支氣管哮喘患者外周血Th17/Treg及相關細胞因子的表達及臨床意義

舒姣潔 劉思伯 劉國梁 周恒杰 葛冬

[摘要]目的 探討支氣管哮喘患者外周血輔助性T細胞17（Th17）/調(diào)節(jié)性T細胞（Treg）及相關細胞因子的表達情況及臨床意義。方法 收集2016年10月～2017年10月我院收治的84例急性發(fā)作的支氣管哮喘患者作為哮喘組，另選取50例健康體檢者作為對照組。采用流式細胞術檢測外周血Th17細胞、Treg細胞水平，酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測血白細胞介素17（IL-17）、白細胞介素10（IL-10）、轉化生長因子β1（TGF-β1）表達水平，并測量肺功能指標。分析患者各指標與肺功能指標的相關性。結果 哮喘組急性期的外周血Th17細胞、Th17/Treg、血漿IL-17水平高于對照組及緩解期，哮喘組緩解期以上各指標高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。哮喘組急性期的IL-10、TGF-β1、Treg細胞以及肺功能指標低于對照組及緩解期，而緩解期的IL-10、TGF-β1、Treg細胞低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;哮喘組患者急性期的外周血Th17細胞、血漿IL-17水平與肺功能指標均成負相關（P<0.05）;而Treg細胞、IL-10、TGF-β1與肺功能指標均成正相關（P<0.05）。結論 支氣管哮喘患者體內(nèi)存在外周血Th17/Treg平衡紊亂，其效應細胞因子分泌出現(xiàn)異常。外周血Th17/Treg變化可反應哮喘患者體內(nèi)炎癥水平，有助于對哮喘機制進行進一步研究，為臨床診療提供新策略。

[關鍵詞]支氣管哮喘;輔助性T細胞17;調(diào)節(jié)性T細胞;細胞因子

[中圖分類號] R392? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1674-4721（2019）3（b）-0018-04

支氣管哮喘是最常見的慢性疾病之一，近年來發(fā)病率在我國有上升趨勢，其病程較長且易反復，嚴重危害患者的身心健康。支氣管哮喘發(fā)病機制復雜，由多種免疫因素共同參與[1]。輔助性T細胞1（T helper cell 1，Th1）/輔助性T細胞2（T helper cell 2，Th2）失衡理論在支氣管哮喘氣道炎癥中的作用已被廣泛認同，但仍不能完全解釋其發(fā)病機制[2]。目前，輔助性T細胞17（T helper cell 17，Th17）/調(diào)節(jié)性T細胞（regulatory T cells，Treg）失衡作為免疫性疾病的發(fā)病機制的研究日益受到重視[3]，Th17可通過分泌白細胞介素17（interleukin 17，IL-17）發(fā)揮促炎作用[4]，Treg則可通過釋放白細胞介素10（interleukin 10，IL-10）、轉化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）進而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[5]。本研究探討了支氣管哮喘患者外周血Th17/ Treg及相關細胞因子的表達情況，旨在進一步探討支氣管哮喘的發(fā)病機制，為支氣管哮喘的診療提供新思路及治療靶點，現(xiàn)報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料

收集2016年10月～2017年10月我院收治的84例急性發(fā)作的支氣管哮喘患者作為哮喘組。納入標準：①患者符合中華醫(yī)學會呼吸病學分會哮喘學組修訂的支氣管哮喘診斷標準[6];②所有患者均處于急性發(fā)作期，即喘息、氣促、咳嗽、胸悶等癥狀突然發(fā)生，或原有癥狀急劇加重，以呼氣流量降低為其特征;③所有患者入組前1個月內(nèi)均未使用糖皮質(zhì)激素及其他免疫抑制劑、免疫調(diào)節(jié)劑等。排除標準：①合并心、肝、腎等嚴重軀體疾病者;②合并自身免疫性疾病及其他過敏性疾病者;③入組前1個月內(nèi)，接受過糖皮質(zhì)激素及其他免疫抑制劑、免疫調(diào)節(jié)劑等類藥物者;④家屬不同意本研究者或患者無法配合者。哮喘緩解期即經(jīng)過治療或未經(jīng)過治療臨床體征正在消失，肺功能恢復到急性發(fā)作期前的水平，并維持3個月以上[6]。哮喘組中，男44例，女40例，平均年齡（39.3±3.9）歲。另選取同期于我院健康體檢者50例作為對照組，其中男26例，女24例，平均年齡（40.3±2.5）歲。哮喘組和對照組的一般資料比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），具有可比性。本研究經(jīng)我院醫(yī)學倫理委員會審核及同意，納入研究者及家屬均知曉本研究情況并簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1標本采集? 分別采集患者急性期及緩解期以及對照組清晨空腹靜脈血5 ml置于肝素抗凝管中，以2000 r/min（離心半徑為11 cm）離心10 min，置于-80℃冷凍保存，上層血漿用于測量細胞因子IL-10、IL-17和TGF-β1水平，沉淀部分用于分離單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）。

1.2.2外周血Th17細胞、Treg細胞的檢測? 采用Ficoll密度梯度離心法分離PBMC，磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline）洗2次后，配制RPMI 1640培養(yǎng)基，加入PBMC進行細胞重懸。將懸液置于24孔板中，細胞計數(shù)2×109/L，每孔依次加入佛波酯至終濃度50 μg/L、離子霉素至750 μg/L、莫能星至2 μmol/L后，于CO2培養(yǎng)箱（37℃，5%CO2）中培養(yǎng)5 h。以2000 r/min的速度離心8 min，棄上清洗滌細胞。分別取1×106 PBMC于流式專用試管中，標記哮喘組和對照組的Th17測量管和Treg測量管，在哮喘組和對照組的Th17測量管中分別加入抗人CD4-FITC單克隆抗體，Treg測量管中加入抗人CD4-FITC和CD25-PE單克隆抗體。于室溫環(huán)境下，避光孵育30 min。予PBS洗滌，350 g速度離心5 min后棄上清，重新懸浮細胞，每管各200 μl。PE標記抗人IL-17抗體，取10 μl加入兩組Th17測量管中，同時兩組Treg測量管中加入10 μl PE標記的抗人Foxp3抗體。Th17細胞測量管于避光、室溫條件下孵育30 min，Treg測量管則于避光、4℃條件下孵育30 min。洗滌重懸，流式細胞儀進行分析。分別用CD4直方圖設門區(qū)及CD4、CD25設門區(qū)分出CD4+細胞及CD4+ CD25+細胞，IL-17染色陽性為Th17細胞、FOXP3+染色陽性為Treg細胞。采用EXPO32 ADC Analysis軟件進行結果分析，計算兩種細胞占CD4+T細胞的比例，結果用百分數(shù)表示。相關試劑及抗體均購自美國eBioscience公司，Epics-XL流式細胞儀為美國Beckman-Coulter公司生產(chǎn)。

1.2.3血漿細胞因子IL-17、IL-10、TGF-β1的檢測? 復溫血漿后測量細胞因子IL-17、IL-10、TGF-β1，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA），相關試劑盒購自美國eBioscience公司，所有步驟均嚴格參照使用說明書。

1.2.4肺功能的測定? BTL Industries Limited生產(chǎn)的BTL-08 Spiro肺功能測量儀檢測肺功能指標，包括：第1秒用力呼氣量（forced expiratory volume in the first second，F(xiàn)EV1）、第1秒用力呼量占用力肺活量比值（forced expiratory volume in one second/flow control valve，F(xiàn)EV1/FCV）和呼氣流量峰值（peak expiratory flow，PEF）。所有項目均由肺功能室專業(yè)醫(yī)師負責測量。

1.3統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗;計數(shù)資料采用率表示，組間比較采用χ2檢驗，采用Pearson檢驗進行相關性分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1不同時期哮喘組與對照組外周血Th17細胞、Treg細胞的比較

哮喘組急性期的外周血Th17細胞、Th17/Treg高于對照組及緩解期，哮喘組緩解期的外周血Th17細胞、Th17/Treg高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。哮喘組急性期的Treg細胞低于對照組及緩解期，同時哮喘組緩解期的Treg細胞低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）（表1）。

2.2不同時期哮喘組與對照組血漿IL-17、IL-10、TGF-β1的比較

哮喘組急性期的血漿IL-17高于對照組及緩解期，IL-10、TGF-β1低于對照組及緩解期，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。哮喘組緩解期的血漿IL-17高于對照組，IL-10、TGF-β1低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）（表2）。

2.3不同時期哮喘組與對照組肺功能指標的比較

哮喘組急性期的肺功能指標（FEV1、FEV1/FCV、PEF）水平低于對照組及緩解期，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;哮喘組緩解期的FEV1、FEV1/FCV、PEF水平與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）（表3）。

2.4哮喘組患者急性期各指標相關性分析

哮喘組患者急性期的外周血Th17細胞、血漿IL-17水平與FEV1、FEV1/FCV、PEF均成負相關（P<0.05）;而Treg細胞、IL-10、TGF-β1與FEV1、FEV1/FCV、PEF均成正相關（P<0.05）（表4）。

3討論

支氣管哮喘發(fā)病機制復雜，可能受到遺傳、環(huán)境、生活方式等多種因素相互作用影響[7]。氣道的炎癥機制被認為是其最主要的發(fā)病機制，由多種細胞（如T淋巴細胞、嗜酸性粒細胞、肥大細胞、中性粒細胞等）和細胞因子共同參與[8]。其中，T細胞具有多種生物學功能，參與大量免疫調(diào)節(jié)過程，其介導的免疫失衡在哮喘的發(fā)生發(fā)展中起到了關鍵作用，既往的研究已證明Th1/Th2平衡失調(diào)在支氣管哮喘發(fā)病中起著重要作用[9]，但仍不能完全解釋哮喘的發(fā)病機制。近年來，針對Th17細胞和Treg細胞的研究不斷深入，發(fā)現(xiàn)Th17細胞及Treg細胞的失衡在支氣管哮喘發(fā)病機制中也可能有重要作用，其相關細胞因子的表達可能參與了哮喘患者的氣道炎性反應。

本研究結果提示，哮喘組急性期的外周血Th17細胞、Th17/Treg、血漿IL-17水平高于對照組，哮喘組緩解期以上各指標高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。哮喘組急性期的IL-10、TGF-β1、Treg細胞以及肺功能指標低于對照組，而緩解期的IL-10、TGF-β1、Treg細胞低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），說明與對照組相比，哮喘患者外周血Th17細胞及其效應細胞因子IL-17顯著增加，而 Treg細胞及其效應細胞因子 IL-10和TGF-β1則顯著下降，哮喘組的Th17/Treg細胞比值明顯高于對照組，提示Th17/Treg失衡在支氣管哮喘中存在重要意義，其可能通過調(diào)節(jié)各自效應細胞因子的分泌來發(fā)揮促炎及抗炎等作用。正常情況下，外周血Th17細胞和Treg細胞通常維持一個平衡狀態(tài)，Th17細胞及其效應性細胞因子IL-17在機體中有促炎作用[10]，可引起氣道高反應。IL-17作為促炎癥因子，誘導細胞釋放大量炎性因子，如IL-8、白細胞介素6（interleukin 6，IL-6）等，進一步大量募集中性粒細胞，最終導致氣道重塑[11-12]。一方面，Treg細胞表面因子可以與靶細胞表面的受體直接結合來發(fā)揮免疫抑制作用[13]，另一方面，其還能分泌IL-10、TGF-β1等細胞因子來負反饋調(diào)節(jié)Th細胞的活化和增殖，抑制炎癥反應，維持機體免疫穩(wěn)態(tài)[14-15]。本研究結果提示，哮喘組急性期的外周血Th17細胞、Th17/Treg、血漿IL-17水平高于緩解期，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。哮喘組急性期的IL-10、TGF-β1、Treg細胞以及肺功能指標低于緩解期，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），說明隨著哮喘病情的緩解，肺功能水平的改善，Th17細胞、IL-17水平顯著下降，而Treg細胞、IL-10、TGF-β1水平顯著升高，這證明在支氣管哮喘的急性發(fā)作過程中，Th17/Treg細胞亞群的失衡可能起到了重要的作用。

哮喘為氣道慢性炎癥反應所致的氣道的可逆性阻塞及氣道高反應[16]。隨著發(fā)作次數(shù)的增加，有可能出現(xiàn)一定程度不可逆的氣道損害[17]。肺功能水平能夠反映哮喘患者發(fā)作時氣道阻塞的嚴重程度以及頻繁發(fā)作對氣道造成的相對不可逆損害[18]。本研究進一步分析結果提示，在急性期支氣管哮喘患者中，哮喘組患者急性期的外周血Th17細胞、血漿IL-17水平與肺功能指標均成負相關（P<0.05）;而Treg細胞、IL-10、TGF-β1與肺功能指標均成正相關（P<0.05）。進一步明確了外周血Th17細胞及其相關細胞因子IL-17水平的升高可能提示哮喘患者病情更為嚴重，氣道氣流受限更為明顯。而Treg細胞及其相關細胞因子IL-10、TGF-β1則可能對哮喘患者氣道存在保護作用。由此可知，外周血Th17細胞、Treg細胞平衡性與哮喘嚴重程度可能具有一定相關性。

綜上所述，哮喘患者體內(nèi)存在外周血Th17/Treg平衡紊亂，其效應細胞因子分泌出現(xiàn)異常。檢測患者外周血Th17/Treg變化，可以了解哮喘患者體內(nèi)炎癥水平，有助于對哮喘機制進行進一步研究，為臨床診療提供新策略。

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（收稿日期：2018-12-21? 本文編輯：孟慶卿）