犬尿氨酸信號通路的組成成分及對脊髓繼發(fā)性損傷的影響

鐘佳師，郭祥，劉亦恒，符策崗

（1 海南省臨高縣人民醫(yī)院外四科（骨科），臨高 571800；2 中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬?？卺t(yī)院骨科中心，?？?70208；3 上海市第六人民醫(yī)院-?？诠强婆c糖尿病醫(yī)院骨科，?？?570000）

當(dāng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system, CNS）損傷時，持續(xù)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)會加重繼發(fā)性損傷。此外，損傷局部活化的免疫細(xì)胞(Th1)大量會分泌的干擾素-γ（interferon-γ, INF-γ）或感染相關(guān)的脂多糖（lipopolysaccharide, LPS），這將誘導(dǎo)具有神經(jīng)保護(hù)作用的M2 小膠質(zhì)細(xì)胞/浸潤性巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂猩窠?jīng)毒性作用的M1 表型并進(jìn)一步激活犬尿氨酸信號通路（kynurenine pathway, KP）并促進(jìn)神經(jīng)毒性物質(zhì)喹啉酸（quinolinic acid, QUIN）的分泌[1,2]。QUIN能促進(jìn)多種神經(jīng)毒性反應(yīng)，包括：顯著的激活N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate, NMDA）受體、直接與游離鐵離子相互作用形成毒性復(fù)合物、引起神經(jīng)元Ga2+內(nèi)流、一氧化碳合酶（neuronal nitric oxide synthase, nNOS）活化、增加一氧化碳(NO)的產(chǎn)生、促進(jìn)活性氧（reactive oxygen species, ROS）等等。這些神經(jīng)毒性反應(yīng)將破壞線粒體膜的穩(wěn)定性、激活A(yù)DP-核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase, PARP)、并引起煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide, NAD+）過度消耗等等一系列不良事件，這些事件會引起惡性循環(huán)，比如線粒體功能障礙將促使KP 偏向犬尿氨酸3-羥化酶（kynurenine 3-monooxygenase, KMO）分支而產(chǎn)生更多的QUIN，最終導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞死亡[3,4]。

1 犬尿氨酸信號通路是色氨酸代謝的主要途徑

KP 負(fù)責(zé)95%的色氨酸降解，QUIN 和3-羥基犬尿氨酸（3-hydroxykynurenine, 3-OH-KYN, 3-HK）是主要的代謝產(chǎn)物（圖1）[3]。色氨酸在體內(nèi)主要用于合成五羥色胺和褪黑素，當(dāng)色氨酸需要分解代謝時，KP 將被激活。主要信號通路是：色氨酸在色氨酸雙加氧酶和吲哚胺2,3-二氧酶的催化下生成犬尿氨酸，緊接著在犬尿氨酸3-羥化酶的幫助下生成3-羥基犬尿氨酸，接下來又在犬尿氨酸酶的幫助下生成3-羥基氨基苯甲酸，然后在3-羥基氨基苯甲酸加氧酶的催化下生成2-氨基-3-羧基甲酸甲酯半醛，最終生成QUIN（具有促炎作用）。其他信號分支包括：犬尿氨酸在犬尿氨酸轉(zhuǎn)氨酶的幫助下生成犬尿稀酸（kynurenic acid, KYNA）(具有神經(jīng)保護(hù)作用)、3-羥基犬尿氨酸在犬尿氨酸轉(zhuǎn)氨酶的幫助下生成黃尿酸、犬尿氨酸在犬尿氨酸酶的幫助下先生產(chǎn)鄰氨基苯甲酸后再形成3-羥基氨基苯甲酸、2-氨基-3-羧基甲酸甲酯半醛在2-氨基-3-羧基甲酸甲酯半醛脫羧酶的催化下生產(chǎn)2-吡啶甲酸等等[5]。其中值得一提的是，QUIN 是內(nèi)源NMDA 受體激動劑，而KYNA 則是內(nèi)源性NMDA 受體拮抗劑，這兩個代謝分支彼此互相競爭、互相制約[2]。

圖1 犬尿氨酸通路示意圖。ACMS，-氨基-3-羧基甲酸甲酯半醛；TDO，色氨酸雙加氧酶；IDO，吲哚胺2,3-二氧酶；KAT，犬尿氨酸轉(zhuǎn)氨酶；KYNU，犬尿氨酸酶；KMO，犬尿氨酸3-羥化酶；3-HAO，3-羥基氨基苯甲酸加氧酶；ACMSD，2-氨基-3-羧基甲酸甲酯半醛脫羧酶；QPRT，喹啉酸磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶Fig. 1 Schematic diagram of the kynurenine pathway. ACMS, 2-amino-3-carboxymuconate semialdehyde； TDO, tryptophan dioxygenase； IDO, indoleamine 2,3-Dioygenase； KAT, kynurenine aminotransferase； KYNU, kynureninase； KMO, kynurenine 3-monooxygenase； 3-HAO, 3-hydroxyanthranilic acid oxygenase； ACMSD, 2-amino-3-carboxymuconate semialdehyde decarboxylase； QPRT, quinolinic acid phosphoribosyl transferase

如果KP 過度活化會引起QUIN 的過度分泌，加劇神經(jīng)毒性和神經(jīng)損傷[6]。此外，KP 的另一種主要代謝產(chǎn)物3-HK 及其下游產(chǎn)物3-羥基氨基苯甲酸（3-hydroxyanthranilic acid, 3-HAA）一開始被認(rèn)為是神經(jīng)毒性反應(yīng)的代謝產(chǎn)物，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)它在氧化還原反應(yīng)中也發(fā)揮重要的作用。盡管3-HAA 被證實(shí)能抑制膠質(zhì)細(xì)胞分泌細(xì)胞因子和炎癥趨化因子而發(fā)揮抗炎的作用，但是它另一方面又增加氧化還原應(yīng)激反應(yīng)并誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞死亡[7]。

2 脊髓損傷時巨噬細(xì)胞和犬尿氨酸信號通路的變化

SCI 預(yù)后差與損傷后具有促進(jìn)增殖和修復(fù)等神經(jīng)保護(hù)作用的M2 型小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞（主要是巨噬細(xì)胞）轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂屑?xì)胞毒性作用的M1型密切相關(guān)[8]。M1 型巨噬細(xì)胞能產(chǎn)生大量的促炎因子、活化 KMO 并激活KP，產(chǎn)生大量的QUIN 引發(fā)一系列神經(jīng)毒性反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡和嚴(yán)重的神經(jīng)后遺癥（圖2）[1]。

TNF-α、IL-1β、INF-γ、NO 和超氧陰離子（O2-）等細(xì)胞因子在促使M2 向M1 轉(zhuǎn)型中發(fā)揮重要的作用，他們都是活化KP （NO 和O2-）或者KP 下KMO分支的產(chǎn)物（TNF-α、IL-1β 和INF-γ）。研究證實(shí)，促使細(xì)胞因子譜轉(zhuǎn)向具有神經(jīng)保護(hù)作用的M2 型，對減少SCI 繼發(fā)性損傷，提高Basso Mouse Scale（BMS）評分至關(guān)重要[1,2]。需要注意的是，活化的M1 型巨噬細(xì)胞在SCI 分泌的QUIN 是未活化狀態(tài)下的204 倍，因此，巨噬細(xì)胞、KP、QUIN 以及神經(jīng)毒作用之間的聯(lián)系在近年受到了人們的廣泛關(guān)注[9]。

圖2 脊髓損傷中巨噬細(xì)胞、犬尿氨酸信號通路、QUIN 和神經(jīng)毒作用的關(guān)系。TRP，色氨酸；IDO，吲哚胺2,3-二氧酶；KYN，犬尿氨酸酶；KMO，犬尿氨酸3-羥化酶；3-HK，3-羥基犬尿氨酸；KYNU，犬尿氨酸酶；3-HAA，3-羥基2 氨基苯甲酸；3-HAO，3-羥基氨基苯甲酸加氧酶；QUIN，喹啉酸；TNF-α，腫瘤壞死因子α；INF-γ，干擾素γ；IL-1β, 白細(xì)胞介素1β；ROS，活性氧Fig. 2 Relationship between macrophage, kynurenine pathway, QUIN and neurotoxicity in the spinal cord injury. TRP, tryptophan； IDO, indoleamine 2, 3-dioygenase； KYN, kynurenin； KMO, kynurenine 3-monooxygenase； 3-HK, 3-hydroxykynurenine； KYNU, kynureninase； 3-HAA, 3-hydroxyanthranilic acid； 3-HAO, 3-hydroxyanthranilic acid oxygenase； QUIN, quinolinic acid； TNF-α, tumor necrosis factor-α； INF-γ, interferon-γ； IL-1β, interleukin-1β； ROS, reactive oxygen species

3 急性脊髓損傷中血紅素氧化酶1 與犬尿氨酸信號通路和核因子紅細(xì)胞相關(guān)因子2 信號通路的關(guān)系

早期就發(fā)現(xiàn)活化的中性粒細(xì)胞能大量分泌HO-1，且HO-1 抑制劑能延遲SCI 后運(yùn)動功能的恢復(fù)，預(yù)示著HO-1 在SCI 中發(fā)揮抗氧化的保護(hù)作用[10,11]。Nrf-2-抗氧化反應(yīng)元件（anti-oxidant response, ARE）是HO-1 的主要調(diào)節(jié)因子，靜息狀態(tài)下Nrf-2 待在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)與Keap1 蛋白結(jié)合處于失活狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激或內(nèi)源性損傷時，可以刺激Nrf-2 表達(dá)并移位到細(xì)胞核內(nèi)與ARE 反應(yīng)原件結(jié)合并誘導(dǎo)HO-1 的表達(dá)。有趣的是，KP 的代謝產(chǎn)物QUIN 和3-HK 都能激活Nrf-2 向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移，并激發(fā)抗氧化作用，這無疑與之前描述中QUIN 和3-HK的神經(jīng)毒性作用背道而馳[12]。進(jìn)一步的研究，通過將QUIN 處理的大鼠紋狀體切片后發(fā)現(xiàn)，Nrf-2 的細(xì)胞核轉(zhuǎn)移發(fā)生在1h 后，減少脂肪過氧化作用是在3h后[12]。因此我們有理由相信，QUIN 誘導(dǎo)的Nrf-2 細(xì)胞核轉(zhuǎn)移并不是直接的，我們更傾向于相信這是對QUIN 誘導(dǎo)ROS 后的一種補(bǔ)償機(jī)制或者負(fù)反饋，是抗氧化防御系統(tǒng)的一部分。

4 犬尿氨酸信號通路與SCI 治療

研究發(fā)現(xiàn)，SCI 發(fā)生5 天后，QUIN 在損傷局部升高超過10 倍，KP 的起始酶（也是限速酶）吲哚胺2,3-雙加氧酶（indoleamine 2,3-dioxygenase, IDO-1）升高2 倍，且值得一提的是，周圍未受傷的部位沒有發(fā)現(xiàn)這種變化[1]。在SCI 發(fā)生后，通過注射4-氯-3-羥基氰氨基甲酸酯（4-chloro-3-hydroxyanthranilate, 4-Cl-3-HAA）（一種3-羥基氨基苯甲酸加氧酶抑制劑）能有效阻斷3-HAA 轉(zhuǎn)換成QUIN，最終顯著降低神經(jīng)功能的缺失[13,14]。但要取得這樣良好的結(jié)果，必須在SCI 局部白質(zhì)的完整的條件下注射4-Cl-3-HAA才能實(shí)現(xiàn)[14]。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，單劑量的4-Cl-3-HAA 用于治療SCI 并不能達(dá)到上述相同的肢體感覺運(yùn)動的恢復(fù)，這表明4-Cl-3-HAA 的療效得益于長期的使用以減少Q(mào)UIN 在局部的聚集，而不是單純的早期抗氧化作用[15]。但是，4-Cl-3-HAA 并不能顯著提高具有神經(jīng)保護(hù)作用KYNA 的表達(dá)，研究發(fā)現(xiàn)，定向微量注射KYNA 能顯著改善SCI 后肢體功能的恢復(fù)，主要是因?yàn)镵YNA 的衍生物，葡萄糖胺，能促進(jìn)SCI 后神經(jīng)功能的恢復(fù)，減少功能缺失[16]?？偠灾?，如果能將KP 從產(chǎn)生QUIN 的KMO 分支轉(zhuǎn)向生成KYNA 的方向，這可能對SCI 的治療提供不可小視的幫助。

隨著研究的不斷發(fā)展，表觀遺傳學(xué)在近年受到人們的廣泛關(guān)注和青睞。KP 和SCI 的最新研究致力于通過基因調(diào)控SCI 中KAT-α（一種介導(dǎo)KYNA 合成的KP 相關(guān)酶）的表達(dá)，達(dá)到促進(jìn)SCI 功能恢復(fù)的目的[17]。這主要得益于KYNA 表達(dá)增加，能拮抗NMDA 受體，從而抑制神經(jīng)元Ga2+內(nèi)流和 nNOS 活化等一系列神經(jīng)毒性作用，這同時也會減少KMO 途徑的活化，降低QUIN 的生成。此外，氯胺酮及其他的NMDA 受體拮抗劑能顯著改善損傷引起的神經(jīng)性疼痛[18]。在一項(xiàng)大鼠研究中發(fā)現(xiàn)，在SCI 發(fā)生7d 后，坐骨神經(jīng)長期受到壓迫而引發(fā)的神經(jīng)性疼痛時，IDO2、KMO 和3-HAO 的mRNA 表達(dá)顯著升高。反復(fù)的使用KMO 抑制劑（UPF-648 和Ro 61-8048）能減少過敏反應(yīng)并減少神經(jīng)性疼痛，其目的也是將KP 更多地轉(zhuǎn)向了NMDA 受體拮抗劑KYNA的方向[19,20]。但是目前KP 用于SCI 治療的研究相對匱乏，大部分研究都集中于KP 用于大腦神經(jīng)退行性變的治療，因此仍需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來彌補(bǔ)KP 用于治療SCI 的空白，為最終用于臨床打下堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

5 小結(jié)

近年來KP 受到人們廣泛的關(guān)注，在多種疾病中被深入研究，包括重度抑郁、自殺傾向、孤獨(dú)癥、精神分類、帕金森和阿爾茨海默病等，并證實(shí)KP 在神經(jīng)退行性疾病中扮演重要角色，這給KP 與SCI 的研究奠定了良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)[21-24]。這些研究闡明的一些現(xiàn)象，也解釋了一些問題，同時也留給人們一些思考。針對KP 的研究證實(shí)，KMO 抑制劑對SCI的治療具有重要的價值，它不僅減少了長期炎癥引起的病理生理學(xué)影響，還緩解患者的情緒，且改善SCI 引發(fā)的神經(jīng)性疼痛[20]。當(dāng)發(fā)現(xiàn)KMO 抑制劑能顯著改善神經(jīng)的退行性變，并有助于阿爾茨海默病和亨延頓病的治療開始，針對KMO 抑制劑的研究就層出不窮，KMO 被認(rèn)為是比IDO-1 更好的治療靶向，因?yàn)橐种芀MO 不僅減少具有神經(jīng)毒性作用的QUIN 表達(dá)，且能增加具有神經(jīng)保護(hù)作用的KYNA表達(dá)。但是同時也觀察到，KMO 抑制劑并不能減少腦內(nèi)QUIN 的表達(dá)，但是能增加周圍KYNA 的表達(dá)并穿過血腦屏障引起腦內(nèi)KYNA 增高。最新的KMO 抑制劑（CHDI-340246 和UPF-648）也不能很好地作用于CNS，主要原因在于藥物難以穿透血腦屏障[20,25]。因此，發(fā)現(xiàn)一種具有良好血腦屏障滲透性的KMO 抑制劑，以幫助減少CNS QUIN 的分泌并增加KYNA，對神經(jīng)功能的保護(hù)和修復(fù)具有重要的意義。在這種情況下，Jacobs 等[26]已經(jīng)致力于新型KMO 抑制劑的探索，他們嘗試?yán)酶咄亢Y選，致力于發(fā)現(xiàn)具有良好CNS 滲透性的結(jié)構(gòu)，并最終應(yīng)用到SCI 的治療中去。目前以KP 作為治療靶向用于治療SCI 的研究尚淺，進(jìn)一步的探索兩者之內(nèi)的關(guān)系對提高SCI 的治療具有重要的意義。