小桐子bZIP轉錄因子的全基因組鑒定及表達分析

王海波, 郭俊云, 唐利洲, 劉 潮

(1.曲靖師范學院, 云南高原生物資源保護與利用研究中心, 云南省高校云貴高原動植物遺傳多樣性及生態(tài)適應性進化重點實驗室, 云南 曲靖 655011; 2.曲靖師范學院 生物資源與食品工程學院, 云南 曲靖 655011)

在真核生物中，反式作用因子(Trans-acting factor)能直接或間接識別、結合啟動子及RNA聚合酶[1]。此類蛋白的不同功能區(qū)通過結合功能基因或調控基因的啟動子順式作用元件或與其他蛋白互作來調控基因的表達[2]。植物體內參與逆境脅迫響應的主要轉錄因子家族包括AP2/ERF、bZIP、WRKY、NAC、MYB等，而植物體內普遍存在且數量眾多、功能多樣的bZIP轉錄因子家族是抗逆性形成的主要參與者[3]。堿性亮氨酸拉鏈(Basic leucine zipper，bZIP)是廣泛存在于真核生物中的保守轉錄因子，多序列比對分析顯示，其核心bZIP結構域由60～80個氨基酸殘基組成，包括堿性結構域(BR)與亮氨酸拉鏈區(qū)(LZ)[4]。BR位于bZIP蛋白的N端，由約16個氨基酸殘基組成N-X7-R/K(X代表任意氨基酸殘基)基序[3]，是包括核定位信號以及可以結合順式作用元件的堿性區(qū)域，而LZ區(qū)每隔7個氨基酸殘基存在1個亮氨酸，通過形成雙極性的α-螺旋結構與BR區(qū)緊密結合并調節(jié)bZIP蛋白與DNA結合之前的二聚體化過程[3,5]。bZIP 類轉錄因子識別基因啟動子的核心序列為ACGT順式作用元件如CACGTG(G盒)、GACGTC(C盒)、TACGTA(A盒)、AACGTT(T盒)以及TGA(G/C)TCA(GCN4)等，一些受光或脫落酸(ABA)誘導的基因的啟動子區(qū)都含有這些元件，其中G盒元件普遍存在于受 ABA、生長素、茉莉酸、水楊酸誘導的基因中[3,6-7]。根據bZIP轉錄因子DNA的結合特異性及堿性區(qū)域的氨基酸排列順序，Jakoby等[3]將bZIP基因家族分為A、B、C、D、E、F、G、H、I及S 10個亞族，其中，A亞族與S亞族研究較為廣泛，而B亞族與F亞族則報道較少。文獻報道，A、C、S亞族主要參與植物非生物脅迫響應過程及激素信號轉導過程的調控，而D、G、H、I亞族在植物防御生物病害、種子成熟、光形態(tài)建成、氮素同化、維管系統(tǒng)發(fā)育等生理生化過程發(fā)揮重要作用[8]。

目前，多種植物的bZIP基因家族已經在全基因組水平進行了鑒定及分析，其中擬南芥75個[3]、水稻89個[4]、玉米125個[5]、大豆131個[9]、高粱92個[10]、葡萄55個[11]、番茄76個[12]、蘋果120個[13]。

小桐子(JatrophacurcasL.)屬大戟科(Euphorbiaceae)麻瘋樹屬(Jatropha)落葉灌木或小喬木，作為新興開發(fā)的木本油料植物，其種子含油量高，品質優(yōu)良，成分接近石化柴油，兼具良好的經濟效益與生態(tài)效應，具有極為廣闊的開發(fā)前景。2011年，小桐子基因組由日本Kazusa DNA研究所首次測序完成[14]，2014年，中國科學院對小桐子基因組進行了高通量重測序，為從基因組水平上分析小桐子bZIP基因家族提供了條件。本研究對小桐子bZIP基因家族進行了全基因組鑒定，并系統(tǒng)分析了其基因成員的理化性質、基因結構、功能結構域、進化關系、染色體定位、共線性關系及低溫條件下的表達特性等，為篩選潛在的與小桐子抗冷相關bZIP基因并進行功能鑒定奠定了基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料及處理

試驗所用小桐子種子取自云南省楚雄州元謀縣干熱河谷地區(qū)(東經101°40′，北緯25°23′)。選取飽滿的小桐子種子，用1.0% CuSO4消毒20 min，無菌水漂洗5次，置燒杯中水浸吸漲24 h。將吸漲的種子在無菌水中漂洗3次，播于墊有飽和無菌水海綿的托盤中，于溫度26 ℃、相對濕度75%的恒溫培養(yǎng)箱中萌發(fā)5 d。將發(fā)芽的種子播于消毒的培養(yǎng)土中并于溫度26 ℃、相對濕度75%、光周期16 h/8 h的恒溫培養(yǎng)箱中生長15 d至第2片真葉展開，每天用無菌水澆灌培養(yǎng)土。將生長15 d的小桐子幼苗置于溫度12 ℃、相對濕度75%、16 h/8 h光周期的低溫培養(yǎng)箱中進行低溫處理，分別取低溫處理12，24，48 h與對照(CK，正常培養(yǎng))的第2片真葉與根，以及吸漲24 h的種子，液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱中用于RNA的提取。

1.2 試驗方法

1.2.1 小桐子bZIP基因家族的鑒定 從GenBank下載小桐子最新注釋蛋白質數據庫。通過Pfam(http://pfam.xfam.org/)下載bZIP結構域的隱馬可夫HMM模型(PF00170、PF07716、CPF12498、PF03131)，利用Hmmer 3.0軟件的Hmmsearch程序對小桐子蛋白質數據庫進行檢索(閾值E<1e-10，序列相似性>50%)，得到候選的小桐子bZIP蛋白質序列，利用Excel腳本去除重復序列。從TAIR數據庫(https://www.arabidopsis.org/)下載75個已經鑒定的擬南芥bZIP基因的蛋白質序列[3]，通過ClustalX進行多重序列比對，利用Hmmer 3.0軟件的Hmmbuild程序將比對文件轉換為HMM模型，同上條件對小桐子蛋白質數據庫進行檢索。將以上2種方法獲得的小桐子bZIP蛋白質序列取并集，經過去除重復序列，將非冗余的候選序列利用Pfam與CDD在線工具分析bZIP蛋白結構域做進一步篩選，得到最終的小桐子bZIP家族蛋白質序列。

1.2.2 小桐子bZIP家族基因的基本參數分析 將鑒定到的小桐子bZIP蛋白質序列對小桐子基因組數據庫進行tBlastN相似性檢索，下載其對應的基因序列、ORF(Open Reading Frame)序列、mRNA序列以及CDS(Coding sequence)序列。利用ExPaSy提供的在線工具ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)對得到的小桐子bZIP蛋白質序列進行氨基酸數目、理論分子量(Mw)、等電點(pI)、氨基酸組成等基本參數的分析。亞細胞定位采用CELLO服務器V2.5(http://cello.life.nctu.edu.tw/)進行鑒定。另外，根據bZIP的CDS序列對小桐子基因組進行BlastN相似性檢索得到各bZIP基因起始密碼子ATG上游1 500 bp的調控序列，并通過PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)對其順式作用元件進行鑒定。

1.2.3 系統(tǒng)進化樹構建與蛋白質結構域分析 將鑒定到的小桐子bZIP蛋白序列利用ClustalX(Version 2.0)進行序列相似性比對，然后用MEGA 6.0軟件通過鄰接法(NJ)構建系統(tǒng)進化樹，并采用自展法(Bootstrap)進行檢驗。利用軟件GenBank的Spidey工具(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/splign/splign.cgi)進行bZIP的CDS序列與基因序列比對以確定基因內含子與外顯子的結構，并利用GSDS(Gene Structure Display Server，http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)繪制基因結構圖。利用MEME(http://meme-suite.org/tools/meme)在線分析工具對bZIP蛋白質序列進行motif分析(參數設置：最優(yōu)氨基酸殘基寬度6～200；任意數量的重復次數；最多預測10個motif)。利用GenDOC軟件對ClustalX比對結果進行bZIP蛋白的bZIP保守結構域分析。

1.2.4 染色體定位及基因家族復制與共線性分析 染色體定位以Wu等[15]構建的小桐子遺傳連鎖圖譜進行錨定，并通過MapChart(Version 2.1)繪制基因定位圖。利用Mauve(Version 2.4)進行小桐子bZIP家族基因的復制共線性分析，其中，片段復制(Ancient segmental duplication)基因對及對應的Ka(The number of nonsynonymous substitutions per nonsynonymous site，非同義突變率)、Ks(The number of synonymous substitutions per synonymous site，同義突變率)值通過PAL2NAL在線軟件的CODEMAL程序進行鑒定與計算[16]，并通過Ka/Ks比值以確定基因在進化中受到的選擇壓力，分化時間采用Ks/2λ計算，其中λ取值為6.1×10-9，同時，利用Circos(http://www.circos.ca/)(Versioin0.69)繪制bZIP家族基因在小桐子染色體的定位及基因間的共線性關系。

1.2.5 小桐子bZIP家族基因的表達分析 從GenBank的SRA數據庫下載小桐子不同器官的Illumina高通量測序數據(葉片SRR1639660、根SRR1639659、種子SRR1639661)。通過Bowtie2與Samtools工具將鑒定到的小桐子bZIP家族基因與測序數據進行比對，得到各bZIP基因的表達Reads數據，之后通過Cufflinks程序計算每個基因的表達量FPKM(Fragments Per Kilobase per Million)值，進行以2為底的對數轉化，選擇層次聚類法(Hierarchical clustering)對基因與不同器官分別進行聚類。另外，以筆者前期小桐子轉錄組[17]與數字基因表達譜(Digital gene expression)[18]數據為基礎，提取對照與12 ℃低溫處理12，24，48 h的bZIP基因的原始Clean Taq數據，通過TPM(Transcript per million clean tags)獲得標準化的基因表達量[19-20]，得到小桐子bZIP家族基因在低溫處理下的差異表達數據。利用R軟件(Version 3.4.1)的Gplots與Pheatmap函數進行聚類分析熱圖(Heatmap)的繪制。

利用TRIzol法(Invitrogen公司)提取小桐子葉片、根、種子及對照與不同低溫處理下葉片與根的總RNA，并利用DNase Ⅰ(Thermo公司)消化RNA中的殘余基因組DNA，得到純化的總RNA。分別取3 μg總RNA，以Random primer為逆轉錄引物，利用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo公司)合成第一鏈cDNA?；诟咄坎町惐磉_數據，分別以β-Actin與GADPH為器官表達與低溫表達內參，進行bZIP基因的器官(JcbZIP3、JcbZIP17、JcbZIP22、JcbZIP33、JcbZIP41)與低溫處理(JcbZIP1、JcbZIP3、JcbZIP6、JcbZIP10、JcbZIP14)qRT-PCR(Quantitative real-time PCR)表達分析，所用儀器為Bio-Rad CFX Connect，試劑為Power SYBR Green PCR Master Mix(Thermo公司)，所用引物序列見表1，20 μL反應體系，每個樣品重復3次。擴增條件為：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性10 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，45個循環(huán)；之后增加溶解曲線程序：65～95 ℃連續(xù)檢測信號5 s，0.5 ℃增量。采用2-ΔΔCt法進行相對表達量分析。器官差異表達分析以葉片的表達量為基準，低溫差異表達分析以對照(CK)的表達量為基準。

表1 qRT-PCR表達分析引物序列Tab.1 Primer sequences for qRT-PCR expression analysis

AA.氨基酸殘基數量；Ip.等電點；EN.外顯子數量。The AA, Ip, and EN represent amino acid residue count, isoelectric point, and exon count, respectively.

2 結果與分析

2.1 小桐子bZIP基因家族的鑒定與序列特征

通過bZIP結構域的HMM模型檢索，在小桐子全基因組共鑒定到51個bZIP基因家族成員，分別命名為JcbZIP1-JcbZIP51(表2、圖1)。理化參數分析結果表明，小桐子51個bZIP基因的基因長度分布在647(JcbZIP23)～16 972(JcbZIP6)bp，蛋白質長度分布在113(JcbZIP13)～768(JcbZIP43)個氨基酸，理論等電點分布在4.70(JcbZIP14)～10.30(JcbZIP15)。根據CELLO的預測顯示，除JcbZIP34定位在葉綠體之外，其他50個小桐子bZIP基因都定位在細胞核(表2)。

表2 小桐子bZIP基因家族基因參數Tab.2 Gene parameters of bZIP genes in J.curcas

2.2 小桐子bZIP基因家族的基因結構與結構域分析

根據Jakoby等[3]擬南芥bZIP基因家族的分類標準，通過ClustalX構建小桐子bZIP基因家族進化樹，依據聚類特點及bZIP結構域的氨基酸特性，分為A(13個)、B(3個)、C(3個)、D(7個)、E(4個)、F(1個)、G(3個)、H(2個)、I(7個)及S (8個)10個亞族(圖1)。結果顯示，聚類亞族與bZIP基因結構、氨基酸長度、等電點及外顯子數量呈直接相關性。其中，D、E、G、H及S亞族的氨基酸長度分布較為集中，S亞族蛋白長度主要分布在100～200個氨基酸，E亞族蛋白分布在300～400個氨基酸，而C與G亞族蛋白分布在300～450個氨基酸。另外，C與D亞族成員的等電點多集中在6～7，而A與H亞族成員的等電點多偏堿性，大部分分布在7～10。同時，各亞族成員都存在顯著的基因結構特異性，S亞族除JcbZIP7之外，7個基因都只有1個外顯子，且基因長度較短，都存在5′-UTR與3′-UTR區(qū)域；E、H及I亞族基因存在4～5個外顯子，且大部分基因的第一與最后一個外顯子分別與5′-UTR和3′-UTR區(qū)域重合，而中間的2～3個外顯子則較短且較為分散；A亞族基因存在3～6個外顯子，且部分基因如JcbZIP4、JcbZIP11、JcbZIP31及JcbZIP44存在獨立外顯子的5′-UTR區(qū)域，而D(JcbZIP9、JcbZIP19、JcbZIP22及JcbZIP25)與G(JcbZIP29、JcbZIP35及JcbZIP40)亞族部分基因也存在類似現象；G亞族3個基因包含12～13個外顯子，是小桐子bZIP基因家族中外顯子最多的，且分布規(guī)律與D亞族基因類似(圖1)。

通過MEME對小桐子51個bZIP基因的蛋白序列進行結構域檢索，都鑒定到1個長度為60～80個氨基酸的保守bZIP結構域(圖2)。其中， D與S亞族成員bZIP結構域主要分布在N端，亞族A、E、G及H主要分布在C端，而亞族B、C、F及I則主要集中在氨基酸序列的中部。進一步通過ClustalX對小桐子51個bZIP基因的bZIP結構域進行多序列比對，表明小桐子bZIP結構域N端都含有一個堿性區(qū)域N-X7-R/K，接著R/K 9個氨基酸之后，每隔7個氨基酸存在一個Leu，即亮氨酸拉鏈區(qū)域。其中，堿性區(qū)域R/K氨基酸殘基(圖3星號所示)之后的-RK-(圖3箭頭所示)絕對保守，所有小桐子bZIP成員都相同，亮氨酸拉鏈區(qū)的第2個Leu也較為保守，而第3個Leu則在不同的bZIP成員中差異較大(圖3)。

1號表示bZIP結構域。bZIP domains are indicated by No.1.

2.3 小桐子bZIP家族基因順式作用元件鑒定

通過PlantCARE工具對小桐子51個bZIP基因起始密碼子ATG上游1 500 bp啟動子序列的13個順式作用元件進行鑒定(表3)，結果表明，JcbZIP3基因鑒定到最多27個元件，而JcbZIP8僅發(fā)現3個元件。其中，響應激素的元件中，包含赤霉素元件(GARE-motif)、脫落酸元件(ABRE)、乙烯元件(ERE)、生長素元件(Aux-core)的bZIP基因分別鑒定到31，26，19，4個，其中JcbZIP2與JcbZIP4最多鑒定到4個赤霉素響應元件、JcbZIP3最多鑒定到13個脫落酸響應元件。另外，分別有25，33個小桐子bZIP基因鑒定到響應茉莉酸甲酯(CGTCA-motif/TGACG-motif)與水楊酸(TCA-element)信號分子元件。同時有35個bZIP基因還發(fā)現了防御與脅迫響應相關元件(TC-rich repeats)，占小桐子bZIP基因總數的68.7%，預示大部分bZIP基因參與小桐子逆境脅迫應答過程，其中，41個(80.4%)bZIP基因包含高溫響應元件(HSE)、21個包含創(chuàng)傷響應元件(W-box、WUN-motif)、14個包含低溫響應元件(LTR)。

實線表示堿性結構域(BR)，虛線表示亮氨酸拉鏈區(qū)(LZ)；星號表示N-X7-R/K基序的保守Arg(R)或Lys(K)殘基；三角形表示保守的Leu殘基；箭頭表示保守的-RK-殘基。Basic region (BR) and Leucine zipper (LZ) are showed by solid and dotted lines, respectively; the asterisk represents the conserved Arg or Lys residues in N-X7-R/K motif; the triangles indicate the three conserved Leu residues in leucine zipper region; and the arrows mean the conserved-RK-residues.

基因名稱Gene namesABREAREAux-coreCGTCA-motif/TGACG-motifEREGARE-motifHSELTRMBSTC-rich repeatsTCA-elementW-boxWUN-motif總數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

注：ABRE (TACGTG).脫落酸響應元件；ARE (TGGTTT/AAACCA).厭氧響應元件； Aux-core (GGTCCAT).生長素響應元件；CGTCA-motif/TGACG-motif (CGTCA/TGACG).茉莉酸甲酯響應元件； ERE (ATTTCAAA).乙烯響應元件；GARE-motif (AAACAGA/TCTGTTG).赤霉素響應元件； HSE (GAAAATTCG/AAAAAATTTC/AAAAAATTTC/AAAAAATTTC).高溫響應元件； LTR (CCGAAA).低溫響應元件； MBS (CGGTCA).MYB結合元件；TC-rich repeats (ATTCTCTAAC/ATTTTCTTCA/GTTTTCTTAC/ATTTTCTCCA).防御響應元件；TCA-element (CAGAAAAGGA/TCAGAAGAGG/GAGAAGAATA/CCATCTTTTT).水楊酸響應元件；W-box (TTGACC).創(chuàng)傷與病原菌響應元件； WUN-motif (TCATTACGAA/AAATTTCCT).創(chuàng)傷響應元件。

Note：ABRE (TACGTG).Cis-acting element involved in abscisic acid responsiveness; ARE (TGGTTT/AAACCA). Cis-acting regulatory element essential for the anaerobic induction; Aux-core (GGTCCAT). Cis-acting regulatory element involved in auxin responsiveness; CGTCA-motif/TGACG-motif (CGTCA/TGACG). Cis-acting regulatory element involved in MeJA responsiveness; ERE (ATTTCAAA). Ethylene-responsive element; GARE-motif (AAACAGA/TCTGTTG). Gibberellin-responsive element; HSE (GAAAATTCG/AAAAAATTTC/AAAAAATTTC/AAAAAATTTC). Cis-acting element involved in heat stress responsiveness; LTR (CCGAAA). Cis-acting element involved in low-temperature responsiveness; MBS (CGGTCA). MYB binding site; TC-rich repeats (ATTCTCTAAC/ATTTTCTTCA/GTTTTCTTAC/ATTTTCTCCA). Cis-acting element involved in defense and stress responsiveness; TCA-element (CAGAAAAGGA/TCAGAAGAGG/GAGAAGAATA/CCATCTTTTT). Cis-acting element involved in salicylic acid responsiveness; W-box (TTGACC). Cis-acting regulatory element involved in wounding and pathogen responsiveness; WUN-motif (TCATTACGAA/AAATTTCCT). Wound-responsive element.

2.4 小桐子bZIP基因家族染色體定位及復制分析

依據Wu等[15]構建的小桐子高密度遺傳連鎖圖譜，通過基因組Scaffold數據在染色體水平定位每個小桐子bZIP基因，并使用MapChart使信息可視化(圖4)，結果表明，51個小桐子bZIP基因不均勻地分布于11條染色體上，其中4號染色體上的基因數量最多13個，占小桐子bZIP基因總數的25.5%，11號染色體的基因數最少，僅有1個。基因組及基因片段復制與基因串聯復制是基因家族擴張與蛋白質功能多樣性演化的重要方式。在小桐子2號與4號染色體鑒定到bZIP基因家族的5對串聯復制，如JcbZIP22/JcbZIP31、JcbZIP24/JcbZIP32、JcbZIP25/JcbZIP26、JcbZIP14/JcbZIP20、JcbZIP16/JcbZIP21，另外，小桐子bZIP基因家族在進化中存在11對片段復制現象(圖4虛線所示)，進一步對其進行進化選擇壓力分析表明(表4)，所有片段復制基因對的Ka/Ks<1，表明這些基因都受純化選擇(Purifying selection)，進化分歧時間在108.442 6百萬～445.024 6百萬年。以上結果暗示，小桐子bZIP基因家族在擴張進化與功能分化過程中片段復制起更主要的作用，與擬南芥[3]、葡萄[11]、番茄[12]中的研究結果一致。同時，共線性分析顯示，大量bZIP基因對存在交叉共線性關系，表明小桐子bZIP基因在進化過程中，含有這些bZIP基因的Scaffold或染色體片段發(fā)生了基因組倍增(Paleopolyploidy)(圖5)。

灰色區(qū)域表示基因組片段復制，虛線表示基因片段復制，豎線表示基因串聯復制；刻度表示厘摩；LG表示染色體。The gray areas represent genome-wide segmental duplication, the dotted lines indicate ancient segmental duplication, and the vertical black lines indicate tandem duplication based on genome synteny; The scale is in centiMorgans (cM); LG.Chromosome.

圖5 小桐子bZIP家族基因的共線性分析Fig.5 Synteny analysis of J.curcas bZIP genes

復制基因Duplicate genes一致性/%IdentityKaKsKa/Ks分化時間/百萬年Divergence time純化選擇Purifying selectionJcbZIP7/JcbZIP1277.010.167 32.812 40.059 5230.524 6+JcbZIP33/JcbZIP4777.590.206 52.621 00.078 8214.836 1+JcbZIP9/JcbZIP3881.030.149 31.323 00.112 9108.442 6+JcbZIP19/JcbZIP2575.860.202 11.358 60.148 7111.360 7+JcbZIP49/JcbZIP5176.440.564 02.117 90.266 3173.598 4+JcbZIP24/JcbZIP5082.760.299 12.374 20.126 0194.606 6+JcbZIP16/JcbZIP4279.880.254 51.982 70.128 4162.516 4+JcbZIP17/JcbZIP2878.160.322 24.430 30.072 7363.139 3+JcbZIP21/JcbZIP4172.990.607 15.429 30.111 8445.024 6+JcbZIP4/JcbZIP3173.560.447 64.314 30.103 8353.631 1+JcbZIP5/JcbZIP1178.160.261 61.842 40.142 0151.016 4+

注：一致性表示兩基因相互匹配部分的相似性；Ka、Ks分別表示非同義突變率與同義突變率；分化時間用Ks/2λ計算，其中λ取值為6.1×10-9。

Note： Identity indicates the identity of alignment part in two genes; Ka and Ks indicate the number of nonsynonymous substitutions per nonsynonymous site and the number of synonymous substitutions per synonymous site, respectively; Divergence time was calculated by Ks/2λ (λ=6.1×10-9).

2.5 小桐子bZIP家族基因的表達分析

從GenBank的SRA數據庫下載小桐子葉片、根及種子的高通量表達測序數據，以FPKM為參數，通過Cufflinks程序得到小桐子51個bZIP基因的表達量，利用R軟件對表達數據進行聚類分析及熱圖繪制(圖6-A)。結果表明，有26個bZIP基因在小桐子3種器官中都有表達，其中，JcbZIP7、JcbZIP12、JcbZIP14、JcbZIP39及JcbZIP43的表達量較高，而JcbZIP13、JcbZIP15、JcbZIP23、JcbZIP26、JcbZIP27及JcbZIP48在3種器官中都沒有表達。在葉片、根及種子中分別鑒定到有30，42，40個bZIP基因表達，另外，有25個小桐子bZIP基因的表達存在器官特異性，如JcbZIP17、JcbZIP33及JcbZIP46僅在根中有表達；JcbZIP31、JcbZIP32及JcbZIP45僅在種子有表達；JcbZIP4、JcbZIP8、JcbZIP22、JcbZIP24、JcbZIP28、JcbZIP30、JcbZIP37及JcbZIP50在根與種子中表達量較高，而在葉片中表達量較低或不表達；JcbZIP41在葉片與根中表達，而在種子中不表達。通過qRT-PCR試驗驗證JcbZIP17與JcbZIP33在根中表達量較高，而JcbZIP41在葉片中表達量較高(圖7)，與測序數據的結果一致。

A.器官差異表達; B.低溫處理差異表達。A.Differential expression in different organs; B.Differential expression under chilling hardening.

通過數字基因表達譜數據分析得到27個小桐子bZIP家族基因低溫處理下在葉片中的表達數據(圖6-B)，其中，鑒定到14個bZIP基因在低溫條件下上調表達。與對照相比，JcbZIP1、JcbZIP3、JcbZIP7、JcbZIP13、JcbZIP14、JcbZIP39、JcbZIP44及JcbZIP47在低溫條件下上調表達顯著，而JcbZIP3與JcbZIP14達到了極顯著水平(P<0.01)，qRT-PCR試驗數據也顯示兩者表達量在低溫鍛煉24 h時達到最高(圖8)，與小桐子抗冷性的形成及低溫信號轉導過程直接相關，也作為抗冷功能基因篩選的候選目標。同時，JcbZIP6、JcbZIP26、JcbZIP27、JcbZIP34及JcbZIP43在低溫鍛煉的不同時間段都有小量上調表達，但都未達到顯著水平，其中，JcbZIP6基因的qRT-PCR試驗驗證與測序數據吻合(圖8)。相反，JcbZIP4、JcbZIP24、JcbZIP28、JcbZIP32及JcbZIP36下調表達明顯，其中，JcbZIP36在低溫處理12，24 h時較對照都下調表達104.0倍(P<0.01)。另外，對5個bZIP基因在根中的低溫表達進行qRT-PCR分析，結果表明，低溫處理下，JcbZIP1、JcbZIP3、JcbZIP6及JcbZIP10在低溫處理12 h時表達量都有一定上調，但都未達到顯著水平，說明在根中其對低溫處理不敏感，而JcbZIP14基因隨著低溫處理時間的延長，表達量持續(xù)上調，可能參與小桐子根中低溫脅迫的響應過程(圖9)。

圖7 小桐子不同器官中bZIP基因的qRT-PCR差異表達分析Fig.7 Differential expression analysis of bZIP genes in different organs

A.JcbZIP1; B.JcbZIP3; C.JcbZIP6; D.JcbZIP10; E.JcbZIP14。圖9同。A.JcbZIP1; B.JcbZIP3; C.JcbZIP6; D.JcbZIP10; E.JcbZIP14.The same as Fig.9.

圖9 低溫處理下小桐子bZIP基因在根中的qRT-PCR表達分析Fig.9 qRT-PCR relative expression levels of J.curcas bZIP genes in roots under chilling hardening

3 討論

文獻報道，A、B、H及S亞族bZIP基因主要參與植物非生物脅迫響應及激素信號轉導過程。其中，A亞族bZIP基因的信號傳遞主要依賴于ABA信號途徑，如擬南芥A亞族的AREB(ABA response element)/ABFs(ABA-responsive element binding proteins)類bZIP轉錄因子，可激活非生物逆境脅迫下的ABA依賴基因的表達[21]。其中，ABF1主要參與低溫、ABA脅迫應答，ABF2與ABF4主要參與干旱、高鹽、高溫及氧化脅迫應答，而ABF3則受到ABA、低溫脅迫的誘導[8,21-22]。在小桐子A亞族中鑒定到8個AREB/ABFs類bZIP轉錄因子，JcbZIP4、JcbZIP5、JcbZIP18、JcbZIP26、JcbZIP31、JcbZIP34、JcbZIP44及JcbZIP48，且在其bZIP結構域的堿性區(qū)域都發(fā)現M/KIK與QAY/Q特有基序[8]，以上bZIP轉錄因子通過結合非生物脅迫響應基因啟動子區(qū)域的ABA響應元件ABRE(ABA response element)從而激活基因的表達，參與小桐子一系列抗逆性響應過程。另外，本研究中鑒定的51個小桐子bZIP基因，有26個基因在其啟動子區(qū)域發(fā)現了ABRE元件，其中JcbZIP3最多有13個ABRE元件，說明部分小桐子bZIP基因的表達也受到ABA信號分子的調控，與擬南芥報道的ABI5轉錄因子一致[23]，綜合分析發(fā)現，小桐子bZIP基因的JcbZIP18與JcbZIP48同時兼具ABRE元件受到ABA的表達調控，同時也可以結合其他基因的ABRE元件調控相關基因的表達。根據擬南芥bZIP基因的功能驗證報道，B亞族bZIP轉錄因子如擬南芥AtbZIP17(At2g40950)[24]、AtbZIP28(At3g10800)[25-26]可以作為非生物逆境脅迫的感應器和傳感器，通過C端錨定在內質網膜上，促進脅迫響應基因的表達，尤其在抗鹽脅迫中發(fā)揮作用[26]，而小桐子中與AtbZIP17及AtbZIP28的同源基因JcbZIP43在其啟動子中鑒定到防御相關元件、高溫及低溫響應元件，同時氨基酸序列的C端二級結構預測以α-螺旋為主，且富含非極性氨基酸殘基如Leu、Val，預示JcbZIP43可能通過C端α-螺旋定位在膜結構上，發(fā)揮調節(jié)脅迫相關基因的表達。另外，擬南芥H亞族的HY5(AtbZIP56、At5g11260)與HYH(AtbZIP64、At3g17609)主要在光形態(tài)建成中發(fā)揮作用[27]，都含有CKII磷酸化位點與WD40作用結構域[3,28-29]，另外還可以結合生長素(AUX/IAAs)、乙烯(ERFs)及赤霉素途徑的靶基因從而響應激素應答信號[30]。小桐子H亞族也包含2個基因，順式作用元件分析表明，分別在小桐子HY5同源基因JcbZIP21與HYH同源基因JcbZIP21的啟動子序列中發(fā)現赤霉素(GARE)與乙烯(ERE)響應元件，說明小桐子H亞族2個基因同樣也參與激素信號轉導過程。S亞族bZIP轉錄因子一般成員較多，大部分基因廣泛受脅迫處理的激活，如低溫等[4-5,31]。進一步分析表明，小桐子51個bZIP基因中有14個在其啟動子中鑒定到低溫響應元件(LTR)，其中，小桐子S亞族bZIP基因中，JcbZIP7、JcbZIP30、JcbZIP33及JcbZIP39包含LTR元件，可能參與小桐子抗冷性形成過程，其余10個小桐子低溫響應bZIP基因分別屬于A(JcbZIP4、JcbZIP5、JcbZIP23)、B(JcbZIP3、JcbZIP43)、C(JcbZIP20)、D(JcbZIP46)、H(JcbZIP21)及I(JcbZIP24、JcbZIP50)亞族，同時，數字基因表達譜數據也顯示，JcbZIP3、JcbZIP7、JcbZIP20、JcbZIP39及JcbZIP43在低溫處理下上調表達，與預測結果一致。

同源或異源的2個bZIP結構域形成二聚體，通過堿性區(qū)域(Basic region)特異結合下游基因啟動子序列從而調控其表達，其核心元件序列為ACGT[32]。部分植物病原相關基因啟動子上也存在G-box(CACGTG)或C-box(GACGTC)序列(下劃線表示核心元件序列ACGT)，功能研究表明，當植物遇到病原浸染時，擬南芥D亞族bZIP轉錄因子如TGA1(At5g65210)[33]、TGA2/AHBP-1b(At5g06950)[34]、TGA3(At1g22070)[35]、TGA4/OBF4(At5g10030)[36]、TGA5/OBF5(At5g06960)[34]、TGA6(At3g12250)[34]可以結合以上元件，從而誘導病原相關基因(PR)的通體表達，使植物獲得系統(tǒng)抗病性(SAR)，其中，除bZIP結構域外的DOG1基序對于D亞族bZIP轉錄因子功能的發(fā)揮也是必需的。本研究中7個小桐子D亞族bZIP轉錄因子的bZIP結構域之后也都鑒定到DOG1基序，包括保守的序列-D/ELRI/L-與-GGFRS/PSELLK/NLL-，另外，小桐子G亞族3個bZIP轉錄因子JcbZIP29、JcbZIP35、JcbZIP40的bZIP結構域之前都發(fā)現了MFMR結構域，該結構域長度150～200個氨基酸，其N端主要促進bZIP轉錄因子與G-box的結合從而調控光信號感應與傳遞相關基因的表達，而C端包含富Pro區(qū)域(Proline rich domain，PRD)與核定位信號序列，并且3個小桐子G亞族bZIP轉錄因子都鑒定到該結構域保守序列-P[HP]YMW-、-MMPP/SYGT/AP-及-YAHP-，與擬南芥G亞族同源轉錄因子GBF1(At4g36730)[37]、GBF2(At4g01120)[38]及GBF3(At2g46270)[39]的蛋白結構與功能驗證相符。