隨機(jī)誘變和基因組重排選育阿維拉霉素高產(chǎn)菌

胡向東，馮云會， 葉茂，梁新樂

1(杭州皇冠農(nóng)業(yè)生物工程技術(shù)研究中心有限公司，浙江 杭州,310012) 2(浙江工商大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，浙江 杭州,310018)

阿維拉霉素(avilamycin)是綠色產(chǎn)色鏈霉菌的次級代謝產(chǎn)物，能夠有效抑制多種革蘭氏陽性菌的生長，廣泛應(yīng)用于動物飼料添加劑[1]。研究表明，阿維拉霉素能夠與核糖體A部位相互作用，干擾起始因子IF2、tRNA結(jié)合，影響多肽鏈的合成，從而發(fā)揮抑菌效果[2-3]。其抑菌效果與已知所有抗生素不存在交叉抑制作用，包括氯霉素、四環(huán)素、紅霉素等以核糖體為靶標(biāo)的抗生素[4]。阿維拉霉素現(xiàn)已在歐美、日本、南美、東亞等地區(qū)銷售使用，我國農(nóng)業(yè)部于2005年批準(zhǔn)進(jìn)口使用，批文到期后，農(nóng)業(yè)部又在2015年作為動物用藥物飼料添加劑批準(zhǔn)進(jìn)口，市場前景廣泛。目前阿維拉霉素的產(chǎn)品銷售及生產(chǎn)技術(shù)均被美國禮來公司所控制[5]，國內(nèi)在高產(chǎn)阿維拉霉素菌種選育及發(fā)酵工藝優(yōu)化上仍處于開發(fā)研究階段，還未見大規(guī)模生產(chǎn)的報道[6]。

阿維拉霉素為低聚糖類抗生素，由十多種不同的組分組成[7]。以阿維拉霉素A活性最高，分子式為C61H88Cl2O32，分子量1 404.24；其次是阿維拉霉素B，其分子式為C59H84Cl2O32，分子量1 375。市售[8](進(jìn)口)阿維拉霉素商品多為阿維拉霉素A和阿維拉霉素B的混合物。阿維拉霉素是胞內(nèi)抗生素，是一種與細(xì)胞生長相聯(lián)的次級代謝產(chǎn)物[9]，水溶性差，易分解，且其產(chǎn)生菌株生長周期長，對環(huán)境要求高，造成其產(chǎn)量較低。

目前主要通過多重誘變等方法獲得阿維拉霉素高產(chǎn)菌株[10]，但傳統(tǒng)誘變正突變率較低，且多次反復(fù)誘變會產(chǎn)生抗藥性，難以大幅度提高產(chǎn)量?；蚪M重排基于DNA Shuffling原理[11]，結(jié)合傳統(tǒng)誘變和原生質(zhì)體融合技術(shù)，將優(yōu)良性狀聚集在融合菌株中，以達(dá)到育種目的。當(dāng)前DNA Shuffling主要應(yīng)用于改良工業(yè)微生物菌種，增強(qiáng)微生物對生長環(huán)境的耐受性，提高產(chǎn)物產(chǎn)率等方面。DAHIKAR等[12]采用紫外線與亞硝基胍(NTG)對分離得到的5株鼠李糖乳桿菌進(jìn)行誘變，以獲得的突變株作為親本進(jìn)行了2輪原生質(zhì)體融合，得到的融合子在pH值4.0時L-乳酸產(chǎn)量為11.2 g/L，是野生菌株的1.84倍。ZHAO等[13]對1株產(chǎn)纖維素酶的灰綠曲霉A.glaucusHGZ-2用UV進(jìn)行誘變與遞歸融合，經(jīng)過2輪重排，得到1株突變體，其濾紙酶(filter paper enzyme, FPase)和羧甲基纖維素酶(carboxymethyl cellulose enzyme, CMCase)活性分別達(dá)到71和70 U/mL，比親本菌株提高了1.95倍和1.72倍。此外，基因組重排技術(shù)還能增強(qiáng)釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的乙醇耐受性并提高其酒精產(chǎn)量[14]。由此可見，基因組重排技術(shù)在高產(chǎn)菌株篩選方面具有明顯優(yōu)勢，有望成為解決阿維拉霉素生產(chǎn)技術(shù)瓶頸的新突破口。

本研究以綠色產(chǎn)色鏈霉菌(S.viridoehrongenes)2-21為原始菌株，采用基因組重排技術(shù)，結(jié)合ARTP和137Csγ誘變，篩選得到高產(chǎn)的正突變株，再進(jìn)行原生質(zhì)體遞歸融合，最終得到1株遺傳穩(wěn)定的高產(chǎn)阿維拉霉素重組菌株H4-15。中試發(fā)酵結(jié)果表明，阿維拉霉素產(chǎn)量達(dá)到(2 356.44±6.34)mg/L，是原始菌株的3.47倍。為隨機(jī)誘變和基因組重排技術(shù)來提高阿維拉霉素工業(yè)化產(chǎn)量提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 菌株

原始菌株綠色產(chǎn)色鏈霉菌(S.viridoehrongenes)2-21，由浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院保藏，敏感菌株藤黃微球菌(Microccusluteus)10209，購自中國工業(yè)微生物菌種保藏中心。

1.1.2 培養(yǎng)基配制

活化培養(yǎng)基(g/L)：KNO31.0，可溶性淀粉20.0，K2HPO40.5，MgSO4·7H2O 0.5，F(xiàn)eSO40.01，NaCl 0.5，pH 7.2～7.4。

種子培養(yǎng)基(g/L)：4.0酵母浸膏，4.0葡萄糖，10.0麥芽浸膏，0.11 CaCl2，pH 7.2～7.4。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：20.0可溶性淀粉，20.0豆粕粉，5.0大豆蛋白胨，7.812D-木糖，2.34L-纈氨酸，0.5 CaCO3，pH 7.2～7.4。

再生培養(yǎng)基：蔗糖103.0 g/L，葡萄糖10.0 g/L，蛋白胨0.1 g/L，酵母浸膏5.0 g/L，KH2PO40.25 g/L，MgCl2·6H2O 11.2 g/L，瓊脂20.0 g/L。微量元素溶液2.0 mL/L，TES 10.0 mL/L。

敏感培養(yǎng)基(g/L)：3.0 牛肉膏，10.0 蛋白胨，5.0 NaCl，15.0～20.0 瓊脂，pH 7.0～7.2

1.1.3 溶液配制

高滲溶液(PB液)、微量元素、TES緩沖液等參照文獻(xiàn)[15]。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種活化及培養(yǎng)

取菌種干粉溶于適量ddH2O中,并接種活化培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)5～7 d?；罨N接至種子培養(yǎng)基，28 ℃、220 r/min培養(yǎng)36～48 h，獲得種子培養(yǎng)液。

1.2.2 單孢子菌懸液的制備

取對數(shù)期的菌株S.viridoehrongenes2-21孢子斜面，無菌生理鹽水洗滌斜面，轉(zhuǎn)入無菌離心管中，經(jīng)脫脂棉過濾得單孢子懸液并計數(shù)到107個/mL。

1.2.3 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)

將種子培養(yǎng)液接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量5%，28 ℃、220 r/min培養(yǎng)8～10 d。

1.2.4 等離子誘變(ARTP)育種

菌懸液均勻地涂布于小鐵片并晾干，ARTP分別照射30、60、120、180、240 s。將鐵片用無菌生理鹽水洗脫并稀釋，涂布活化培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)5～7 d。計算致死率。選擇菌落較大、菌絲較密的菌株進(jìn)行初篩和復(fù)篩，測定各菌株生物量和阿維拉霉素含量。

1.2.5137Csγ誘變育種

單孢子菌懸液計數(shù)到107個/mL，137Csγ射線分別照射200、300、350、500、700 Gy。涂布活化培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)5～7 d。觀察菌落生長狀態(tài)，以未經(jīng)誘變處理的菌懸液為對照，計算致死率。選擇菌落較大、菌絲較密的菌株進(jìn)行初篩和復(fù)篩，測定各菌株生物量和阿維拉霉素含量。

1.2.6 抗性突變株的篩選

配制一定濃度的利福平溶液添加到活化培養(yǎng)基中，將誘變后的單孢子菌懸液涂布活化培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)3～5 d，挑取單菌落，進(jìn)行突變株的篩選。初篩采用瓊脂塊法[16]；復(fù)篩采用管碟法[17]。

1.2.7 原生質(zhì)體融合

取5 mL菌液8 000 r/min離心10 min，棄上清液。加入5 mL體積分?jǐn)?shù)為0.2%的溶菌酶重懸，35 ℃水浴2 h。用帶有脫脂棉的一次性針筒過濾酶解液并收集濾液，4 ℃、2 000 r/min離心15 min，棄上清液。PB溶液重懸沉淀，并制備濃度為107個/mL的原生質(zhì)體懸液。每個樣品各取1 mL原生質(zhì)體懸液混勻，4 ℃、2 000 r/min離心15 min，棄上清液。緩慢加入1 mL體積分?jǐn)?shù)為40%的PEG6000，輕微振動，25 ℃靜置20 min。4 ℃、2 000 r/min離心15 min，棄上清。PB液洗滌1次，4 ℃、2 000 r/min離心15 min，棄上清。加入5 mL PB液重懸，取0.1 mL涂布于再生平板上，28 ℃培養(yǎng)5～7 d。篩選出高產(chǎn)突變體進(jìn)行循環(huán)原生質(zhì)體融合。

1.2.8 菌株穩(wěn)定性驗證

經(jīng)ARTP和137Csγ射線混合誘變后的高產(chǎn)阿維拉霉素菌株，連續(xù)傳代培養(yǎng)5次，分別測定其生物量和阿維拉霉素產(chǎn)量，評估其遺傳穩(wěn)定性。

1.2.9 菌株擴(kuò)大化培養(yǎng)

將遺傳穩(wěn)定菌株進(jìn)行10 L發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng)。裝液量60%，通氣量1.2 vvm，轉(zhuǎn)速300 r/min，pH值7.4，溶氧體積分?jǐn)?shù)不低于30%。發(fā)酵過程中，測定pH值、菌體干重、阿維拉霉素產(chǎn)量、還原糖等指標(biāo)。

1.3 分析方法

1.3.1 阿維拉霉素含量的測定

采用HPLC法。取30 mL發(fā)酵液，4 ℃、8 000 r/min離心10 min，棄上清液。加入3倍體積甲醇，37 ℃浸泡沉淀16～24 h，離心取上清液。0.22 μm有機(jī)膜過濾后備測。液相測定條件：色譜柱Eclipse plus C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)，柱溫：30 ℃，檢測波長295 nm，流速1.0 mL/min，流動相V(乙腈)∶V(0.1 mol/L乙酸銨)=49∶51。

1.3.2 其他指標(biāo)及測定方法

菌絲干重測定參照文獻(xiàn)[10]；還原糖的測定采用DNS法[18]。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

各指標(biāo)測定結(jié)果以X±S(平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤)表示，應(yīng)用SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，P<0.05為顯著性差異，P<0.01為極顯著性差異。采集數(shù)據(jù)應(yīng)用Origin 9.0進(jìn)行分析作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 隨機(jī)誘變育種結(jié)果

2.1.1 ARTP最佳照射劑量的確定

ARTP劑量用照射時間來表示，對原始菌株S.viridoehrongenes2-21進(jìn)行ARTP照射處理，計算致死率。由圖1可知，當(dāng)照射時間為240 s時，其致死率高達(dá)92%左右。等離子誘變的照射時間不易過長，因此本實驗選取200 s作為ARTP最佳照射時間。

圖1 ARTP對S.viridoehrongenes 2-21的致死率

Fig.1 The lethality rate of ARTP irradiation onS.viridoehrongenes 2-21

2.1.2137Csγ射線照射劑量的確定

取ARTP照射后的優(yōu)勢菌株，進(jìn)行137Csγ射線輻照，計算致死率。由圖2可知，隨著照射劑量的增加，菌株的致死率提高；當(dāng)照射劑量為550 Gy時，致死率接近100%，因此選擇500 Gy為最適照射劑量。

圖2 137Csγ對S.viridoehrongenes 2-21的致死率

Fig.2 The lethality rate of 137Csγ irradiation onS.viridoehrongenes 2-21

2.1.3 ARTP誘變及第1輪137Csγ誘變育種結(jié)果

對原始菌株2-21進(jìn)行ARTP及137Csγ誘變，初篩得到164個單菌落，從中挑選出26個菌落較大、顆粒較飽滿的相對優(yōu)勢菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，測定生物量和阿維拉霉素產(chǎn)量。

表1 ARTP誘變及第1輪137Csγ誘變育種結(jié)果

注：誘變菌株與原始菌株S.Viridoehrongenes2-21比較，*差異顯著，P<0.05，**差異極顯著，P<0.01；n=3。表2同。

由表1可知，菌株C1-10和C1-22的阿維拉霉素產(chǎn)量較高，分別為(932.65±4.98)和(943.68±2.56)mg/L，是原始菌株的1.37和1.39倍。

2.1.4 第2次137Csγ誘變育種結(jié)果

對第1輪誘變后的菌株C1-10和C1-22進(jìn)行2次誘變，利用瓊脂塊法對誘變菌株進(jìn)行初篩，從98株菌株中挑選出18株相對高產(chǎn)菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，測定生物量和阿維拉霉素產(chǎn)量。由表2可知，菌株C2-3、C2-8和C2-14的阿維拉霉素產(chǎn)量有所提高，其中菌株C2-8的產(chǎn)量達(dá)到了(1 278.43±3.23)mg/L是原始菌株的1.88倍。

表2 第2輪137Csγ誘變育種結(jié)果

2.2 基因組重排育種結(jié)果

2.2.1 利福平最小抑菌濃度確定

以原始菌株2-21及2輪隨機(jī)誘變后的突變株C1-10、C1-22、C2-3、C2-8和C2-14作為親本進(jìn)行原生質(zhì)體融合，并做利福平最小抑菌濃度實驗。配制質(zhì)量濃度為40、80、160、240和320 mg/L利福平抗性培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)7 d，觀察菌落生長情況。

表3 親本菌株在利福平不同質(zhì)量濃度抗性下的生長情況

注：“+++”表示菌落生長旺盛；“++”表示菌落生長均勻；“+”表示菌落較少；“—”表示幾乎無菌落。

由表3可知，菌株C1-10及C2-14的最小抑制質(zhì)量濃度為160 mg/L；而其他菌株能在240 mg/L抗性平板上生長，但是在320 mg/L幾乎無生長，因此可采用320 mg/L作為最小抑制濃度。

2.2.2 第1輪原生質(zhì)體融合結(jié)果

抗性培養(yǎng)基中利福平質(zhì)量濃度為350 mg/L。挑出性狀優(yōu)良的38株菌進(jìn)行搖瓶復(fù)篩，測定阿維拉霉素含量，如圖3所示。5株融合子(H1-10、H1-14、H1-20、H1-29、H1-37)的阿維拉霉素產(chǎn)量有所提高，其中H1-20的阿維拉霉素產(chǎn)量為(1 471.36±11.06) mg/L，是原始菌株的2.17倍。

圖3 第1輪融合子搖瓶發(fā)酵復(fù)篩

Fig.3 The screening of the first round generation fusants of shake-flask fermentation

2.2.3 第2輪原生質(zhì)體融合結(jié)果

抗性培養(yǎng)基中利福平質(zhì)量濃度為400 mg/L。第1輪融合子H1-10、H1-14、H1-20、H1-29、H1-37作為親本菌株，篩選出性狀優(yōu)良的30株菌進(jìn)行搖瓶復(fù)篩，如圖4所示。5株融合子(H2-6、H2-11、H2-25、H2-26、H2-29)的阿維拉霉素產(chǎn)量均較高，其中H2-29的阿維拉霉素產(chǎn)量為(1 673.26±12.62) mg/L，是原始菌株的2.47倍。

圖4 第2輪融合子搖瓶發(fā)酵復(fù)篩

Fig.4 The screening of the second round generation fusants of shake-flask fermentation

2.2.4 第3輪原生質(zhì)體融合結(jié)果

抗性培養(yǎng)基中利福平質(zhì)量濃度為500 mg/L。第2輪融合子H2-6、H2-11、H2-25、H2-26、H2-28作為親本菌株，篩選出性狀優(yōu)良的25株菌進(jìn)行搖瓶復(fù)篩，如圖5所示。5株融合子(H3-1、H3-5、H3-9、H3-16、H3-21)的阿維拉霉素產(chǎn)量較高，其中H3-16的阿維拉霉素產(chǎn)量為(1 944.40±6.01) mg/L，是原始菌株的2.87倍。

圖5 第3輪融合子搖瓶發(fā)酵復(fù)篩

Fig.5 The screening of the third generation fusants of shake-flask fermentation

2.2.5 第4輪原生質(zhì)體融合結(jié)果

抗性培養(yǎng)基中利福平質(zhì)量濃度為600 mg/L。第3輪融合子H3-1、H3-5、H3-9、H3-16、H3-21作為親本菌株，篩選出性狀優(yōu)良的20株菌進(jìn)行搖瓶復(fù)篩，如圖6所示。3株融合子(H4-5、H4-11、H4-15)的阿維拉霉素產(chǎn)量較高，其阿維拉霉素產(chǎn)量分別為(2 146.64±16.53)、(2 119.48±1.10)、 (2 155.48±7.81) mg/L，分別是原始菌株的3.16、3.12、3.18倍。

圖6 第4輪融合子搖瓶發(fā)酵復(fù)篩

Fig.6 The screening of the fourth generation fusants of shake-flask fermentation

2.3 穩(wěn)定性遺傳試驗

經(jīng)過2輪隨機(jī)誘變4輪原生質(zhì)體融合后得到3株產(chǎn)量較高的優(yōu)勢菌株，進(jìn)行穩(wěn)定性遺傳試驗，如表4所示。傳代培養(yǎng)5次后，菌株H4-15具有良好的穩(wěn)定性，阿維拉霉素產(chǎn)量達(dá)到(2 155.48±7.81) mg/L，而H4-5、H4-11遺傳穩(wěn)定性較差，所以最終得到1株穩(wěn)產(chǎn)、高產(chǎn)的阿維拉霉素產(chǎn)生菌H4-15。

2.4 高產(chǎn)突變菌株H4-15的擴(kuò)大化培養(yǎng)

將菌株H4-15進(jìn)行中試擴(kuò)大化培養(yǎng)，如圖7所示。菌株pH值呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢；菌株對糖的消耗在1～2 d時有所停頓，之后迅速下降。1～2 d是菌株的前期準(zhǔn)備階段，此時菌體生長旺盛，菌體快速積累，培養(yǎng)基中菌絲體干重迅速增加，但隨著發(fā)酵的進(jìn)行，培養(yǎng)基中的氮源及碳源逐漸饋乏，有害產(chǎn)物積累，致使菌株干重逐漸下降。4 d開始進(jìn)入阿維拉霉素合成期，此時阿維拉霉素合成速度較快，第6天時含量達(dá)到最高。之后菌體發(fā)生自溶，含量有所下降。第8天時阿維拉霉素含量又有所回升，說明綠色產(chǎn)色鏈霉菌的代謝過程中存在2次生長情況。發(fā)酵過程中阿維拉霉素產(chǎn)量最大達(dá)到(2 356.44±6.34) mg/L，比搖瓶發(fā)酵提高了9.68%，是原始菌株的3.47倍。

表4 融合高產(chǎn)菌株穩(wěn)定性實驗結(jié)果

圖7 高產(chǎn)菌株H4-15擴(kuò)大化培養(yǎng)結(jié)果

Fig.7 Fermentation process of S.viridochromogenesH4-15 in a 10 L Fermenter

2.5 菌株H4-15發(fā)酵產(chǎn)物阿維拉霉素組分驗證

據(jù)報道阿維拉霉素具有多種結(jié)構(gòu)類似物，以A組分的活性最高，B組分次之。對菌株H4-15發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行LC-MS測定，如圖8所示。發(fā)酵液中主要成分是Ⅰ和Ⅱ，結(jié)合圖9可知，組分Ⅰ分子量(M-H-)1 403.45，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[19-20]，組分Ⅰ為阿維拉霉素A；結(jié)合圖10可知，組分Ⅱ分子量(M-H-)1 373.41，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[19-20]，組分Ⅱ為阿維拉霉素B。

圖8 高產(chǎn)菌株H4-15發(fā)酵液浸提物色譜圖

Fig.8 Diagram of the fermentation product of H4-15

圖9 阿維拉霉素組分A的質(zhì)譜圖

Fig.9 Diagram of avilamycin A

圖10 阿維拉霉素組分B的質(zhì)譜圖

Fig.10 Diagram of avilamycin B

3 結(jié)論與討論

建立高效篩選方法是抗生素菌種選育的關(guān)鍵，本文采用等離子(ARTP)誘變和137Csγ誘變，并結(jié)合基因組重排技術(shù)，對綠色產(chǎn)色鏈霉菌高產(chǎn)菌進(jìn)行篩選。ARTP誘變技術(shù)已成功應(yīng)用于高效產(chǎn)氫菌Enterobacteraerogenes的選育中，最終致使其通過NADH途徑，產(chǎn)氫能力顯著提高，是原始菌株的14倍[21]。基因組重排育種技術(shù)作為一種新型、有效的技術(shù)，與經(jīng)典的誘變育種協(xié)同使用，能夠更好地篩選出高產(chǎn)突變菌株，且不易產(chǎn)生回復(fù)突變。文獻(xiàn)[22]中依次經(jīng)過UV-LiCl、60Co-γ誘變及5輪原生質(zhì)體融合，得到1株產(chǎn)量為(68.10±0.56)mg/L的高產(chǎn)菌。劉芳等[23]采用紫外-氯化鋰、微波-吖啶橙復(fù)合誘變，結(jié)合氯化鈣、阿維拉霉素、鏈霉素多重抗性篩選，獲得1株遺傳穩(wěn)定的MY-20菌株，168 h后阿維拉霉素A和B組分產(chǎn)量達(dá)到了0.95和4.62 g/L，分別比出發(fā)菌株提高了428%和237%。毛靈琪等[24]以不同的誘變方法及幾十輪基因組重排，篩選到了1株高產(chǎn)菌株R708，其產(chǎn)量比出發(fā)菌株提高了20倍，搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量達(dá)到了0.208 g/L。

本文經(jīng)隨機(jī)誘變和基因組重排最終選育出1株阿維拉霉素高產(chǎn)重組菌株H4-15，遺傳性能穩(wěn)定，其搖瓶產(chǎn)量為(2 155.48±7.81) mg/L，是原始菌株S.viridoehrongenes2-21的3.18倍。經(jīng)中試擴(kuò)大化培養(yǎng)，其產(chǎn)量可達(dá)到(2356.44±6.34)mg/L，是原始菌株的3.47倍，其主要成分為阿維拉霉素A和阿維拉霉素B，具有工業(yè)化生產(chǎn)的潛在價值。

綠色產(chǎn)色鏈霉菌S.viridoehrongenes2-21是阿維拉霉素生產(chǎn)的優(yōu)良潛力菌株，以利福平作為抗性篩選劑，通過隨機(jī)誘變和基因組重排技術(shù)的結(jié)合能大幅提升其產(chǎn)素能力，有望成為解決阿維拉霉素生產(chǎn)技術(shù)瓶頸的研究熱點。