奶牛源金黃色葡萄球菌新疆分離株生物被膜、腸毒素基因與毒力的檢測及其相關(guān)性分析

伍曄暉，孟慶玲，喬 軍*，李 靜，蔡擴軍，王登峰，才學(xué)鵬

(1.石河子大學(xué)動物科技學(xué)院， 新疆 石河子 832003； 2. 烏魯木齊市動物疾病控制與診斷中心，新疆 烏魯木齊 830063；3. 新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所，新疆 烏魯木齊 830000； 4. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，甘肅 蘭州 730046)

【研究意義】金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)在獸醫(yī)臨床上可引發(fā)奶牛乳房炎及子宮內(nèi)膜炎等多種疾病，嚴重危害奶牛養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展[1-2]?！厩叭搜芯窟M展】S.aureus侵染宿主后，可產(chǎn)生多種毒力因子并形成生物被膜(biofilm，BF)，使宿主的免疫系統(tǒng)受到抑制，并導(dǎo)致細菌對抗生素的耐受性增強，造成持續(xù)性感染[3]。同時，牛乳中含有的S.aureus及其分泌的毒素可引起人的感染或嚴重的食物中毒，在細菌性食物中毒事件所占比例高達33 %～50 %[4-5]?！颈狙芯壳腥朦c】研究發(fā)現(xiàn)，S.aureus產(chǎn)生的腸毒素是其重要的毒力因子，在其感染和定殖過程中發(fā)揮重要的作用。腸毒素是一種具有超抗原活性且高度耐熱的外毒素，它是引發(fā)食物中毒及食源性疾病的主要毒力因子[7]。目前，已發(fā)現(xiàn)的腸毒素包括傳統(tǒng)型腸毒素(sea～see)和新型腸毒素(seg～seu)。在傳統(tǒng)型腸毒素中，sea和seb是引起食物中毒較常見的腸毒素[8]。此外，S.aureus形成的BF可抵抗化學(xué)藥物和宿主防御系統(tǒng)，與細菌的耐藥性和致病性密切相關(guān)?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究通過對164株S.aureus新疆分離株進行BF形成能力、腸毒素基因sea～seo分布及半數(shù)致死量(LD50)的檢測，旨在了解奶牛源S.aureus腸毒素基因的分布特征和致病特性，為研究分析S.aureusBF形成能力與其毒力之間的相關(guān)性奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 受試菌株

在2015-2018年期間，從新疆部分地區(qū)奶牛場采集乳房炎牛乳(276份)和子宮內(nèi)膜炎(110份)樣品共計386份，先通過選擇性分離培養(yǎng)基初步篩選，再進行生化試驗鑒定，最后進行16SrRNA序列比對分析得到S.aureus臨床分離株164株。

1.2 主要試劑

Baird-Parker培養(yǎng)基、甘露醇高鹽瓊脂、腦心浸出液肉湯(BHI)、胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)均購自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；科瑪嘉金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基購自CHRO Magar 公司；細菌基因組DNA提取試劑盒、DNA Marker 2000、pMD19-T載體均購自TaKaRa公司；結(jié)晶紫購自天津市北聯(lián)精細化學(xué)品開發(fā)有限公司。

1.3 奶牛源S. aureus臨床分離株生物被膜形成能力的測定

采用結(jié)晶紫半定量黏附實驗(microtiter plate assay，MPA)進行奶牛源S.aureus臨床分離株生物被膜形成能力的測定。用無菌接種環(huán)挑取單個菌落，接種于TSB培養(yǎng)基中，振蕩過夜。將活化的菌液以1∶100的比例轉(zhuǎn)接于TSB肉湯中繼續(xù)培養(yǎng)，在OD600nm≈0.2時吸取菌液200 μl加入到96孔微孔板中，靜置于37 ℃培養(yǎng)24 h，參照文獻[9]用酶標儀測定其A570nm值。將測定結(jié)果轉(zhuǎn)換成cut-out值：ODC=OD(陰性對照)+3×SD(陰性對照)；待檢孔OD值=OD平均-ODC。將菌株生物被膜形成能力分為4類：①OD≤ODC=無生物被膜產(chǎn)生(-，BF-)；②ODC

1.4 S. aureus分離株腸毒素基因檢測

將S.aureus流行株接種至無菌BHI培養(yǎng)液于37 ℃振蕩過夜，取1.5 mL細菌培養(yǎng)液于無菌EP管內(nèi)，12 000 r/min離心1 min，棄上清液，用細菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株基因組DNA，通過 PCR 方法對sea～see和seg～seo等基因進行擴增，各基因引物序列及PCR反應(yīng)體系參考文獻[6]。引物由北京華大基因公司合成，腸毒素基因經(jīng)PCR擴增后，用2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 不同BF形成能力菌株菌液的制備

選擇8株生物被膜形成能力不同的S.aureus分離菌株，菌株編號分別為：3、49(BF3+)；A2、73(BF2+)；A1、90(BF+)；45、91 (BF-)，將S.aureus流行株接種至20 mL無菌BHI培養(yǎng)液于37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)12 h，根據(jù)生長曲線的A600nm適當調(diào)整菌液濃度，參照GB4789.2-2010進行活菌計數(shù)，計算實際感染菌量。

1.6 不同BF形成能力菌株半數(shù)致死量(LD50)的測定

參照預(yù)試驗結(jié)果將18～22 g昆明系小鼠隨機分成8組，每組分為5個梯度，每個梯度5只，分別給不同組別小鼠腹腔注射500 μl CFU等差菌液，感染后每4 h觀察1次小鼠精神狀態(tài)及外觀體況，連續(xù)7 d后統(tǒng)計各組小鼠的死亡情況，利用改良寇氏法計算不同BF形成強度菌株對昆明系小鼠的半數(shù)致死量(LD50)。計算公式：logLD50= [Xm-i(∑P-0.5)]，其中Xm為最大劑量的對數(shù)；P為各組動物的死亡率(以小數(shù)表示)；∑P為各組動物死亡率的總和(P1+P2+P3……)；i為組間距(相鄰兩組對數(shù)劑量的差值)。

1.7 不同BF形成能力菌株感染小鼠臟器病理組織學(xué)觀察

剖殺感染小鼠，觀察其組織器官的病理變化；無菌取病死鼠的組織器官涂片、觸片，革蘭染色鏡檢，并以S.aureus特異性引物作PCR鑒定。試驗結(jié)束時，撲殺試驗組(BF3+、BF-)剩余小鼠，無菌條件下取試驗組及對照組小鼠的肝、脾、肺、腎和小腸等組織器宮，將同組小鼠器官各取一小塊置于1.5 mL滅菌EP管中用于測定組織器官的載菌量。取剩余組織塊，用4 %甲醛溶液固定，制備組織切片，HE染色后觀察病理組織學(xué)變化。

表1 164株金黃色葡萄球菌生物膜形成能力的測定

1.8 不同BF形成能力菌株人工感染小鼠組織器官載菌量分析

無菌取病死鼠的肝、脾、肺、腎和小腸等組織器官，用微量電子天平稱量裝有組織塊的EP管重量m1，向管內(nèi)加入200 μl生理鹽水，用電子組織勻漿器充分研磨后進行10倍梯度稀釋，稱量空EP管重量m2，將各濃度組織勻漿液吸取200 μl接種于甘露醇高鹽瓊脂，37 ℃孵育48 h，記培養(yǎng)基表面菌落數(shù)為n，載菌量=n/(m2-m1)。

2 結(jié)果與分析

2.1 S. aureus分離株生物被膜形成能力檢測

采用MPA 試驗對164株S.aureus流行株進行BF形成能力進行檢測分析，OD570nm檢測證實BF-菌株有23株(13.6 %)，形成BF陽性菌株有141株(83.4 %)；其中BF+菌株有69株(40.8 %)， BF2+菌株有38株(22.5 %)，BF3+菌株有34株(20.1 %，表1) 。

2.2 S. aureus分離株攜帶腸毒素基因的檢測

不同分離株腸毒素檢測結(jié)果(圖1)顯示，在164株S.aureus中檢測到腸毒素基因(sea～seu)流行率為96.3 %，其中以新型腸毒素seg基因檢出率最高為81.1 %，sek和sej基因檢出率分別為76.8 %和57.3 %；傳統(tǒng)型腸毒素基因(sea～see)的檢出率為62.8 %，其中see基因檢出率最高(57.3 %)；傳統(tǒng)腸毒素和新型腸毒素分別以sed(8.5 %)和sel基因(20.7 %)檢出率最低。從不同BF形成能力菌株所攜帶腸毒素基因情況的結(jié)果顯示(圖2)，浮游菌BF形成能力與腸毒素檢出率之間無明顯相關(guān)性。

圖A中：M.DNA Marker 2000； 1. sea基因(287 bp) 2. seb基因(213 bp)； 3. sec:基因(454 bp)； 4. sed基因(152 bp) 5. see基因(293 bp)。圖B中：M.DNA Marker 2000； 1. seg基因(287 bp) ；2. seh基因(213 bp);3. sei基因(454 bp);4. sek基因(293 bp);5. sej基因(152 bp);6. sel基因(383 bp);7.sem基因(379 bp);8. sen基因(282bp);9. seo基因(214 bp)圖1 S. aureus檢測腸毒素基因檢測結(jié)果Fig.1 Detection of enterotoxin genes in S. aureus isolate

圖2 S. aureus腸毒素基因在不同BF形成能力菌株中陽性分布結(jié)果Fig.2 Positive distribution results of S. aureus enterotoxin gene in different BF forming strains

2.3 不同BF形成能力菌株LD50的測定

BF形成能力不同的4組菌株 (BF3+：3、49； BF2+：A1、90； BF+：A2、73；BF-：45、91)，BF3+菌株與BF+菌株、BF-菌株之間毒力均差異顯著(P<0.05)，BF3+菌株LD50值大，提示BF3+菌株毒力較弱(圖3)。

2.4 不同BF形成能力菌株感染小鼠的病理學(xué)變化

病鼠各組織器官出現(xiàn)廣泛病變，肝臟淤血、腫大；脾臟腫大、壞死，在表面和切面上可見多個大小不等的壞死灶；肺淤血、腫大，表面有膿腫；腎臟腫大、色淡；胃粘膜表面出現(xiàn)膿性潰瘍灶；腸系膜及漿膜小血管擴張、充血并伴有炎性滲出。對照組小鼠肉眼未見異常病變(圖4)。

2.5 不同BF形成能力菌株感染小鼠的病理組織學(xué)觀察

剖檢死亡小鼠，取小鼠肝臟及腎臟的勻漿液接種于Baird-Parker平板上，均能分離出S.aureus，菌落周圍有渾濁帶；以特異性引物16SrRNA進行PCR檢測結(jié)果均為陽性。肝臟：肝細胞發(fā)生顆粒變性、水泡變性，肝小葉界限不清，中央靜脈擴張、肝匯管區(qū)小靜脈淤血；脾臟：淤血，紅、白髓界限不清，紅髓有多量的紅細胞滲出，脾小體減少且萎縮；肺臟：淤血，肺間質(zhì)血管周圍水腫和出血，漿細胞和淋巴細胞浸潤；腎臟：腎小球擴張，腎小管上皮細胞變性，間質(zhì)血管擴張，漿細胞和淋巴細胞浸潤。小腸：腸黏膜脫落，腸腺細胞水腫，腸腔內(nèi)有藍染網(wǎng)狀物，黏膜層的部分腸腺內(nèi)有多量大小不一紅染圓形顆粒物(圖5)。

圖3 BF形成能力不同S. aureus的LD50Fig.3 Biofilm-formation ability of different S. aureus LD50 in Kunming mice

2.6 不同BF形成能力菌株感染小鼠的組織器官載菌量分析

BF-菌株對小鼠肝、脾、肺、腎和小腸的組織器官的侵襲力強于BF3+菌株(P<0.05)；載菌量最大的臟器為腎臟(3.73±2.36～3.50±1.84)，肝臟載菌量較低(1.15±0.21～0.99±0.23，表2)。

3 討 論

BF是細菌為了適應(yīng)應(yīng)激環(huán)境而形成的一種具有特殊結(jié)構(gòu)的細菌聚集膜狀物[10]。與浮游狀態(tài)相比，生物被膜狀態(tài)下同種細菌對抗生素的耐受性可提高100～1000倍，且可抵抗宿主對其的吞噬作用[11-12]，因此探討B(tài)F形成能力差異菌株的基因及致病性具有重要意義。本研究中164株S.aureus有141株為MPA陽性，BF形成率為83.4 %，證實奶牛源S.aureus流行株具有普遍的BF形成能力，且以弱BF形成菌株為主。

S.aureus腸毒素(SEs)是一種外源性超抗原，它能激活大量產(chǎn)生促炎細胞因子和趨化因子，可導(dǎo)致發(fā)熱、低血壓和休克[6, 13]，因此是食品生產(chǎn)中的重點監(jiān)測對象。本研究通過PCR方法對臨床分離的S.aureus腸毒素毒力基因檢測結(jié)果顯示，腸毒素基因(sea～seu)流行率為96.3 %，其中以新型腸毒素seg基因檢出率(81.1 %)最高；傳統(tǒng)型腸毒素基因(sea～see)的檢出率為62.8 %，其中以see基因檢出率(57.3 %)最高；傳統(tǒng)型腸毒素和新型腸毒素分別以sed和sel基因檢出率最低，分別為8.5 %和20.7 %。汪永碌等[14]從食物中毒和食物樣品中分離出S.aureus的腸毒素基因(sea～sej)檢出率為68.6 %，傳統(tǒng)型腸毒素基因(sea～see)檢出率為 88.5 %，其中以seb檢出率最高；Wang等[15]對中國寧夏地區(qū)奶牛乳房炎牛奶樣品中分離出的S.aureus進行腸毒素基因(sea～seu)檢測，結(jié)果顯示71.4 %的分離株至少攜帶一種腸毒素基因，其中sei和sen檢出率最高(44.0 %)。Nazari等[16]研究發(fā)現(xiàn)sea、seb基因及新型腸毒素基因seg、seh是牛奶中S.aureus檢出率最高的腸毒素基因。上述研究提示不同地區(qū)S.aureus分離株腸毒素基因的分布具有地域多樣性。本研究將S.aureus流行株以不同BF形成能力進行分組檢測，腸毒素基因檢出率無明顯的差異，提示S.aureus攜帶腸毒素基因與其BF形成能力無直接的相關(guān)性。

從左向右依次為BF-、BF3+及對照組From left to right, the order is BF-, BF3+ and the control group圖4 小鼠腎、肺、肝和脾的病理學(xué)變化Fig.4 Pathological changes in kidneys, lungs, liver and spleen of mice with S. aureus

圖5 小鼠肺，脾，肝和腎的代表性組織病理學(xué)特征Fig.5 Representative histopathological features in lungs, spleen, liver and kidneys of mice with S. aureus

表2 BF3+、BF-菌株接種小鼠各臟器臟器載菌量的比較(±s)

S.aureus在體內(nèi)環(huán)境中可形成BF抵抗宿主的免疫反應(yīng)；在有利條件下又可浮游菌形式感染宿主，造成S.aureus持續(xù)性感染[17-19]。本研究對比了8株BF形成能力不同S.aureus的LD50，結(jié)果顯示BF3+菌株毒力弱，而BF+菌株及BF-菌株毒力強；且BF-菌株對臟器的侵襲力強于BF3+菌株。研究結(jié)果與陳傳榮等[20]對不同BF形成能力致病性大腸桿菌的毒力強弱結(jié)論相似。有研究報道，細菌形成BF可影響浮游菌毒力因子的釋放，這可能是細菌毒力減弱的原因之一[21]。Li 等[22]對比了銅綠假單胞菌BF菌與浮游菌毒力差異，結(jié)果顯示BF菌株毒力基因表達低于浮游菌近30倍，且bdIA缺失株致病性在慢性感染中毒力更強，而在急性感染中毒力較弱[23]。因此，S.aureus形成BF后毒力會發(fā)生改變可能與細菌逃避免疫的適應(yīng)性調(diào)節(jié)機制相關(guān)[22]。

4 結(jié) 論

本研究證實，新疆地區(qū)奶牛源S.aureusBF形成率高，且腸毒素基因檢出率較高，其中以新型腸毒素基因seg檢出率最高，提示新型腸毒素seg基因是奶牛源S.aureus新疆分離株的重要分子特征。S.aureus浮游菌株BF形成能力與腸毒素檢出率之間無明顯相關(guān)性，但隨著生物被膜形成能力的增強，LD50相應(yīng)增大。由于BF的存在是治療S.aureus性奶牛乳房炎及子宮內(nèi)膜炎面臨的一大難題，因此S.aureusBF在致病性上發(fā)揮的作用以及與毒力之間的內(nèi)在關(guān)系值得深入分析。