基于Cajal間質(zhì)細胞探討電針對逼尿肌反射亢進型神經(jīng)源性膀胱大鼠的作用機制

李煬，張潤寧，張保平，丁天紅

正常的排尿過程受交感神經(jīng)、副交感神經(jīng)、軀體神經(jīng)系統(tǒng)的控制，由于神經(jīng)損傷或疾病擾亂正常的排尿過程而引發(fā)的疾病稱為神經(jīng)源性膀胱(Neurogenic bladder, NGB)[1]。在脊髓損傷患者中，排尿功能障礙非常普遍，絕大多數(shù)傷者在傷后一年內(nèi)都有不同程度的泌尿系統(tǒng)功能障礙，其中不足1%的患者能完全康復[2]。神經(jīng)源性膀胱的康復治療中，針灸已經(jīng)成為主要手段,且具有療效顯著、安全性高、易被患者接受的特點,在臨床上廣泛應用。有研究發(fā)現(xiàn)Cajal間質(zhì)細胞(interstitial cells of Cajal, ICC)上的C-kit信號通路可能與脊髓損傷后神經(jīng)源性膀胱發(fā)病相關[3]。許明等[4]研究表明電針能減輕脊髓繼發(fā)性損傷，保護支配膀胱的神經(jīng)而改善膀胱功能。本研究進一步研究了電針是否通過作用于膀胱ICC而治療NGB，探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 ①實驗動物與分組：40只健康成年雌性SD大鼠購自西安交通大學動物實驗中心。許可證編號：SCXK(陜)2012-003。體質(zhì)量220～250g，飼養(yǎng)1周待大鼠適應環(huán)境，隨機分為假手術組、對照組、模型組、電針組各10只。②主要試劑與儀器：華佗牌針灸針，電針儀，四通道多功能生理信號放大器，微量灌注泵，激光共聚焦顯微鏡(德國LEICA公司)，羊抗鼠c-kit抗體(Santa Cruz生物技術),兔抗羊二抗(中山公司，中國北京), 辣根過氧化物酶標記的兔抗羊二抗(武漢谷歌生物)，DAPI (武漢谷歌生物)，PVDF膜(millipore)，BCA蛋白定量檢測試劑盒(武漢谷歌生物)等。

1.2 方法 ①造模方法：除對照組外的所有大鼠通過注射10%水合氯醛(300mg/kg)腹膜內(nèi)誘導全身麻醉。大鼠肋平T13，故以T13作為體表定位標志，骶髓上損傷的脊髓節(jié)段為T10～L2 (對應脊柱T8～T12節(jié)段)，本實驗統(tǒng)一手術位置為T10。備皮，逐層切開右側(cè)皮膚及皮下組織，切口約1～2cm，找到并咬開關節(jié)突，暴露脊髓，假手術組不離斷脊髓，而電針、模型組快速切斷，為確保脊髓纖維完全斷開，在兩斷端之間填塞凝膠海綿，逐層縫合肌肉、筋膜、皮膚。術后保暖，至麻醉蘇醒后放大籠中單籠飼養(yǎng)。脊髓橫斷后脊休克期Crede手法輔助排尿(3次/日)；10ml生理鹽水腹腔注射，每日1次，防止脫水；腹腔注射慶大霉素(2mg/kg)預防感染，1次/d，連續(xù)7d。若脊髓橫斷后雙后肢有自主活動，術后無尿潴留即出現(xiàn)自主排尿，自噬或死亡，則排除。②干預措施：術后10～14d大鼠渡過脊休克期，于第14天給予電針治療。腧穴定位，次髎[5]：第2、3 骶骨的棘突間隙正中偏上處旁開5～10mm，直刺15mm。將經(jīng)過手法排尿后的大鼠置于自制簡易電針治療輔助裝置，1.5寸毫針刺入雙側(cè)“次髎穴”,深度約為15mm,直至刺入骶2神經(jīng)孔；電針儀兩個電極分別連接在兩側(cè)“次髎穴”的針灸針上，設定為疏密波(密波20Hz，疏波4Hz)，刺激強度以肢體不發(fā)生顫動為度。電針時間15 min，連續(xù)14d，每天1次。其余3組放置于簡易裝置內(nèi)15min，不行電針治療。

1.3 檢測項目 ①尿流動力學測定：電針治療14d后行尿流動力學檢測，用10%水合氯醛300mg/kg腹膜誘導麻醉, 手法排空膀胱，借助石蠟油將硬膜外導管經(jīng)尿道輕導入大鼠膀胱，通過三通管將導好的尿管、微量注射泵、尿流動力學分析儀連接，以0.2ml/min的速率進行輸注溫鹽水(37℃～38℃)進行膀胱測壓。并記錄膀胱壓力和收縮頻率曲線。②Western blotting：取大約100mg膀胱壁組織，切碎，均質(zhì)化和解離進入放射性免疫沉淀測定裂解緩沖液中，4℃ 30min。4℃，12kg，離心5min，收集上清液并用作總蛋白質(zhì)。取上清液2ul，用BCA法進行蛋白定量。蛋白質(zhì)通過SDS-PAGE電泳并轉(zhuǎn)移到PVDF膜，封閉1h，加入羊抗鼠c-kit抗體(1：200，Santa Cruz Biotechnology)，在4℃孵育過夜。洗滌3次，后加辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫下孵育30min后，洗滌3次。ECL成像和Alpha軟件系統(tǒng)用于處理目標帶的光密度值。③免疫熒光：切下的膀胱壁組織用4%多聚甲醛固定，將固定的組織切成小塊，冷凍保存，切片(5mm)，然后與山羊抗鼠c-kit抗體(1：100稀釋)一起溫育2h。洗去未結(jié)合的一抗，將切片稍微干燥，加入兔抗羊二抗(1：200稀釋)室溫避光孵育50min。洗滌， DAPI染液進行核染色，黑暗下室溫孵育10min。清洗切片，封片。標本成像使用激光共焦顯微鏡觀察，每個標本隨機選取3個視野，用Image-Pro Plus 6.0圖像處理軟件分析，計算每個視野ICC數(shù)量。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 術后1只自噬，1只后肢有自主運動，均不納入實驗。造模后14d有18只大鼠符合模型要求。模型組、電針組較對照組、假手術組排尿次數(shù)增加(籠內(nèi)墊料更潮濕，且會陰部皮毛長時間處于潮濕狀態(tài))，飲食減少，體重下降。

2.2 尿流動力學檢測 與對照組和假手術組比較，模型組和電針組膀胱最大容量及膀胱順應性均降低(P<0.05)，膀胱基礎壓力和漏尿點壓力增加(P<0.05)。與模型組比較，電針組的膀胱最大容量及膀胱順應性明顯增加(P<0.05)，膀胱基礎壓力和漏尿點壓力降低(P<0.05)。對照組與假手術組各項無顯著性差異。見表1。

表1 尿流動力學檢測結(jié)果

與對照組和假手術組比較，aP<0.05。與模型組比較，bP<0.05

2.3 C-kit蛋白的表達 對照組C-kit蛋白相對表達量為(0.38±0.19)，假手術組為(0.37±0.16)，模型組為(0.86±0.06)，電針組為(0.68±0.14)，組間差異有統(tǒng)計學意義(F=23.99，P<0.01)；其中，模型組較對照組C-kit蛋白相對表達量增高(t=-7.43，P<0.01)；電針組較模型組C-kit蛋白相對表達量降低(t=3.48，P<0.01)，見圖1。

模型組 電針組 假手術組 對照組

2.4 膀胱ICC數(shù)量 鏡下觀察到的ICC如圖2所示。對照組膀胱ICC數(shù)量為(3.3±0.9)，假手術組為(4.1±1.2)，模型組為(9.0±2.0)，治療組為(6.0±1.2)，組間差異有統(tǒng)計學意義(F=30.61，P<0.01)；其中模型組較對照組增多(t=7.58，P<0.01)，治療組較模型組減少(t=3.82，P<0.01)。

a.對照組(×300) b.假手術組(×300)

c.模型組(×300) d.電針組(×300)

3 討論

祖國醫(yī)學認為脊髓損傷后尿失禁相當于“遺溺”“小便不禁”范疇，《素問·靈蘭秘典論》云:"膀胱者,州都之官,津液藏焉,氣化則能出矣，故"遺溺"原因多是膀胱氣化不利所致。次髎穴屬膀胱經(jīng)，進行電針干預調(diào)節(jié)膀胱氣化功能而達到治療“遺溺”的目的?，F(xiàn)代醫(yī)學認為急性骶上脊髓損傷最初伴隨著脊髓休克[6,18]，在此期間膀胱是無反射的，數(shù)周后出現(xiàn)脊髓反射通路，導致逼尿肌過度活動和潛在的逼尿肌-括約肌協(xié)同失調(diào)。大鼠交感神經(jīng)的低級中樞在脊髓L1～L2節(jié)段，副交感神經(jīng)和軀體神經(jīng)的低級中樞均在脊髓L6～S1節(jié)段[7-8]。研究表明電刺激L6腹側(cè)根在產(chǎn)生逼尿肌收縮方面最有效，而S1背根最能抑制排尿反射[19]。骶神經(jīng)調(diào)節(jié)的動物實驗研究表明將電刺激導管置于S1、S2、S3孔可以治療大鼠膀胱功能障礙[9-10]，電針S2孔的次髎穴其直接作用是刺激骶神經(jīng)調(diào)節(jié)排尿反射而改善膀胱功能[11]。實驗中，電針組的膀胱最大容量及膀胱順應性較模型組增加，膀胱基礎壓力和漏尿點壓力降。表明電針次髎穴對神經(jīng)源性膀胱的療效是確切的，但是下游機制還需進一步探討。

ICC是在人體具有蠕動活性器官中發(fā)現(xiàn)的起搏細胞，它們可以在神經(jīng)信號傳輸至平滑肌細胞的過程中起到起搏器或中間體的作用[12]。一些研究表明ICCs廣泛分布于動物尿道[13,14],雖然胃腸和膀胱ICC似乎具有相同的形態(tài)和受體表達，但它們的功能不同。C-kit是酪氨酸激酶受體蛋白家族的重要成員之一，是一種跨膜蛋白，是ICC的特異性標志物。c-kit蛋白及其配體干細胞因子(stem cell factor,SCF)構(gòu)成C-kit/SCF信號系統(tǒng)與ICCs的增殖、分化和維持密切相關，阻斷c-kit受體可降低逼尿肌平滑肌的自發(fā)興奮性及離子通道活性，且可觀察到ICC的數(shù)量可逆地減少[3,15,17]。我們觀察到模型組c-kit蛋白相對表達量增多、ICC數(shù)量增多，膀胱出現(xiàn)無抑制收縮；電針治療后電針組ICC數(shù)量、c-kit蛋白相對表達量較模型組下降，膀胱功能得到改善。說明膀胱的不同功能狀態(tài)可能與ICC數(shù)量及c-kit蛋白表達的變化有關，這與其他實驗結(jié)果一致[3,16]。因此，C-kit的表達與ICC數(shù)量變化密切相關，至于C-kit蛋白的表達是如何變化的，其機制是什么，尚需實驗研究進一步證實。

綜上，我們認為電針次髎穴治療神經(jīng)源性膀胱其作用機制之一可能是通過抑制C-kit表達，減少ICC數(shù)量而減少了逼尿肌興奮的啟動來源，降低逼尿肌的興奮性，減少膀胱的無抑制收縮。至于是如何降低ICC數(shù)量及c-kit蛋白表達，通過何種方式降低，其作用機制還需進一步的實驗研究。