SD 大鼠胸腹主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)及鑒定

馬華根，林華城，劉昭德，唐元瑜

（1 福建中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，2 福建中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，3 福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，4 福建中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論教研室，福州 350122）

平滑肌細(xì)胞，按其分布及特點(diǎn)，可分為血管平滑肌細(xì)胞和內(nèi)臟平滑肌細(xì)胞。其中血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）位于血管壁中膜，在維持管壁的完整性和調(diào)節(jié)血管的舒縮功能等方面起著重要作用[1]。VSMCs 是研究肺心病、高血壓病、心腦血管動(dòng)脈粥樣硬化疾病、糖尿病血管病變，以及開(kāi)展血管再生組織工程研究的重要載體和工具細(xì)胞。目前該細(xì)胞的原代培養(yǎng)方法，主要包括組織塊法和化學(xué)酶消化法：前者操作簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)成本低，但細(xì)胞培養(yǎng)周期長(zhǎng)，且易混入較多雜細(xì)胞；后者雖然獲得的目的細(xì)胞純度較高，但操作過(guò)程繁瑣，細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，所需試劑價(jià)格昂貴。課題組參考日本東京大學(xué)學(xué)者Kobayashi M 建立的方法[2]，并稍加改進(jìn)。通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)，在反復(fù)權(quán)衡上述兩種培養(yǎng)方法各自的利弊后，將二者結(jié)合，成功建立了一種高效、實(shí)用的VSMCs 原代培養(yǎng)方法。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6 ～8 周齡SD 大鼠2 只，雌雄不限，購(gòu)自福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)為SCXK（閩）2016-0002。

2 主要試劑

胎牛血清（Gibco 公司，P161102ES），M199培養(yǎng)基（Gibco 公司，1839543），0.25%胰蛋白酶/0.02%EDTA 混合消化酶液（南京凱基生物公司，20170602），Trition X-100（Solarbio 公司，T8200），Ⅱ型膠原酶（北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司，461699），豬胰彈性蛋白酶（源葉生物公司，Y27J10J91591），α平滑肌肌動(dòng)蛋白單克隆抗體（萬(wàn)類生物科技有限責(zé)任公司，106280002），羊抗兔IgG—免疫組織化學(xué)試劑盒SABC 即用型（12F07A）、4%多聚甲醛（12D08A68）、DAB 顯色劑（12F08A22）均購(gòu)自武漢博士德生物公司。

3 主要儀器

美國(guó)Thermo CO2恒溫培養(yǎng)箱，德國(guó)LEICA- DFC295 倒置生物顯微鏡，Airtech 超凈工作臺(tái)，湘儀TDZ4A-WS 低速離心機(jī)。

4 血管平滑肌細(xì)胞原代培養(yǎng)

在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，將受試大鼠頸椎脫臼處死，固定于解剖臺(tái)上，常規(guī)消毒后，剪開(kāi)胸腹腔，充分暴露胸腹主動(dòng)脈。從胸主動(dòng)脈弓開(kāi)始，小心剝離主動(dòng)脈至骼總動(dòng)脈分支處，用中號(hào)動(dòng)脈夾夾閉兩端，剪取胸腹主動(dòng)脈約4cm，迅速置于無(wú)菌離心管內(nèi)，帶回細(xì)胞室。在超凈臺(tái)內(nèi)，用眼科彎鑷將主動(dòng)脈筋膜、脂肪及外膜依次徹底剝離后，用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液漂洗2～3 遍，以除去血凝塊。在無(wú)菌玻璃皿中將主動(dòng)脈血管內(nèi)膜外翻，加入預(yù)熱的2mg/ml Ⅱ型膠原酶/彈性蛋白酶混合消化液6ml，37℃水浴振搖消化0.5h 后，用鋒利的無(wú)菌手術(shù)刀片來(lái)回刮除內(nèi)膜2～3 遍，繼續(xù)消化45min，離心，棄混合酶液。用虹膜剪將主動(dòng)脈剪碎至米粒大小，加入含25%胎牛血清的M199 完全培養(yǎng)液4ml，吹打均勻，吸入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，輕緩作十字形晃動(dòng)，使組織塊分布均勻，旋松瓶蓋，靜置于CO2恒溫培養(yǎng)箱中，3～4d 后半量更換新鮮培養(yǎng)液。

5 血管平滑肌細(xì)胞傳代培養(yǎng)

待細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，吸棄舊培養(yǎng)基，用37℃預(yù)熱的PBS 液漂洗2 遍，然后加入4ml 0.25%胰蛋白酶／0.02%EDTA 室溫下消化2～3min，并輕微地間斷性敲擊振搖培養(yǎng)瓶底部，以促進(jìn)細(xì)胞脫落。待大部分細(xì)胞圓縮時(shí)，加入4ml 完全培養(yǎng)基終止消化，離心，棄上清液，將細(xì)胞沉淀與6ml 培養(yǎng)液吹打混勻后，以1:2 的傳代比例接種，置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

6 形態(tài)學(xué)觀察

將接種有原代和第一代傳代VSMCs 的培養(yǎng)瓶置于倒置生物顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)、貼壁、密度及融合度等生長(zhǎng)情況，并拍照記錄。

7 α 平滑肌肌動(dòng)蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)

將原代大鼠VSMCs 消化成單細(xì)胞懸液后，接種于培養(yǎng)皿中，待其貼壁生長(zhǎng)，融合度接近80%時(shí)進(jìn)行鑒定。用PBS 輕緩漂洗5min×3 次，濾紙吸干殘存液；滴加預(yù)冷的4%多聚甲醛，覆蓋細(xì)胞表面，常溫固定15min；棄固定液，PBS 輕緩漂洗5min×3次，滴加0.3%Triton X-100，打孔透膜15min；傾倒透膜液，PBS 漂洗5min×3 次，滴加5%牛血清白蛋白，室溫封閉20min；棄封閉液，滴加1:250 α 平滑肌肌動(dòng)蛋白單克隆抗體，將封口膜小心覆蓋于抗體液及細(xì)胞表面，置于濕盒中4℃孵育過(guò)夜；復(fù)溫，棄一抗，PBS 漂洗5min×3 次，滴加生物素化的羊抗兔IgG 抗體，37℃孵育30min；棄二抗，PBS 漂洗5min×3 次，滴加SABC，37℃孵育30min；PBS 漂洗5min×3 次，DAB 室溫顯色1～2min，漂洗后，于倒置顯微鏡下觀察，并拍照記錄。

結(jié) 果

倒置顯微鏡下觀察可見(jiàn)：接種于培養(yǎng)瓶中的血管組織塊培養(yǎng)48h 開(kāi)始貼壁，72h 后細(xì)胞以組織塊為中心，向外遷移，“島嶼狀”細(xì)胞團(tuán)初步形成（圖A，圖B）。96h 后原代細(xì)胞集落逐漸融合，鋪滿瓶底，呈現(xiàn)典型的“峰-谷”樣錯(cuò)落生長(zhǎng)（圖 C）。第一代傳代細(xì)胞形態(tài)基本保持不變，鏡下為三角形或星形（圖D，圖E）。免疫細(xì)胞化學(xué)SABC 法染色顯示，99%以上的第一代傳代細(xì)胞呈α 平滑肌肌動(dòng)蛋白免疫反應(yīng)陽(yáng)性。免疫反應(yīng)陽(yáng)性產(chǎn)物定位于細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞核呈陰性（圖F）。

圖1 原代大鼠胸腹主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)。A 和B，72h 原代島嶼狀細(xì)胞生長(zhǎng)暈集落初形成；C，96h 原代細(xì)胞融合呈典型“峰-谷樣”錯(cuò)落生長(zhǎng)；D 和E，第一代傳代細(xì)胞形態(tài)保持不變，呈三角形或星形；F，第一代傳代細(xì)胞α 平滑肌肌動(dòng)蛋白相關(guān)抗原免疫細(xì)胞化學(xué)染色表達(dá)陽(yáng)性；比例尺：A，400μm；B—D，200μm；E，100μm；F，50μm Fig.1 Primary culture of rat thoracic and abdominal vascular smooth muscle cells. A and B, after 72h island-like primary cell outgrowth colonies formed preliminarily； C, after 96h the fusion of primary cells showed a typical “peak-valley-like”staggered growth； D and E, the morphology of passage 1 cells remained unchanged , which is triangular or astral； F, the passage 1 cells showed positive expression of α smooth muscle actin-associated antigen by immunocytochemistry； scale bar: 400μm in A, 200μm in B to D, 100μm in E and 50μm in F

討 論

有研究表明，異常增生的VSMCs 能大量合成膠原纖維、彈力纖維以及酸性粘多糖等基質(zhì)，而這些基質(zhì)是組成血管斑塊的重要成分。VSMCs 的異常增生和遷移是動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成過(guò)程中的關(guān)鍵因素之一，是導(dǎo)致高血壓病、動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病、糖尿病血管病變、腫瘤轉(zhuǎn)移，以及血管成形術(shù)后再狹窄等多種心血管疾病發(fā)生的重要細(xì)胞病理學(xué)基礎(chǔ)[3,4]。原代VSMCs 培養(yǎng)方法的成功建立，對(duì)于揭示相關(guān)疾病的病理變化機(jī)制有重要的學(xué)術(shù)奠基意義。

VSMCs 的原代培養(yǎng)方法，以酶消化法最為常用，而消化酶種類的選擇和運(yùn)用，需結(jié)合該細(xì)胞所在的血管組織結(jié)構(gòu)特點(diǎn)而定，這是平滑肌細(xì)胞能否體外培養(yǎng)成功的關(guān)鍵。主動(dòng)脈為內(nèi)壁光滑、富有彈性的空腔樣器官，其管壁包括內(nèi)膜、中膜及外膜3 層結(jié)構(gòu)：內(nèi)膜由內(nèi)皮、內(nèi)皮下層和內(nèi)彈性膜組成；中膜由平滑肌及豐富的彈性纖維、膠原纖維構(gòu)成；外膜則為結(jié)締組織，與周圍的肌肉、脂肪相連。結(jié)合主動(dòng)脈這一特殊的解剖結(jié)構(gòu)，我們有針對(duì)性地選擇了粗制Ⅱ型膠原酶與彈性蛋白酶組成復(fù)合酶以加速血管中膜彈性纖維蛋白的溶解；同時(shí)還采用消化底物體積10 倍的酶液量充分裂解主動(dòng)脈血管段，這與國(guó)內(nèi)學(xué)者使用單一的膠原酶[5,6]或膠原酶/胰蛋白酶混合酶[7,8]的消化效果相比，得到的細(xì)胞團(tuán)塊更大，數(shù)量更多，細(xì)胞活性也更好，且能節(jié)約大量時(shí)間，最終提高了實(shí)驗(yàn)效率。在消化結(jié)束后，將未消化完全的細(xì)小組織塊也接種到培養(yǎng)瓶中，并靜置培養(yǎng)3～4d，以增加細(xì)胞接種密度，縮短細(xì)胞生長(zhǎng)的潛伏期，也有利于細(xì)胞提早進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，從而加快細(xì)胞的分裂增殖速度。

此外，在原代培養(yǎng)過(guò)程中，VSMCs 的純化也是我們重視的問(wèn)題之一。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)物理剔除法剝離外膜，以避免成纖維細(xì)胞的污染；同時(shí)通過(guò)銳利的手術(shù)刀片仔細(xì)刮除內(nèi)膜，避免內(nèi)皮細(xì)胞的污染；并以傳代為手段，利用目的細(xì)胞的群體優(yōu)勢(shì)，進(jìn)一步純化VSMCs。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：細(xì)胞傳代融合后，在形態(tài)學(xué)上呈現(xiàn)出典型的“峰-谷”狀交錯(cuò)生長(zhǎng)，即細(xì)胞密集處與稀疏處相互交錯(cuò)，“峰”為多層細(xì)胞丘，“谷”為稀疏排列的單層細(xì)胞[9]；同時(shí)結(jié)合α 平滑肌肌動(dòng)蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)結(jié)果，陽(yáng)性細(xì)胞率高達(dá)99%以上，據(jù)此可進(jìn)一步證明所培養(yǎng)的目的細(xì)胞為純度較高的VSMCs。

總之，本實(shí)驗(yàn)將酶消化法與組織塊法結(jié)合，成功培養(yǎng)出了大鼠胸腹VSMCs，并針對(duì)該細(xì)胞特有的生物抗原α 平滑肌肌動(dòng)蛋白，應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)染色方法，結(jié)合細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察，對(duì)所培養(yǎng)的目的細(xì)胞進(jìn)行了鑒定。該方法簡(jiǎn)便高效，實(shí)驗(yàn)成本低，成功率高，值得推廣。