.2 Agarose gel electrophoresis analysis of PCR products(a);SDS-PAGE analysis of the soluble fractions of induced E. coli BL21 (DE3) and E. coli/pET28a-ldh(b)

2.2 乳酸脫氫酶重組菌表達(dá)條件優(yōu)化

分別對(duì)誘導(dǎo)劑乳糖的用量和誘導(dǎo)時(shí)間做了優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。選擇乳糖質(zhì)量濃度為2～12 g/L，分別在28 ℃誘導(dǎo)2 h。如圖3所示，隨著乳糖質(zhì)量濃度的升高，LDH可溶性蛋白表達(dá)量隨之升高，菌體比酶活在乳糖質(zhì)量濃度為8 g/L時(shí)最大，達(dá)到138.2 U/g干菌體，同時(shí)獲得的生物量也較高為2.65 g/L(每1 L發(fā)酵液中含有的干菌體質(zhì)量)，繼續(xù)升高乳糖濃度，生物量緩慢增長(zhǎng)，但LDH可溶性表達(dá)量減少，導(dǎo)致重組菌比酶活下降。因此，選取8 g/L乳糖作為最佳誘導(dǎo)劑質(zhì)量濃度。

M-Marker; 1～6-E. coli/pET28a-ldh于28 ℃分別在2、4、6、8、10、12 g/L 乳糖下誘導(dǎo)2 h圖3 誘導(dǎo)劑乳糖濃度優(yōu)化

Fig.3 Optimization of lactose concentration

添加8 g/L乳糖，在28 ℃下分別誘導(dǎo)2～10 h。如圖4所示。

M-Marker;1～5-添加8 g/L乳糖分別誘導(dǎo)E. coli/pET28a-ldh 2、4、6、8、10 h圖4 誘導(dǎo)時(shí)間優(yōu)化

Fig.4 Optimization of induction time

隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，重組菌生物量和LDH可溶性表達(dá)量增加，重組菌比酶活提高，到8 h時(shí)達(dá)到最大值298.8 U/g干菌體，誘導(dǎo)10 h時(shí)，雖然生物量繼續(xù)增加，但LDH可溶性表達(dá)量開始減少，重組菌比酶活隨之降低。綜上所述，在8 g/L乳糖質(zhì)量濃度下誘導(dǎo)8 h為最佳誘導(dǎo)條件。

2.3 LDH/GDH偶聯(lián)催化體系的構(gòu)建與催化條件優(yōu)化

乳酸脫氫酶催化的還原反應(yīng)需要煙酰胺輔酶作為載體傳遞H+和電子，而煙酰胺輔酶價(jià)格昂貴，直接大批量添加將極大增加生產(chǎn)成本，因此，采用合適的方法進(jìn)行輔酶再生是還原反應(yīng)順利進(jìn)行的保障。將葡萄糖脫氫酶與主催化反應(yīng)氧化還原酶偶聯(lián)是實(shí)現(xiàn)輔酶高效循環(huán)的常用方法。適宜的酶組合和合適的催化條件，能夠使主催化反應(yīng)與輔酶再生副反應(yīng)平衡，提高酶催化反應(yīng)的經(jīng)濟(jì)性，確保還原反應(yīng)的連續(xù)性。

本實(shí)驗(yàn)將LDH重組菌和GDH重組菌混合破碎，以葡萄糖作為氫供體構(gòu)建了雙酶耦聯(lián)催化體系，并對(duì)催化條件進(jìn)行了優(yōu)化。

2.3.1 pH值對(duì)還原反應(yīng)的影響

pH的變化能夠引起酶分子構(gòu)象的變化及酶和底物的解離狀態(tài)，進(jìn)而影響酶與底物的結(jié)合，使酶促反應(yīng)速率發(fā)生變化。本實(shí)驗(yàn)控制LDH與GDH重組菌細(xì)胞質(zhì)量比為1∶1，以100 mmol/L不同pH值的磷酸緩沖液懸浮并破碎，加入10 g/L PPA和葡萄糖，于30 ℃下反應(yīng)，研究pH值對(duì)還原反應(yīng)的影響，結(jié)果如圖5-a所示。在酸性至中性范圍內(nèi)，產(chǎn)物PLA累積濃度隨pH的升高而迅速增大，至pH值為7.0時(shí)最大，達(dá)到3.86 g/L。當(dāng)反應(yīng)液pH值處于堿性環(huán)境時(shí)，PLA累積濃度急劇下降。在所研究的pH范圍內(nèi)，產(chǎn)物ee值未發(fā)生明顯變化，維持在99.9%以上。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，維持反應(yīng)液pH為7.0進(jìn)行催化反應(yīng)。

圖5 催化條件優(yōu)化

Fig.5 Optimization of catalytic conditions

2.3.2 溫度對(duì)還原反應(yīng)的影響

在一定范圍內(nèi)，溫度的升高有助于酶分子與底物分子的有效碰撞，從而使酶促反應(yīng)速率加快；而另一方面，隨著溫度的升高，酶分子變性加劇，活性酶分子減少，反應(yīng)速率降低。酶促反應(yīng)最適溫度是這兩方面因素平衡的結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)控制LDH與GDH重組菌細(xì)胞質(zhì)量比為1∶1，以100 mmol/L pH值7.0的磷酸緩沖液懸浮并破碎，加入質(zhì)量濃度為10 g/L PPA和葡萄糖，在25～45 ℃范圍內(nèi)測(cè)定了D-PLA的產(chǎn)生量，結(jié)果如圖5-b所示。在30 ℃時(shí)PLA累積濃度最高，達(dá)到3.86 g/L，溫度升高使產(chǎn)物濃度降低，至45 ℃時(shí)，反應(yīng)液由澄清透明逐漸變渾濁，有白色黏稠固體產(chǎn)生，酶變性失活加劇，產(chǎn)物累積質(zhì)量濃度僅為1.48 g/L。在所研究的溫度范圍內(nèi)，產(chǎn)物ee值未發(fā)生明顯變化，維持在99.9%以上。30 ℃為雙酶偶聯(lián)反應(yīng)體系的最適催化溫度。

2.3.3 LDH與GDH重組菌細(xì)胞質(zhì)量比對(duì)還原反應(yīng)的影響

本實(shí)驗(yàn)控制反應(yīng)溫度為30 ℃，pH為7.0，PPA和葡萄糖濃度均為10 g/L，固定總菌體用量為20 g/L(以干菌體計(jì))，研究LDH與GDH重組菌細(xì)胞質(zhì)量比對(duì)還原反應(yīng)的影響，結(jié)果如圖5-c所示。LDH/GDH值從1增加到3時(shí)，雖然GDH占比下降，但仍能為PPA的還原反應(yīng)提供充足的還原型輔酶，LDH濃度增加使D-PLA產(chǎn)生速率加快，當(dāng)LDH/GDH值為3時(shí)，D-PLA累積質(zhì)量濃度達(dá)到最大值為5.61 g/L。繼續(xù)提高質(zhì)量比，GDH濃度降低，輔酶再生速率下降，LDH累積濃度降低。手性液相色譜分析可知(圖6)，D-PLA和L-PLA的保留時(shí)間分別約為25.9 min和28.5 min。在所研究的范圍內(nèi)，LDH與GDH重組菌細(xì)胞質(zhì)量比對(duì)產(chǎn)物ee值基本無(wú)影響，始終維持在99.9%以上(圖6-d)。因此，確定LDH與GDH質(zhì)量比為3∶1進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

a-0.05 g/L D-PLA；b-0.05 g/L L-PLA；c-0.025 g/L D，L-PLA, d-D, L-PLA和催化樣品圖6 手性液相色譜圖

Fig.6 Chromatogram of chiral HPLC

2.3.4 葡萄糖質(zhì)量濃度對(duì)還原反應(yīng)的影響

葡萄糖被GDH氧化，生成H+被煙酰胺輔酶攜帶，傳遞給PPA并使PPA還原生成D-PLA。本實(shí)驗(yàn)控制反應(yīng)溫度為30 ℃，pH為7.0，LDH與GDH重組菌細(xì)胞質(zhì)量比為3∶1，PPA質(zhì)量濃度為10 g/L，對(duì)葡萄糖質(zhì)量濃度做了優(yōu)化，結(jié)果如圖5-d所示。葡萄糖質(zhì)量濃度從5 g/L增加到20 g/L，D-PLA累積濃度逐步提高，至20 g/L時(shí)達(dá)到最大值7.87 g/L，在這一范圍內(nèi)，葡萄糖質(zhì)量濃度的增加使GDH的活性提高，增加了H+的供應(yīng)，從而促進(jìn)了PPA的還原。繼續(xù)增加葡萄糖質(zhì)量濃度，D-PLA累積濃度下降，高質(zhì)量濃度的葡萄糖可能抑制了GDH的活性，同時(shí)增加了反應(yīng)液的黏度，增大了傳質(zhì)阻力。在所研究的葡萄糖濃度范圍內(nèi)，產(chǎn)物ee值未發(fā)生明顯變化，維持在99.9%以上。因此，確定最佳葡萄糖質(zhì)量濃度為20 g/L，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中采用2倍PPA質(zhì)量濃度的葡萄糖進(jìn)行催化反應(yīng)。

2.4 LDH/GDH雙酶耦聯(lián)催化反應(yīng)時(shí)間進(jìn)程

在上述最優(yōu)條件下，考察了不同底物濃度下雙酶偶聯(lián)催化反應(yīng)的時(shí)間進(jìn)程，結(jié)果如圖7所示。

圖7 不同初始底物質(zhì)量濃度下的催化反應(yīng)時(shí)間進(jìn)程

Fig.7 Time course of asymmetric reduction

當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度為10 g/L時(shí)，經(jīng)過100 min反應(yīng)基本結(jié)束，產(chǎn)物累積質(zhì)量濃度為9.32 g/L，ee值大于99%，得率為93.2%。增加底物質(zhì)量濃度，反應(yīng)初速率加快，但隨著產(chǎn)物的積累，反應(yīng)速率逐漸降低，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度為20 g/L時(shí)，反應(yīng)在140 min時(shí)基本結(jié)束，PLA累積質(zhì)量濃度為15.03 g/L，ee值大于99%，得率為75.15%。當(dāng)初始底物增加到30 g/L時(shí)，D-PLA最終累積質(zhì)量濃度為18.09 g/L，ee值大于99%，時(shí)空產(chǎn)率為162.27 g/(L·d)，得率降低為60.30%，表明產(chǎn)物質(zhì)量濃度的提高抑制了還原反應(yīng)的繼續(xù)進(jìn)行。

3 結(jié)論

本研究從Lactobacillusrossiae基因組DNA中克隆到一條編碼LDH的基因，構(gòu)建了E.coliBL21 (DE3)/pET28a-ldh重組菌并成功表達(dá)，通過一系列實(shí)驗(yàn)對(duì)LDH重組菌的表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化。構(gòu)建了LDH/GDH雙酶耦聯(lián)催化體系，在實(shí)現(xiàn)輔酶再生的同時(shí)，促進(jìn)了PPA不對(duì)稱還原生成光學(xué)純D-PLA，對(duì)催化反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，D-PLA最終累積質(zhì)量濃度達(dá)到18.03 g/L，時(shí)空產(chǎn)率為162.27 g/(L·d)，顯示了較好的工業(yè)化應(yīng)用前景。

本實(shí)驗(yàn)雖取得了一定的進(jìn)展，但反應(yīng)過程中產(chǎn)物的積累對(duì)PPA還原反應(yīng)產(chǎn)生了明顯的抑制，阻礙了D-PLA得率和累積質(zhì)量濃度的進(jìn)一步提升。篩選合適的有機(jī)溶劑，構(gòu)建雙水相反應(yīng)介質(zhì)能有效解除產(chǎn)物抑制并提升底物的溶解度，有效提高反應(yīng)轉(zhuǎn)化率。此外，無(wú)細(xì)胞破碎液作為催化劑參與反應(yīng)，使后續(xù)的產(chǎn)品分離純化過程變得困難，將LDH和GDH基因?qū)胪凰拗骷?xì)胞，構(gòu)建共表達(dá)基因工程菌可簡(jiǎn)化分離純化工藝。本實(shí)驗(yàn)室已開展相關(guān)工作，期望進(jìn)一步提升D-PLA生產(chǎn)強(qiáng)度。