不同毛花雀稗種質(zhì)對干旱脅迫的響應(yīng)及其抗旱性評價

黃莉娟，趙麗麗，2*，唐華江，孫小富，王普昶，陳 超

(1.貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院草業(yè)科學(xué)系，貴州 貴陽 550025；2. 山地植物資源保護(hù)與種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點(diǎn)實驗室，貴州 貴陽 550025；3. 貴州省晴隆縣草地畜牧中心，貴州 晴隆 561400；4. 貴州省草業(yè)研究所，貴州 貴陽 550006)

【研究意義】干旱是影響植物生長的逆境因子之一。干旱脅迫下植物的膜脂過氧化物、保護(hù)酶和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)等發(fā)生變化，自由基累積引起膜傷害和膜脂過氧化等作用[1-2]。丙二醛(MDA)是反映細(xì)胞膜過氧化作用的重要指標(biāo)，其累積量與細(xì)胞膜過氧化作用呈正相關(guān)；植物體內(nèi)的抗氧化酶〔如過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)〕和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)〔如可溶性糖(SS)、可溶性蛋白(SP)〕組成了植物體內(nèi)清除自由基的抗氧化系統(tǒng)，對細(xì)胞起到保護(hù)作用[2-5]。不同植物，甚至同種植物不同種質(zhì)對干旱的生理響應(yīng)不同，抗旱性也存在差異。丁龍等[6]指出，黑果枸杞、金露梅、蒙古蕕、檸條和花棒等5種西北旱區(qū)植物可通過積累有機(jī)溶質(zhì)和提高抗氧化酶活性減輕植物細(xì)胞在干旱脅迫下受到的傷害，且各植物在光合作用及生理生化等方面對土壤干旱脅迫做出了積極響應(yīng)，但不同植物對干旱脅迫的適應(yīng)性不同。張薈薈等[7]研究12份苜蓿(MedicagoSative)種質(zhì)材料苗期抗旱性指出，不同種質(zhì)材料間的抗旱性存在差異。毛花雀稗(Paspalumdilatatum)是多年生草本植物，原產(chǎn)于南美，適應(yīng)性強(qiáng)，在貴州廣泛分布于海拔2 200米以下地區(qū)。具有產(chǎn)量高、適口性好、營養(yǎng)豐富、抗寒耐旱、四季常綠等特性，常作為優(yōu)良牧草引種栽培[8-9]。【前人研究進(jìn)展】目前，關(guān)于毛花雀稗的研究主要集中在產(chǎn)草量、種質(zhì)比較、混播草地建植技術(shù)、生育特性和馴化栽培等方面[9-13]，而針對干旱脅迫下毛花雀稗生理響應(yīng)機(jī)制的系統(tǒng)研究鮮見報道。【本研究切入點(diǎn)】研究植物對干旱脅迫的響應(yīng)機(jī)制，對發(fā)掘抗旱的種質(zhì)材料具有重要意義。為此，以6個不同來源的毛花雀稗種質(zhì)為研究對象，采用盆栽干旱模擬試驗，研究不同種質(zhì)的生理適應(yīng)機(jī)制。但因不同種質(zhì)對逆境的反應(yīng)不同，其各項生理指標(biāo)變化亦不同，單一生理指標(biāo)無法準(zhǔn)確反應(yīng)出6個毛花雀稗種質(zhì)的抗性能力強(qiáng)弱，但多個生理指標(biāo)之間難免會有信息重疊，使用隸屬函數(shù)法對植物進(jìn)行綜合評價具有一定的局限性[14]，利用主成分分析法和隸屬函數(shù)法相結(jié)合，探討各種質(zhì)間的抗旱性強(qiáng)弱?！緮M解決的關(guān)鍵問題】篩選抗旱性較強(qiáng)的毛花雀稗種質(zhì)，為毛花雀稗抗旱型種質(zhì)的選育與推廣提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

毛花雀稗。6份種質(zhì)，其資源信息詳見表1，均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 材料預(yù)處理 ①種子處理。選擇均一、飽滿、無病蟲害的種子，依照國際種子檢驗規(guī)程[15]，將供試種子置于鋪有雙層濾紙的培養(yǎng)皿中發(fā)芽。②幼苗移栽。待幼苗長出后，移入由河沙∶蛭石∶腐殖質(zhì)土按體積1∶1∶1混勻的花盆中，放置溫室內(nèi)統(tǒng)一進(jìn)行日常管理。③栽培基質(zhì)處理。栽培基質(zhì)為腐殖質(zhì)土、自然土壤和蛭石(體積比1∶3∶1)的混合土壤。將基質(zhì)放入烘箱中100 ℃處理12 h，使土壤持水量保持均一，每盆裝5.0 kg混合基質(zhì)備用。

1.2.2 試驗設(shè)計 試驗根據(jù)毛花雀稗種質(zhì)設(shè)6個處理，即每個種質(zhì)1個處理。選取生長健壯，長勢均勻一致的不同種質(zhì)毛花雀稗幼苗分別移栽至裝有栽培基質(zhì)的塑料盆中，每盆定植1株，期間管理同田間管理一致。待植株適應(yīng)后，將基質(zhì)澆水至飽和持水量，以后不再澆水使其逐漸自然干旱，3次重復(fù)。

1.2.3 測定項目與方法 分別在干旱處理后的第0天(對照)、第7、14、21和28天采集健康的植物葉片測定丙二醛(MDA)、可溶性蛋白(SP)、可溶性糖(SS)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)、葉綠素a(Chl a)、葉綠素b(Chl b)和葉綠素a+b[Chl(a+b)]等生理指標(biāo)，3次重復(fù)。參照文獻(xiàn)[16-20]的方法，MDA含量采用硫代巴比妥酸法測定，SP含量采用考馬斯亮藍(lán)G-250法測定，SS含量采用蒽酮比色法測定，POD活性采用愈創(chuàng)木酚法測定，CAT活性采用紫外吸收法測定，Chl含量采用分光光度法測定。

表1 6個毛花雀稗種質(zhì)的資源信息

1.2.4 抗旱性綜合評價 采用主成分分析法對6個毛花雀稗種質(zhì)的MDA、SP、SS、POD、CAT、Chl a、Chl b和Chl(a+b)等生理指標(biāo)進(jìn)行主成分分析，按累積貢獻(xiàn)率≥85 %確定主成分個數(shù)；參照文獻(xiàn)[21-22]的方法，根據(jù)主成分分析結(jié)果計算主成分得分值、權(quán)重、隸屬函數(shù)及綜合評價分值。

Xi=∑[Ai·zi](i=1，2，3，…，n)

Wi=Pi/∑Pi(i=1，2，3，…，n)

U(xi)=(xi-ximin) / (ximax-ximin)

D=∑[U(xi) ·Wi](i=1，2，3，…，n)

式中：Ai，第i個毛花雀稗種質(zhì)的特征向量值；zi，第i個毛花雀稗種質(zhì)生理指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)化值；Wi，第i個主成分在所有主成分中的重要程度；Pi，各種質(zhì)第i個主成分的貢獻(xiàn)率；U(xi)，各種質(zhì)第i個主成分的隸屬函數(shù)值；xi，各種質(zhì)某一主成分得分值；ximax、ximin，所有參試種質(zhì)中第i個主成分的最大值與最小值；D，綜合抗旱性評分值。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)整理及制圖，采用SPSS 17.0進(jìn)行單因素方差分析和主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫下毛花雀稗主要生理指標(biāo)的變化

2.1.1 丙二醛(MDA)含量 6個毛花雀稗種質(zhì)葉片MDA含量均隨干旱時間的延長呈升高趨勢。0～21 d 時6個毛花雀稗種質(zhì)的MDA含量各階段均較初始階段顯著增加，但增幅較緩慢，其中，種質(zhì)No.1、No.2、No.4和No.5的增幅均較小。21～28 d時各種質(zhì)MDA含量急劇增加并達(dá)到峰值，其中，No.3和No.6的增幅較大，顯著高于前一階段的含量，分別為對照(第0天，下同)的23.18和17.93倍；No.1增幅最小，僅較對照增加5.50倍。第28天時MDA的含量為No.3>No.6>No.2>No.4>No.5>No.1，No.3和No.6的MDA含量均顯著高于其余4個種質(zhì)(圖1)。

2.1.2 過氧化物酶(POD)活性 6個毛花雀稗POD活性隨干旱程度增加呈先升后降趨勢。0～14 d時各種質(zhì)POD活性均顯著增加，并達(dá)到最大值，其中，No.1的增幅最大，為對照的1.75倍。隨干旱程度增強(qiáng)，14～28 d時各種質(zhì)的POD活性呈逐漸降低趨勢。第28天時各種質(zhì)的POD活性急劇下降至最小值，其中，No.3降幅最大且顯著低于其余5個種質(zhì)，較對照下降148.15 U/mg；No.1的降幅最小，較對照僅下降70.05 U/mg；No.2和No.5的POD活性均顯著高于其余4個種質(zhì)。

2.1.3 過氧化氫酶(CAT)活性 隨干旱時間延長各種質(zhì)CAT活性均呈先升后降趨勢。第14天時各種質(zhì)CAT活性均達(dá)峰值，其中，No.6的增幅最大，較對照增加5.87 U/mg；No.2的增幅最小，較對照僅增加1.91 U/mg。之后各種質(zhì)隨干旱時間的增加呈逐漸下降趨勢，第28天時No.6的降幅最大，較第14 天下降5.32 U/mg；No.4的降幅最小，較第14天下降1.32 U/mg；第28天時No.4的CAT活性顯著高于其余5個種質(zhì)。

2.1.4 可溶性蛋白質(zhì)(SP)含量 6個毛花雀稗種質(zhì)SP含量隨干旱脅迫時間的延長呈先升后降趨勢。No.6在干旱脅迫第7天時SP含量達(dá)到峰值，其余5個種質(zhì)則均在干旱脅迫第14天達(dá)到峰值；其中，No.1和No.2的增幅較大，分別較對照增加0.77和0.69 g/mL。之后各種質(zhì)SP含量呈下降趨勢，第28天時僅No.5和No.6的SP含量低于對照，二者分別較對照下降0.07和0.38 g/mL；但No.5與No.2和No.3差異不顯著，No.6的SP含量顯著低于其余種質(zhì)。

2.1.5 可溶性糖(SS)含量 隨干旱脅迫程度增強(qiáng)，6個毛花雀稗種質(zhì)SS含量總體呈顯著增加趨勢，均于第28天時達(dá)到峰值。其中，No.1、No.4和No.6的SS含量均顯著高于其余3個種質(zhì)，與對照相比較對照增加23.41、25.70和22.08 mg/g；No.5的SS含量最小，較對照僅增加15.71 mg/g。

2.1.6 葉綠素(Chl)含量 6個毛花雀稗種質(zhì)的Chl a、Chl b及Chl(a+b)含量均隨干旱程度增強(qiáng)呈顯著降低趨勢。第28天時No.2的Chl a含量降幅最大，較對照下降3.14 mg/g；No.5的Chl b含量降幅最大，并均顯著低于其余5個種質(zhì)，較對照下降0.97 mg/g；No.2的Chl(a+b)含量降幅最大，但與No.1、No.3和No.5差異不顯著，與No.4和No.6差異顯著，較對照下降2.70 mg/g；No.6的Chl a、Chl b和Chl(a+b)含量降幅最小，并顯著高于其他種質(zhì)，與對照相比Chl a、Chl b和Chl(a+b)分別下降1.46、0.70和1.67 mg/g，表明，其受干旱影響較小。

2.2 毛花雀稗抗旱性綜合評價

從表2看出，主成分1、2和3解釋的方差分別占總方差的42.834 %、34.980 %和14.827 %，累積貢獻(xiàn)率達(dá)92.641 %，能有效地解釋干旱脅迫下毛花雀稗種質(zhì)的生理響應(yīng)，因此，可以用前3個主成分代替上述8個生理指標(biāo)對毛花雀稗種質(zhì)的抗旱性進(jìn)行綜合評價。主成分中各指標(biāo)的特征向量代表單項指標(biāo)對主成分的貢獻(xiàn)度大小。第一主分中SP的特征向量最大、Chl b與Chl(a+b)次之，這些指標(biāo)主要與滲透調(diào)節(jié)和光合作用有關(guān)，因此，第一主分稱為滲透調(diào)節(jié)和光合作用因子。第二主分中CAT的特征向量最大，Chl a次之，CAT主要與清除膜脂質(zhì)過氧化物產(chǎn)物有關(guān)，葉綠素a主要與光合作用有關(guān)，因此，第二主分稱為抗氧化與光合作用因子。第三主分中SS的特征向量最大，SS屬于滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，因此，第三主分稱為滲透調(diào)節(jié)因子。經(jīng)計算得出3個主成分的權(quán)重分別為0.462、0.378和0.160。從表3看出，美國種質(zhì)的抗旱性最強(qiáng)，其綜合抗旱性D值為2.00；其次為貴州安龍(草坡)種質(zhì)，D值為1.73；越南種質(zhì)的抗旱性最弱，D值為-0.29；其他種質(zhì)D值為0.78～1.34，抗旱性居中。

圖中不同小寫字母表示同一種質(zhì)不同時期的差異顯著(P<0.05)；不同大寫字母表示不同種質(zhì)在第28天時的差異顯著(P<0.05)Different capital and lowercase letters in the figures indicate significance of difference at 1 % and 5 % levels respectively圖1 干旱脅迫6個毛花雀稗種質(zhì)主要生理指標(biāo)的變化Fig.1 Variation of MDA，soluble protein，POD and CAT activity under drought stress

表2 干旱脅迫6個毛花雀稗種質(zhì)各生理指標(biāo)的主成分分析

表3 6個毛花雀稗種質(zhì)抗旱性的隸屬函數(shù)分析

3 討 論

植物在干旱脅迫下體內(nèi)過氧化物質(zhì)O2-和H2O2等增加，使膜脂過氧化，其中主要產(chǎn)物MDA積累量的高低是反映植物細(xì)胞膜在逆境條件下受傷害程度及過氧化程度的重要指標(biāo)[23-24]。前人對柳枝稷(Panicumvirgatum)[25]、大花飛燕草(Delphiniumgrandiflorum)[26]和冰草(Agropyroncristatum)[27]等植物的研究表明，隨干旱時間的延長MDA含量逐漸增加，其含量與植物抗旱能力呈反比。研究結(jié)果表明，隨干旱時間的增加，6個毛花雀稗種質(zhì)MDA含量均表現(xiàn)為0～21 d緩慢增加，在第28天迅速積累到最大值，表明，此時植物保護(hù)酶系統(tǒng)崩潰，植物體內(nèi)產(chǎn)生的過氧化物質(zhì)不再被清除，細(xì)胞膜過氧化程度加劇、受損嚴(yán)重，導(dǎo)致MDA含量驟然升高。6個毛花雀稗種質(zhì)中，美國種質(zhì)的MDA含量最低，越南、貴州湄潭種質(zhì)的MDA含量較高。表明，逆境下美國種質(zhì)的細(xì)胞膜膜脂過氧化程度小，有較強(qiáng)的抗旱能力；相反越南種質(zhì)、貴州湄潭種質(zhì)的細(xì)胞膜膜脂過氧化程度大，抗旱能力較弱。

POD和CAT是植物清除活性氧的2種重要保護(hù)酶，具有消除自由基和降低膜脂過氧化的功能，且能較好的反應(yīng)植物對逆境的適應(yīng)能力[28]。研究結(jié)果表明，隨干旱時間的延長，6個毛花雀稗種質(zhì)的POD和CAT酶活性對干旱脅迫的響應(yīng)基本相同，均呈先升后降趨勢，與謝小玉等[29]對辣椒開花結(jié)果期保護(hù)酶系統(tǒng)的研究結(jié)果相似，表明，毛花雀稗在干旱脅迫前期(7 d)和中期(14 d)能夠及時啟動保護(hù)酶系統(tǒng)進(jìn)而有效地清除植物體內(nèi)的過氧化物，這是毛花雀稗對環(huán)境脅迫的一種適應(yīng)性反應(yīng)。但隨著干旱時間的延長，毛花雀稗體內(nèi)保護(hù)酶系統(tǒng)受損，POD與CAT活性逐漸降低，過氧化物質(zhì)的產(chǎn)生與清除失衡。在28 d時POD活性急劇下降達(dá)到最低值，表明，此時POD對過氧化物質(zhì)的清除能力最弱，這可能是導(dǎo)致MDA含量在干旱第28天時迅速積累到最大值的原因；其中，越南種質(zhì)的POD活性降幅最大，且顯著低于其余5個種質(zhì)，表明，越南種質(zhì)的抗氧化酶系統(tǒng)受損嚴(yán)重。

植物體內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)(SS和SP)的積累是植物響應(yīng)外界環(huán)境脅迫最常見的反應(yīng)之一，這些物質(zhì)的積累能維持植體內(nèi)滲透勢的穩(wěn)定，保證植物體內(nèi)正常代謝活動的進(jìn)行[30]。SP含量是反應(yīng)植物體內(nèi)蛋白質(zhì)合成及降解等多方面信息的重要指標(biāo)[31-32]。研究結(jié)果表明，隨干旱時間的延長各毛花雀稗種質(zhì)的SP含量總體呈先增后減趨勢，可能是在干旱脅迫前期(0～7 d)和中期(7～14 d)，植物為了適應(yīng)逆境環(huán)境誘導(dǎo)抗逆蛋白合成，以維持植物細(xì)胞內(nèi)的滲透勢穩(wěn)定，保證植物代謝的正常進(jìn)行；脅迫后期(14～21 d)和末期(21～28 d)植物的SP含量達(dá)到峰值后隨之降低，可能是隨時間的延長，干旱程度逐漸加重，植物體內(nèi)的SP合成速度逐漸減弱，而降解速度逐漸增快[31]所致；SS可使植物細(xì)胞脫水后保持其基本結(jié)構(gòu)，減少植物在干旱脅迫下受到的損害，提高植物的抗逆性[33-34]。研究結(jié)果表明，隨干旱脅迫時間的延長，6個毛花雀稗種質(zhì)SS含量均呈顯著增加趨勢。即逆境脅迫下，植物可通過增加SS的含量維持植物體內(nèi)的滲透勢穩(wěn)定，減少逆境對植物造成的損害。與崔婷茹等[35]對狼尾草(Pennisetumalopecuroides)的SS含量研究結(jié)果一致。在第28天時，美國種質(zhì)的SP和SS含量最高，表明，種質(zhì)美國種質(zhì)的滲透勢較其他種質(zhì)穩(wěn)定。

植物光合能力的強(qiáng)弱依賴于植物葉片中Chl含量的高低，Chl含量隨著葉組織水分的下降而減少，因此干旱脅迫下Chl含量的變化不僅可以反映植物對水分脅迫的敏感性還能體現(xiàn)植物抵御逆境脅迫的能力，抗性越強(qiáng)的植物在干旱脅迫條件下其Chl含量下降幅度越小[36-38]。研究結(jié)果表明，Chl a、Chl b和Chl(a+b)含量隨干旱脅迫的加劇均呈顯著下降趨勢，可能是干旱脅迫引起植物葉片失水，影響Chl的生物合成或使已合成的Chl分解，致使植物葉片Chl含量隨之降低。但不同種質(zhì)的降幅不同，6個毛花雀稗種質(zhì)中貴州湄潭種質(zhì)的Chl a、Chl b和Chl(a+b)含量的降幅最小，表明，干旱脅迫下貴州湄潭種質(zhì)對水分脅迫敏感性較弱，即抗旱性較強(qiáng)。與MIN-WHA等[39]對朵麗蝶蘭(Doritaenopsishybrid)Chl含量變化的研究結(jié)果相同。

4 結(jié) 論

為全面、準(zhǔn)確地掌握6個毛花雀稗材料的抗旱性，該研究利用主成分分析法和隸屬函數(shù)法相結(jié)合，主成分分析將有內(nèi)在聯(lián)系的8個生理指標(biāo)轉(zhuǎn)換為3個新的彼此獨(dú)立的綜合指標(biāo)，克服了信息重疊與指標(biāo)的相關(guān)性，不僅避免單一指標(biāo)的片面性，又能在多指標(biāo)的基礎(chǔ)上對6個毛花雀稗種質(zhì)進(jìn)行隸屬函數(shù)綜合評價。根據(jù)綜合抗旱性D值得出，美國種質(zhì)抗旱性最強(qiáng)，其次為貴州安龍(草坡)種質(zhì)，而越南種質(zhì)抗旱性最弱，貴州湄潭、貴州安龍(河谷)和貴州獨(dú)山種質(zhì)等3個種質(zhì)的抗旱性居中。因此，在毛花雀稗抗旱性牧草種質(zhì)的選育與推廣中，應(yīng)優(yōu)先選擇抗旱性較強(qiáng)的美國種質(zhì)。