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    朝鮮薊中2種木犀草素類化合物液相制備條件優(yōu)化

    2019-04-29 03:31:42師明月曹清明李群鐘文惠王元清劉志文張喜平
    食品與機械 2019年3期
    關(guān)鍵詞:草素木犀乙腈

    師明月曹清明李 群鐘文惠王元清劉志文張喜平

    (1. 中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,湖南 長沙 410004;2. 匯美農(nóng)業(yè)科技有限公司, 湖南 常德 415137;3. 常德市農(nóng)林科學(xué)研究院,湖南 常德 415000)

    朝鮮薊是一種高營養(yǎng)價值的保健蔬菜[1-2],被譽為“蔬菜之皇”[3-4],其提取物一直用于民間醫(yī)藥[5],在各種藥理試驗中表現(xiàn)出促進消化[6]、保肝[7]、利膽[8]、抗癌[9]以及抑制低密度脂蛋白氧化[10]的能力。臨床試驗表明,朝鮮薊具有降低血漿膽固醇[11-12]、降低腸易激綜合征[13]、減肥[14]以及控制空腹血糖升高[15]等功效。

    朝鮮薊的次生代謝產(chǎn)物主要是多酚類化合物[16-18]和具有苦味的愈創(chuàng)木烷倍半萜內(nèi)酯類化合物。多酚類化合物表現(xiàn)出抗氧化能力等活性,愈創(chuàng)木烷倍半萜內(nèi)酯表現(xiàn)出抗炎及抑制腫瘤等多種功效[19-20]。

    Pandino等[21]報道了6個品種朝鮮薊的3個部位(包括花托、外苞片和內(nèi)苞片)的多酚含量,研究結(jié)果表明木犀草素糖苷類化合物含量為24(Tema 2000品種的外苞片)~620 mg/kg(Tondo di Paestum品種的花托),其含量比咖啡??鼘幩犷惢衔锖縖23(Tema 2000品種的內(nèi)苞片)~5 771 mg/kg(Violetto di Sicilia品種的內(nèi)苞片)]和芹菜素含量[870(Blanc Hyerois品種的內(nèi)苞片)~5 397 mg/kg(Tema 2000品種的花托)]低。木犀草素(luteolin)類化合物含量雖低于其他2類酚類化合物,但由于其B環(huán)具有鄰二酚羥基結(jié)構(gòu),表現(xiàn)出強抗氧化活性、抑制膽固醇合成、抑制糖尿病以及抗腫瘤活性等功效。Schlupper等[22]研究木犀草素及其衍生物的活性發(fā)現(xiàn),木犀草素、木犀草素7-O-糖苷在極低濃度下表現(xiàn)出明顯的抗氧化能力;Gebhardt[23]研究表明木犀草素類化合物的木犀草素配苷主要負責(zé)抑制肝臟膽固醇的生物合成,而綠原酸、咖啡酸、洋薊素和其他二咖啡??鼘幩釤o顯著影響;且木犀草素亦能有效阻斷胰島素對膽固醇生物合成的影響,從而驗證了朝鮮薊的降血脂作用。木犀草素對表皮生長因子受體—酪氨酸激酶(EGFR-TK)具有明顯抑制作用。Rahimuddin等[24]研究發(fā)現(xiàn)木犀草素及其糖苷對UVA導(dǎo)致的皮膚成纖維細胞脂質(zhì)過氧化具有抑制作用。

    目前,中國種植的朝鮮薊品種主要有:改良綠球、綠寶石、帝王之星、A106、A109、洛爾卡和上海朝鮮薊等[25]。洛爾卡(Lorca)是常德市于2005年從法國引進的一個加工型朝鮮薊新品種,并通過常德市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所、匯美農(nóng)業(yè)科技有限公司選育,經(jīng)過多年試驗與示范,目前已成為湖南省的主要栽培品種[26]。課題組擬以洛爾卡朝鮮薊作為研究對象,開發(fā)木犀草素類化合物的分離純化新方法。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    朝鮮薊(CynarascolymusL.)花苞:洛爾卡(Lorca)品種,常德匯美農(nóng)業(yè)科技有限公司提供。

    大孔樹脂:AB-8型,安徽三星樹脂科技有限公司;

    木犀草苷-7-β-D-蕓香糖苷標(biāo)準(zhǔn)品:HPLC純,純度≥98.0%,美國Sigma-Aldrich公司;

    木犀草素7-O-β-D-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品:HPLC純,純度≥98.0%,美國Sigma-Aldrich公司;

    氘代試劑CH3OD:氘代率≥99.8%,美國Sigma-Aldrich公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    RP-C18層析柱:Sepax GP-C18型,粒徑40~60 μm,蘇州賽分科技有限公司;

    Sepax GP-C18柱:4.6 mm×150 mm,40~60 μm,自制;

    Venusil MP C18柱:4.6 mm×250 mm,5 μm,天津博納艾杰爾科技有限公司;

    Venusil MP C18柱:10 mm×250 mm,5 μm,天津博納艾杰爾科技有限公司;

    Unitary C18柱:4.6 mm×250 mm,5 μm,華譜新創(chuàng)科技有限公司;

    高效液相色譜儀:LC3000型(配備Newstyle NU3000 Serials UV/VIS檢測器),北京創(chuàng)新恒通科技有限公司;

    高效液相色譜:2695-2996型,美國Waters公司;

    質(zhì)譜儀:UHPLC-QTOF/1290-6530型,美國安捷倫科技有限公司;

    核磁共振儀:Bruker AVANCE-500MHz型,德國Bruker公司。

    1.3 方法

    1.3.1 朝鮮薊粗提液的制備 將朝鮮薊曬干,粉碎,得到1.1 kg朝鮮薊粉末。在室溫下,將1.1 kg朝鮮薊粉末按料液比1∶10(g/mL)的比例,用70%乙醇浸提72 h。過濾,得到2 L粗提液。

    1.3.2 液相色譜條件 對朝鮮薊粗提液進行液相條件摸索:進樣量20 μL,流動相為甲醇-0.1%甲酸水,流速1 mL/min,檢測波長205 nm時,峰的數(shù)量較多,為朝鮮薊提取液分析的較好條件,如無另外說明,將采納該條件。

    1.3.3 AB-8型大孔樹脂對提取物進行粗分 采用大孔樹脂吸附法(AB-8型)對朝鮮薊粗提液(1 L)進行分離純化。具體步驟:將1 L柱體積的大孔樹脂顆粒進行預(yù)處理后裝柱,用水沖至無醇味,上樣過程中,接收流出液進行液相色譜檢測(分析上樣量是否超載),洗脫梯度為0~30 min,流動相A由5%增至100%。待樣品完全吸附后,依次用水,20%,50%,80%乙醇進行洗脫,洗脫至無色或顏色較淺,將接收的流出液依次編號為:A1、A2、A3……,經(jīng)高效液相色譜檢測進行合并,洗脫梯度為0~30 min,流動相A由5%增至100%。

    1.3.4 RP-C18對A27~29組分進行細分 用Sepax GP-C18填料(40~60 μm)自制液相柱優(yōu)化洗脫程序,以確定RP-C18層析柱的洗脫程序。將4 g冷凍干燥樣品(A27~29組分)用50%甲醇完全溶解,濃度為40 mg/mL。根據(jù)分離度選擇優(yōu)化洗脫條件。將液相優(yōu)化程序用于柱層析洗脫程序。將接收的流出液依次編號為:C1、C2、C3……。

    1.3.5 組分C16~19的液相半制備 由于半制備時液相色譜采用的色譜柱的靈敏度和分離度都較低,故在進行液相半制備之前,需對半制備條件進行摸索。試驗以分離度和峰型為優(yōu)化目的,設(shè)置了5種流動相組成(體積比),流動相1、流動相2、流動相3、流動相4和流動相5分別為60∶40的甲醇-0.1%甲酸水、45∶55的甲醇-0.1% 甲酸水、40∶60的乙腈-0.1%甲酸水、30∶70的乙腈-0.1%甲酸水、23∶77的乙腈-0.1%甲酸水,比較分析以獲得最佳流動相分析條件。待條件優(yōu)化后,采用Venusil MP C18(10 mm×250 mm,5 μm)半制備柱,流速增至3 mL/min進行放大制備。為避免樣品浪費,縮短制備時間,還需確定進樣量,試驗設(shè)置了30,50 μL進樣量進行研究。

    1.3.6 質(zhì)譜條件

    (1) 質(zhì)譜工作站軟件:Agilent MassHunter B.06.00版。色譜工作站軟件:Agilent 1200化學(xué)工作站。

    (2) LC-MS工作條件:Unitary C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)色譜柱,洗脫劑乙腈—水(體積比25∶75),進樣量2 μL,檢測波長254 nm;電噴霧離子源,正、負離子檢測。

    1.3.7 核磁共振檢測條件 溶劑為CH3OD,NMR的工作頻率分別為1H譜500 MHz,13C譜為125 MHz。1H-NMR 譜采樣脈沖寬度90°,累加32次;13C-NMR譜采樣脈沖寬度90°,累加2 000次。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 AB-8型大孔樹脂對樣品進行粗分

    根據(jù)HPLC圖的峰型和出峰時間進行合并,A27~29組分出峰相對簡單(如圖 1所示),3個組分出峰相似,合并,濃縮,冷凍干燥,得到4 g目標(biāo)組分A27~29。

    2.2 RP-C18對A27~29組分進行細分

    優(yōu)化的洗脫條件見表1,此條件下分離效果較好。將此條件用于A27~29組分的洗脫,即:依次用30%,48%,100%甲醇進行洗脫。通過計算,30%甲醇用量為6 L,48%甲醇用量為4 L,100%甲醇用量為2 L。根據(jù)液相檢測結(jié)果合并為C1、C2~4、C5~10、C11~15、C16~19……,分別減壓濃縮,冷凍干燥,得到C16~19組分0.32 g。圖2中,組分C16~19出峰較為簡單,能夠分離出純化合物,考慮對C16~19組分進行液相半制備。

    圖1 A29組分的HPLC分析圖

    表1 HPLC洗脫程序

    圖2 C16~19組分的HPLC分析圖

    2.3 組分C16~19的液相半制備

    2.3.1 液相條件的優(yōu)化

    (1) 流動相的優(yōu)化:對5個不同流動相進行比較,得到乙腈∶0.1%甲酸水(體積比)=23∶77(流動相5)為最優(yōu)流動相。

    由圖3(a)可知,在流動相1條件下,甲醇濃度為60%,由于甲醇濃度過高,造成各峰一起被洗脫,且未達到基線分離,故需要降低甲醇濃度。圖3(b)中,在流動相2條件下,降低甲醇濃度,分離效果仍不太理想,故改用乙腈作為流動相,40%乙腈濃度(流動相3)色譜圖如3(c),峰一下被洗脫,需降低乙腈濃度,故改用流動相4(30%乙腈),出峰如圖3(d),各峰集中,較快被洗脫,說明30%乙腈濃度過高,將乙腈濃度降低到23%(流動相5),如圖3(e)所示,各峰的分離效果比較好。故優(yōu)化的液相分析條件:流動相A為乙腈(23%),B為0.1%甲酸水(77%);優(yōu)化的洗脫條件見表2。

    (2) 分離度比較:為判斷物質(zhì)在色譜柱中的分離情況,常用分離度作為柱的總分離效能指標(biāo),分離度越大則表明物質(zhì)在色譜柱中的分離效果越好。對上述的5種不同的流動相分析條件所得的圖譜進行分離度比較(以色譜圖中第一、第二2個峰之間的分離度計算),結(jié)果如表3所示。

    從圖2(e)、表3可知,在乙腈∶0.1%甲酸水為23 ∶77(體積比)的條件下,分離度較大,分離效果最好,且峰形尖銳,保留時間合適,對環(huán)境有害的有機相使用比例更少。

    圖3 C16~19組分在5種不同流動相下的HPLC分析圖

    表2 優(yōu)化的C16~19組分HPLC洗脫程序

    表3 5種分離條件下的分離度

    (3) 制備條件的確定:利用上述優(yōu)化的條件,除將柱子改為半制備柱[Venusil MP C18(10 mm×250 mm,5 μm),流速改為3 mL/min]外,其他條件不變,即洗脫程序為表2所示。將C16~19組分用23%乙腈溶解,分別對進樣量30,50 μL進行優(yōu)化,所得制備圖(50 μL進樣量色譜見圖4)差異較小,為節(jié)省溶劑,縮短試驗時間及損耗,本試驗選擇進樣量為50 μL。

    圖4 C16~19組分的HPLC半制備圖(50 μL)

    綜上所述,半制備條件為:流速3 mL/min,進樣量50 μL,流動相A為乙腈,流動相B為0.1%甲酸水,洗脫程序如表2所示(40 min后的梯度為沖洗色譜柱)。

    2.3.2 液相半制備 將0.32 g C16~19組分用23%乙腈溶解,濃度為200 mg/mL,按優(yōu)化的條件制備。如圖4所示,峰I、II分離效果較好,分別收集峰I、II。將收集液減壓濃縮,冷凍干燥后,稱重,液相色譜測定純度,并得到純度較高的2個化合物,記為H-01、H-02,其質(zhì)量分別為30,15 mg,提取得率分別為54.5,27.3 mg/kg,純度分別為97.8%,96.5%。2個樣品純度均符合核磁檢測條件。

    2.4 化合物的結(jié)構(gòu)解析

    2.4.1 H-01 ESI-MS給出:正離子模式下,質(zhì)譜數(shù)據(jù)m/z595.165 7[M+H]+;負離子模式下,質(zhì)譜數(shù)據(jù)m/z593.149 2[M-H]-,推測其分子式為C27H30O15。1H-NMR:6.52(1H,s,H-3), 6.46(1H,d,J=2 Hz,H-6),6.63(1H,d,J=2 Hz,H-8),7.33(2H,m,H-2′,6′),6.88(1H,s,H-5′),5.00(1H,m,H-1″),3.64(1H,m,H-6″a),4.05(1H,d,J=9.7 Hz,H-6″b),4.73(1H,s,H-1?),3.93(1H,s,H-2?),3.76(1H,d,J=9.4 Hz,H-3?),1.20(3H,d,J=5.8 Hz,H-6?)。13C-NMR:166.73(C-2), 104.14(C-3),183.85(C-4),162.76(C-5),101.07(C-6),164.57(C-7),96.16(C-8), 158.67(C-9),107.00(C-10),123.37(C-1′),116.85(C-2′),146.84(C-3′),151.06(C-4′),114.29(C-5′),120.62(C-6′),102.05(C-1″),74.71(C-2″),77.73(C-3″),71.31(C-4″),77.09(C-5″),67.47(C-6″),101.54(C-1?),72.37(C-2?),72.03(C-3?),74.03(C-4?),69.77(C-5?),17.91(C-6?)。

    綜合所有核磁譜圖及質(zhì)譜結(jié)果,H-01鑒定為Luteolin 7-O-α-L-Rhamnosyl(1-6)-β-D-Glucoside(木犀草素7-O-α-L-鼠李糖(1-6)-β-D-葡萄糖苷),將其1H-NMR、13C-NMR以及質(zhì)譜數(shù)據(jù)與文獻[27]報道的化合物3對照,基本一致。

    2.4.2 H-02 質(zhì)譜數(shù)據(jù)m/z449.109 4[M+H]+、碎片離子287.057 5+,推測其分子式為C21H20O11,含有一個黃酮骨架和一個葡萄糖糖苷。1H-NMR:6.56(1H,s,H-3),6.45(1H,s,H-6),6.74(1H,s,H-8),7.37(1H,s,H-2′),6.89(1H,d,J=8.0 Hz,H-5′),7.38(1H,d,J=8.0 Hz,H-6′),5.07(1H,d,J=7.0 Hz,H-1″), 3.50~3.60(2H,m,H-2″,H-3″),3.40(1H,m,H-5″),3.96(1H,d,J=12.2 Hz,H-6″a),3.72-3.75 (1H,dd,J=12.2,5.6 Hz,H-6″b)。13C-NMR:166.82(C-2),107.08(C-3),183.99(C-4),164.74(C-5),101.16(C-6),,162.82(C-7),96.07(C-8),158.93(C-9),104.18(C-10),123.48(C-1′),114.31(C-2′),147.03(C-3′),151.16(C-4′),116.80(C-5′),120.53(C-6′),101.64(C-1″),74.75(C-2″),77.86(C-3″),71.29(C-4″),78.39(C-5″),62.49(C-6″)。

    綜合所有核磁譜圖及質(zhì)譜結(jié)果,H-02鑒定為Luteolin 7-O-β-D-Glucoside(木犀草素7-O-β-D-葡萄糖苷),將其1H-NMR、13C-NMR及質(zhì)譜數(shù)據(jù)與文獻[28]報道的化合物1對照,基本一致。

    2.5 C16~19組分中木犀草素含量的確定

    采用表2優(yōu)化的液相條件,將木犀草苷-7-蕓香糖苷和木犀草素7-O-β-D-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)樣品分別用乙腈溶解,進行液相分析。采用外標(biāo)法,對C16~19組分中的木犀草苷-7-蕓香糖苷和木犀草素7-O-β-D-葡萄糖苷進行定量,結(jié)果表明,2個化合物在C16~19流分中的含量分別為10.4%,5.1%,C16~19流分中H-01和H-02制備的得率分別為90.1%,91.9%,說明該液相制備方法的優(yōu)化合理,可應(yīng)用于類似組分的分離制備。

    3 結(jié)論

    本研究以洛爾卡(Lorca)為研究對象,開發(fā)了木犀草素類化合物的分離純化新方法,得到純度分別為97.8%和96.5%的木犀草苷-7-蕓香糖苷和木犀草素7-O-β-D-葡萄糖苷,其總提取得率分別為54.5,27.3 mg/kg,與Pandino等[21]研究的朝鮮薊相比,本試驗中所采集的樣品木犀草素類化合物含量中等,若能選擇木犀草素類化合物含量高的樣品,可制備更多的純品。木犀草素糖苷由于B環(huán)具有3’,4’鄰二酚羥基結(jié)構(gòu),其具有較強的抗氧化功能,分離和純化木犀草素糖苷具有非常重要的意義。

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