山藥清炒炮制前后物料性質(zhì)及成分含量測(cè)定

陳天朝 賈晴晴 李瑞穎 馬彥江 王嬌 程思卿

摘要：目的? 探究清炒炮制對(duì)山藥物性參數(shù)、主要成分及指標(biāo)性成分動(dòng)態(tài)變化的影響。方法? 以山藥清炒炮制品為研究對(duì)象，測(cè)定物性參數(shù)，采用紫外分光光度法及HPLC測(cè)定不同炮制品中淀粉、多糖及尿囊素含量，運(yùn)用SPSS22.0軟件對(duì)清炒工藝、物性參數(shù)及主要成分含量進(jìn)行差異性及相關(guān)性分析。結(jié)果? 山藥不同清炒炮制品物性參數(shù)有顯著差異（P<0.05），氧化值與總淀粉含量呈顯著負(fù)相關(guān)，吸水率與多糖含量呈顯著正相關(guān);清炒炮制后山藥總淀粉含量降低，多糖含量升高，尿囊素消失，有新物質(zhì)產(chǎn)生。結(jié)論? 山藥清炒炮制后物料性質(zhì)、主要成分、指標(biāo)性成分變化顯著;清炒工藝、物性參數(shù)與主要成分間相互影響;指標(biāo)性成分尿囊素與新物質(zhì)、淀粉與多糖之間可能存在相互轉(zhuǎn)化。

關(guān)鍵詞：山藥;清炒炮制;物料性質(zhì);含量測(cè)定;相關(guān)性

中圖分類號(hào)：R283.1? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? 文章編號(hào)：1005-5304（2019）04-0091-05

山藥始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，生用以滋陰為主，補(bǔ)脾多炒用。山藥主要含有大分子及小分子兩類化學(xué)成分，大分子成分以淀粉、多糖為主，小分子成分以

尿囊素等為主[1]。山藥炮制方法主要有麩炒、清炒、土炒及膨化法等[2]，其中清炒法是最直接的加熱處理工藝，包括炒黃、炒焦及炒炭。目前對(duì)山藥飲片的炮制多憑形態(tài)、色澤、質(zhì)地及氣味等傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)判斷，有明顯的主觀性和隨意性，難以保證炮制品質(zhì)量的穩(wěn)定性[3]。中藥經(jīng)清炒炮制后內(nèi)部分子結(jié)構(gòu)產(chǎn)生變化[4]，其化學(xué)成分、性味、藥理作用和功能主治等均發(fā)生不同程度改變，而物理化學(xué)性質(zhì)是飲片性狀鑒別中反映形、色、氣、味、質(zhì)等的內(nèi)在因素，在對(duì)同一中藥不同炮制品炮制程度及質(zhì)量的衡量中尤為重要。本研究制備山藥清炒炮制品并對(duì)炮制前后物性參數(shù)[5-6]及成分含量進(jìn)行測(cè)定，從大分子及小分子層面探討清炒炮制對(duì)山藥性質(zhì)的影響，為山藥清炒工藝自動(dòng)化、炮制品鑒別和臨床應(yīng)用等提供基礎(chǔ)及依據(jù)。

1? 儀器與試藥

UliMate3000高效液相色譜儀（美國(guó)賽默飛公司），Thermo Evolution 201紫外可見光分光光度計(jì)（美國(guó)賽默飛公司），BSA224S-CW電子天平（德國(guó)賽多利斯公司），LXJ-ⅡB飛鴿臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠），GZX-9146MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠），F(xiàn)W-500高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（北京科偉永興儀器有限公司）。

山藥生品（河南中一公司，批號(hào)1710201）;直鏈淀粉對(duì)照品（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)J11D8N50350），支鏈淀粉對(duì)照品（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)K01DY49573），D（+）-無(wú)水葡萄糖（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)S08J6G1），尿囊素對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)111501- 200202，純度≥98%），正丁醇（分析純，天津市永大化學(xué)有限公司），乙腈（色譜純，Sigma試劑有限公司）。

2? 方法與結(jié)果

2.1? 山藥不同炮制品的制備

采用多層次試驗(yàn)設(shè)計(jì)法，以烘箱加熱炮制，并邀請(qǐng)朱清山（河南省非物質(zhì)文化遺產(chǎn)傳承人，國(guó)家級(jí)老藥工）、陳天朝（河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，主任藥師）、王宏賢（河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，副主任藥師）等經(jīng)驗(yàn)豐富的河南省炮制專家進(jìn)行德爾菲評(píng)價(jià)及鑒定，確定山藥炒黃、炒焦、炒炭最佳炮制工藝，結(jié)果見表1。基于優(yōu)選工藝并參考2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》（四部）0213炮制通則中炒黃、炒焦、炒炭相關(guān)項(xiàng)下要求，制備炒山藥、焦山藥、山藥炭標(biāo)準(zhǔn)飲片。

2.2? 物性參數(shù)確定

物性是指物質(zhì)固有的物理和化學(xué)屬性，可通過(guò)形、色、氣、味、質(zhì)對(duì)中藥物料進(jìn)行評(píng)價(jià)。美拉德反應(yīng)表明，中藥飲片炮制過(guò)程中伴隨著氧化值的變化[7-8]，而中藥物料的內(nèi)部結(jié)構(gòu)、對(duì)水中氫離子電離作用、氣味、成分等也發(fā)生不同程度改變。故綜合選擇吸水率、pH值、氧化值、膨脹度[9]作為山藥的物性參數(shù)，考察清炒炮制對(duì)物性指標(biāo)的影響，形成山藥物料性質(zhì)的數(shù)字化表征。

2.2.1? 物料的制備

分別稱取適量山藥、炒山藥、焦山藥、山藥炭標(biāo)準(zhǔn)飲片，干燥粉碎，過(guò)5號(hào)篩，備用。

2.2.2? 氧化值測(cè)定

精密稱定約1.00 g物料細(xì)粉（記為M1），置于500 mL圓底燒瓶中，加水混勻，蒸餾，收集餾分。移取蒸餾液于滴定瓶?jī)?nèi)（記為V），加入硫酸5 mL和0.002 mol/L高錳酸鉀溶液10 mL，振蕩均勻。加10%碘化鉀溶液5 mL，滴加0.02 mol/L硫代硫酸鈉（Na2S2O3）標(biāo)準(zhǔn)溶液，當(dāng)溶液顏色由深黃變?yōu)闇\黃色時(shí)，加淀粉指示劑1 mL，繼續(xù)滴加Na2S2O3標(biāo)準(zhǔn)溶液至無(wú)色，記錄消耗Na2S2O3標(biāo)準(zhǔn)溶液體積（A，mL）。另以物料細(xì)粉相同質(zhì)量的水代替樣品重復(fù)上述操作，進(jìn)行空白試驗(yàn)，記錄消耗Na2S2O3標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積（B，mL）。氧化值=（B-A）×0.02×200÷（5×0.002×V×M1）。

2.2.3? 吸水率測(cè)定

將濾紙放入漏斗內(nèi)，置于盛有純化水的恒溫恒濕干燥器內(nèi)飽和，靜置，稱定質(zhì)量（記為M2），精密稱取約1.00 g物料細(xì)粉（記為M0），置于濾紙中，加入適量純化水，靜置，過(guò)濾，同法準(zhǔn)確稱定物料細(xì)粉濾紙質(zhì)量（記為M3）。平行測(cè)定3次，計(jì)算平均值。吸水率=（M3-M2）÷M0。

2.2.4? pH值測(cè)定

精密稱取1.00 g物料細(xì)粉，加水100 mL，室溫浸泡60 min，取濾液，測(cè)定pH值，平行測(cè)定3份，取其平均值。

2.2.5? 膨脹度測(cè)定

參照2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》（四部）通則2101膨脹度測(cè)定法，平行測(cè)定3份，計(jì)算平均值。膨脹度=物料細(xì)粉膨脹后體積÷物料細(xì)粉質(zhì)量。

2.2.6? 物性參數(shù)測(cè)定結(jié)果

山藥不同清炒炮制品物料的氧化值、吸水率、pH值、膨脹度測(cè)定結(jié)果見表2。

2.3? 主要成分測(cè)定

山藥的大分子成分主要包括淀粉和多糖。采用雙波長(zhǎng)法[10]檢測(cè)不同炮制品中直鏈淀粉、支鏈淀粉含量，采用苯酚-硫酸顯色法[11-12]測(cè)定多糖含量。

2.3.1? 直鏈淀粉、支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線

采用作圖法確定直鏈淀粉的測(cè)定波長(zhǎng)、參比波長(zhǎng)分別為604、468 nm，支鏈淀粉的測(cè)定波長(zhǎng)、參比波長(zhǎng)分別為537、718 nm。直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=0.004 5X-0.008 7（r=0.999 2），表明直鏈淀粉在20～90 ?g/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系;支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=0.002 8X+0.005 5（r?=0.998 8），表明支鏈淀粉在0～200 ?g/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.3.2? 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=79.183X-0.016 3（r2=0.998 7），在0.002 8～0.011 5 mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.3.3? 含量測(cè)定結(jié)果

稱取適量“2.2.1”項(xiàng)下山藥炮制品物料細(xì)粉，按上述方法分別測(cè)定直鏈淀粉、支鏈淀粉及多糖含量，結(jié)果見表3。

2.4? 尿囊素含量測(cè)定

2.4.1? 色譜條件

采用Agilent ZORBAX SB-Aq色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）;流動(dòng)相為甲醇-水（體積比1∶99）;流速：0.5 mL/min;柱溫：30 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng)：224 nm;進(jìn)樣量：10 μL。理論塔板數(shù)以尿囊素計(jì)不低于5000。

2.4.2? 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取尿囊素對(duì)照品10.00 mg，置25 mL量瓶中，加20%乙醇定容至刻度，搖勻，即得。

2.4.3? 供試品溶液的制備

精密稱定山藥及炮制品細(xì)粉各1.0 g，置50 mL容量瓶中，加20%乙醇溶解稀釋至刻度，超聲處理（功率250 W，頻率50 kHz）30 min，3000 r/min離心20 min，過(guò)濾，即得。

2.4.4? 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

依次取0.25、0.5、1、1.5、2、2.5、3、5 mL尿囊素對(duì)照品溶液至10 mL容量瓶中，乙醇稀釋至刻度，搖勻，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以濃度對(duì)峰面積進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=0.098 4X+0.279 9，r2=0.999 7，結(jié)果表明尿囊素在10～400 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.4.5? 精密度試驗(yàn)

取高、中、低3個(gè)已知濃度的尿囊素對(duì)照品溶液，于當(dāng)日內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)定峰面積，結(jié)果RSD均小于2%，表明儀器精密度良好。

2.4.6? 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取山藥供試品溶液，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件，于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果RSD=2.01%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.7? 重復(fù)性試驗(yàn)

取山藥細(xì)粉1.0 g，平行精密稱定5份，按“2.4.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果RSD=2.42%，表明本法重復(fù)性良好。

2.4.8? 加樣回收率試驗(yàn)

取山藥細(xì)粉1.0 g，平行精密稱定9份，按“2.4.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別加入適量尿囊素對(duì)照品溶液，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果平均回收率為101.82%，RSD=2.15%，表明本法準(zhǔn)確度良好。

2.4.9? 含量測(cè)定結(jié)果

精密吸取尿囊素對(duì)照品及各供試品溶液10 μL，進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜峰與色譜圖，結(jié)果分別見表4、圖1。山藥經(jīng)清炒炮制后，尿囊素基本消失，由生品到炒黃過(guò)程，伴隨有1、2號(hào)峰增大并新出現(xiàn)3號(hào)峰的情況;由炒黃到炒焦過(guò)程，新產(chǎn)生4號(hào)峰，1、3號(hào)峰繼續(xù)增大，2號(hào)峰減小;由炒焦到炒炭過(guò)程，1、2號(hào)峰逐漸減小，4號(hào)峰增大，3號(hào)峰消失。

2.5? 相關(guān)性分析

采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，運(yùn)用配對(duì)t檢驗(yàn)考察各炮制品炮制工藝、物性參數(shù)及主要成分含量間的相關(guān)性，結(jié)果見表5～表7。

物性參數(shù)分析結(jié)果表明，山藥清炒炮制前后物性參數(shù)（吸水率、膨脹度、氧化值、pH值）比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。炮制工藝、物性參數(shù)與主要成分含量之間相關(guān)性分析結(jié)果顯示：氧化值與總淀粉含量呈顯著負(fù)相關(guān)，吸水率與多糖含量呈顯著正相關(guān)，多糖與淀粉含量存在負(fù)相關(guān)性;山藥清炒炮制工藝中的炮制溫度、炮制時(shí)間與總淀粉含量均呈顯著負(fù)相關(guān)，與氧化值呈顯著正相關(guān)。

3? 討論

山藥具有補(bǔ)脾養(yǎng)胃、生津益肺等功效，“入滋陰藥內(nèi)宜生用，入補(bǔ)脾藥內(nèi)宜炒黃用”[13]。目前，關(guān)于山藥的藥理活性及臨床應(yīng)用研究日益增多[14-17]，而對(duì)其炮制后物料性質(zhì)及主要成分變化的研究甚少，因此在實(shí)際應(yīng)用中存在一定的局限性。山藥經(jīng)清炒炮制后，物理化學(xué)性質(zhì)發(fā)生不同程度改變。本研究結(jié)果表明，山藥清炒炮制前后物料性質(zhì)（氧化值、吸水率、膨脹度、pH值）存在顯著差異，因此可形成山藥炮制品的數(shù)字化評(píng)價(jià)指標(biāo)，為山藥清炒炮制品的鑒別提供依據(jù);相關(guān)性分析顯示，山藥清炒炮制后總淀粉含量逐漸降低，多糖含量逐漸升高，二者之間有顯著相關(guān)性，存在相互轉(zhuǎn)化，而尿囊素消失，伴隨某些新物質(zhì)成分產(chǎn)生。本結(jié)果可為山藥的開發(fā)應(yīng)用提供參考，還需進(jìn)一步深入探究。

本研究基于清炒炮制機(jī)理，采用烘箱加熱法，從清炒工藝參數(shù)（加熱溫度、時(shí)間）的連續(xù)變化中，探討山藥炒黃、炒焦、炒炭的節(jié)點(diǎn)，使炮制火候精準(zhǔn)可控。通過(guò)分析得到山藥清炒炮制工藝對(duì)物性參數(shù)（氧化值）、淀粉及多糖均產(chǎn)生較大影響，不僅建立了炮制工藝-物性指標(biāo)-成分測(cè)定之間的相關(guān)性聯(lián)系，詮釋了山藥清炒法炮制的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程，同時(shí)克服以外形、色澤等傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)判斷造成山藥質(zhì)量不均一的弊端，為實(shí)現(xiàn)山藥清炒炮制評(píng)價(jià)客觀化、標(biāo)準(zhǔn)化、現(xiàn)代化、智能化奠定基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2018-06-28）

（修回日期：2018-08-07;編輯：陳靜）