超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)檢測白酒中7種甜味劑

白麗真，劉 偉，劉洪銀，張 帆

（北京順鑫農(nóng)業(yè)股份有限公司牛欄山酒廠，北京101301）

白酒是中國特有的一種蒸餾酒，是以大曲、小曲或麩曲及酒母等為糖化發(fā)酵劑，以糧谷為主要原料，經(jīng)蒸煮、糖化、發(fā)酵、蒸餾、陳釀和勾兌釀制而成的各類白酒。品質(zhì)優(yōu)良的白酒味道醇厚，且有綿甜之感，是因?yàn)榘拙浦泻卸嘣?、高級醇等甜味物質(zhì)，這些物質(zhì)是在白酒復(fù)雜特殊的釀造工藝和發(fā)酵過程中產(chǎn)生的。近年來，食品安全問題一直備受關(guān)注，尤其是食品添加劑引起的安全問題?，F(xiàn)在不少白酒生產(chǎn)企業(yè)為了改善白酒風(fēng)味，增加回甜感，在白酒中添加少量的甜味劑，既降低成本還能提高生產(chǎn)效率[1]。

甜味劑是指能賦予軟飲料甜味的食品添加劑，按其化學(xué)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)分為糖類和非糖類甜味劑。葡萄糖等糖類物質(zhì)，因長期被人食用，且是重要的營養(yǎng)素，通常視為食品原料，在中國不作為食品添加劑。而非糖類的甜味劑分為天然甜味劑和人工合成甜味劑，因其甜度較高，熱值很低，有些甚至不參與代謝過程[2]，被稱為非營養(yǎng)型甜味劑，受到人們的廣泛關(guān)注。天然甜味劑有甜菊糖苷、甘草等。人工合成甜味劑有糖精、糖精鈉、甜蜜素、阿斯巴甜等。

人工合成甜味劑雖不會被人體吸收，但長期攝入會對人體的代謝系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等造成傷害[3-4]?！妒称钒踩珖覙?biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》GB 2760—2014中規(guī)定白酒中甜味劑不得檢出[5]。市場抽查的白酒中可能檢出的甜味劑有糖精鈉、安賽蜜、甜蜜素、阿斯巴甜、紐甜、三氯蔗糖和甜菊糖苷等。

目前檢測白酒中的甜味劑的方法較多，其中液相質(zhì)譜快速、靈敏的特點(diǎn)使其在白酒的甜味劑檢測中的應(yīng)用越來越多[6-10]。本文建立了一種快速檢測白酒中最常見的7種人工合成甜味劑（安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素、紐甜、三氯蔗糖、阿斯巴甜、甜菊糖苷）的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-TQS）檢測方法[11-16]。該方法前處理簡單、進(jìn)樣時(shí)間短、結(jié)果準(zhǔn)確，可直接用于白酒生產(chǎn)企業(yè)白酒日常監(jiān)督檢測。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

樣品：市售的清香型白酒、濃香型白酒、醬香型白酒各2種，配制酒2種，某品牌蘋果醋1種和某品牌碳酸飲料1種。

試劑及耗材：甲醇、乙腈（LC/MS級，F(xiàn)isher）；甲酸（HPLC級，美國Waters公司）；實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q超純水；7種甜味劑：糖精鈉（含量97%，北京百靈威科技有限公司），三氯蔗糖（含量98%，北京百靈威科技有限公司），紐甜（含量98%，北京百靈威科技有限公司），甜蜜素（含量99%，北京百靈威科技有限公司），甜菊糖苷（含量80%，北京百靈威科技有限公司），阿斯巴甜（含量98%，北京百靈威科技有限公司），安賽蜜（含量99%，梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司）。

儀器設(shè)備：超高效液相色譜儀(ACQUITY UPLC?，美國Waters公司)-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀(ACQUITY?TQS，美國Waters公司)；Milli-Q Reference超純水發(fā)生器(美國Millipore公司)；電熱板（廣州格丹納儀器有限公司）；0.22 μm有機(jī)濾膜（天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；萬分之一分析天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)液制備

分別稱取一定量的糖精鈉、安賽蜜、三氯蔗糖、紐甜、甜蜜素、甜菊糖苷和阿斯巴甜標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶中，用超純水定容至10 mL，配制成各甜味劑標(biāo)準(zhǔn)儲備液。由于阿斯巴甜等在純水中不穩(wěn)定，易分解，配制時(shí)可加入少量乙酸調(diào)節(jié)pH4.3。標(biāo)準(zhǔn)液于4℃冰箱中保存。根據(jù)需要用超純水逐級稀釋至適當(dāng)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.2 樣品前處理

白酒樣品：準(zhǔn)確吸取白酒樣品10 mL于50 mL燒杯中，用電熱板120℃蒸發(fā)去酒精后，用超純水定容至10 mL，經(jīng)0.22 μm有機(jī)濾膜過濾，進(jìn)液質(zhì)檢測。

其他樣品：直接稀釋至合適濃度，經(jīng)0.22 μm有機(jī)濾膜過濾，進(jìn)液質(zhì)檢測。

1.2.3 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3(100 mm×2.1 mm,1.8 μm)；柱溫為 40 ℃；樣品室溫度為20℃；進(jìn)樣量：1 μL；流動相：A相為甲醇，B相為0.1%甲酸水溶液；流速：0.35 mL/min；梯度洗脫程序：0 min，10%A；0～4 min，10%A～90%A；4.0～4.5 min，90%A；4.51～6.5 min，10%A。

1.2.4 質(zhì)譜條件

質(zhì)譜儀選用電噴霧離子源，在負(fù)離子模式下檢測，采用多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)定量。毛細(xì)管電壓分別為2.5 kV，錐孔電壓為20 V，脫溶劑氣和錐孔氣流量分別設(shè)為800 L/h和50 L/h，脫溶劑氣溫度為

400℃。質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)采用了HSS T3色譜柱。根據(jù)7種甜味劑的極性特點(diǎn)，以及乙腈的強(qiáng)洗脫能力和較強(qiáng)毒性，最終確定用甲醇作為有機(jī)相。然后對比甲醇-水和甲醇-甲酸水溶液兩種流動相體系，發(fā)現(xiàn)用0.1%甲酸水溶液作為水相流動相進(jìn)樣時(shí)，7種甜味劑的峰形和響應(yīng)明顯比用水做流動相更好，且穩(wěn)定性更好。最終確定用甲醇-0.1%甲酸水溶液為流動相。

表1 7種甜味劑的質(zhì)譜條件參數(shù)

圖1 7種甜味劑的MRM色譜圖

表2 7種甜味劑線性回歸方程與相關(guān)系數(shù)

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)以電噴霧ESI源作為離子源，在負(fù)離子模式下，以直接進(jìn)樣的方式對7種甜味劑標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行全掃描，找到其準(zhǔn)分子離子峰，將其作為母離子，用惰性氣體氬氣轟擊，得到二級譜圖和相應(yīng)的子離子。用MRM模式對選定的子離子進(jìn)行質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化，取豐度最強(qiáng)的子離子作為定量離子。表1為7種甜味劑的質(zhì)譜條件參數(shù)。圖1為7種甜味劑在優(yōu)化的質(zhì)譜和色譜條件下的MRM色譜圖。

2.3 前處理方法的優(yōu)化

由于白酒中含有較高濃度的乙醇，直接進(jìn)樣分析會影響甜味劑在色譜柱上的保留時(shí)間和峰形，影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，因此在進(jìn)樣分析前會對白酒樣品進(jìn)行前處理。本實(shí)驗(yàn)用加水稀釋和蒸發(fā)去酒精兩種方式分別進(jìn)樣對比，發(fā)現(xiàn)由于白酒樣品的酒精度分為3個(gè)等級，高度酒和低度酒的稀釋倍數(shù)成為影響樣品檢測結(jié)果的一個(gè)重要因素，且甜味劑作為白酒的安全指標(biāo)，在白酒中的含量本來就很低，如果稀釋倍數(shù)過高，會影響結(jié)果的準(zhǔn)確性，因此本實(shí)驗(yàn)采用蒸發(fā)去酒精的方式處理樣品。

2.4 線性范圍、檢出限和定量限

由于各個(gè)甜味劑在質(zhì)譜上的響應(yīng)有差異，經(jīng)過優(yōu)化，使它們的響應(yīng)在同一個(gè)數(shù)量級。將配制好的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。以目標(biāo)組分的峰面積y對相應(yīng)的質(zhì)量濃度x繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明，所有的甜味劑均有較好的線性關(guān)系，以信噪比（S/N）為3確定檢出限（LOD），以信噪比（S/N）為10確定定量限（LOQ），結(jié)果見表2。

2.5 精密度和回收率

用在空白樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)溶液的方法，選擇某白酒酒樣做7種甜味劑檢測試驗(yàn)，7種甜味劑含量均為未檢出，選擇高、低兩種濃度進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，各做6次平行實(shí)驗(yàn)，計(jì)算平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。結(jié)果表明，白酒中7種待測物的回收率在91.8%～114%之間，RSD小于8%(表3)，方法的準(zhǔn)確度和精密度均符合殘留分析的要求。

表3 7種甜味劑回收率和精密度

2.6 實(shí)際樣品的檢測

用本檢測方法對市售的清香型白酒、濃香型白酒、醬香型白酒各2種，配制酒2種，某品牌蘋果醋1種和某品牌碳酸飲料1種進(jìn)行檢測，每個(gè)樣品做2次平行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表4。10個(gè)樣品中，白酒和配制酒中甜味劑均未檢出，蘋果醋飲料中三氯蔗糖有檢出，碳酸飲料中有3種甜味劑被檢出，分別是安賽蜜、三氯蔗糖和阿斯巴甜。從結(jié)果可以看出，甜味劑在飲料中有添加，有些飲料中添加的甜味劑不止一種，白酒中沒有甜味劑檢出。該方法操作簡單，成本低，快速準(zhǔn)確，可用于白酒生產(chǎn)企業(yè)日常監(jiān)督檢測。

表4 實(shí)際樣品的檢測 (μg/mL)

3 結(jié)論

研究建立了用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)對白酒中7種人工合成甜味劑含量快速測定和確證的方法，優(yōu)化了前處理方法、色譜和質(zhì)譜參數(shù)。該方法操作簡便，與國標(biāo)相比，前處理簡單，節(jié)約成本，進(jìn)樣時(shí)間只有6.5 min，分離效率高，同時(shí)具有靈敏度高、選擇性好、檢出限低、結(jié)果準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，方法的回收率和重現(xiàn)性能夠滿足白酒中7種甜味劑的日常監(jiān)督檢測。此方法也可用于檢測其他液體樣品中的甜味劑含量，為從源頭上控制白酒中甜味劑的出現(xiàn)提供了技術(shù)支持[1]，具有較高的實(shí)用價(jià)值。