甲潑尼龍琥珀酸鈉對急性原發(fā)免疫性血小板減少癥患者Tr細胞分化及FoxP3基因表達的影響

張 琳，徐大明，李天宇，張 茜，溫大科，李方方，郭豆豆，楊 燕，包 鴻

(江蘇省無錫市兒童醫(yī)院兒血液內(nèi)科 214023)

急性原發(fā)免疫性血小板減少癥(acute idiopathic thrombocytopenic purpura,AITP)為兒童常見的出血性自身免疫性疾病之一，其發(fā)病機制尚不明確，多數(shù)學(xué)者認為該疾病的發(fā)生與自身存在識別自身血小板抗原的自身抗體有關(guān)，致自身抗體與抗原結(jié)合，使血小板壽命縮短、破壞增加，導(dǎo)致血小板數(shù)量急劇減少[1]。研究發(fā)現(xiàn)[2-3]，AITP患兒體內(nèi)多伴有多種T淋巴細胞異常，尤其是T細胞亞群功能及比例失調(diào)，在AITP發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用，當(dāng)體內(nèi)激活的淋巴細胞未及時凋亡，可引起機體自身免疫反應(yīng)，進而引起T細胞清除缺失，導(dǎo)致血小板被持續(xù)性破壞。糖皮質(zhì)激素應(yīng)用于治療AITP，療效顯著，安全性高，成為臨床中治療AITP的主要策略，其具體機制尚不明確[4]。既往研究認為[5]，糖皮質(zhì)激素通過抑制自身免疫細胞過度活化和中和抗血小板抗體而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，但是關(guān)于糖皮質(zhì)激素的作用機制是否與調(diào)節(jié)性T(regulatory T,Tr)細胞有關(guān)尚不明確。因此，本文將通過檢測AITP患兒甲潑尼龍琥珀酸鈉治療前、后Tr細胞比例、相關(guān)細胞因子、FoxP3基因表達水平的變化,探討Tr細胞在AITP發(fā)病中的意義及甲潑尼龍琥珀酸鈉對其的影響?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 本次研究通過江蘇省無錫市兒童醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合AITP診斷標(biāo)準(zhǔn)[6][即起病急，伴有發(fā)熱；以自發(fā)性皮膚、黏膜出血為主，多為針尖大小的皮內(nèi)及皮下出血點，鼻、牙齦、胃腸道出血少見，可伴有肉眼血尿；淋巴結(jié)不大；該病呈自限性經(jīng)過，約1～6個月可自愈；血小板計數(shù)小于40×109/L，可見大、變形血小板，壽命縮短；血小板相關(guān)免疫球蛋白(PAIg)陽性率約80%以上；骨髓巨核細胞數(shù)正?；蛟黾覿；(2)年齡3～7歲；(3)同意入組研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)伴有嚴重基礎(chǔ)性疾??；(2)伴有其他血液病者；(3)對甲潑尼龍琥珀酸鈉過敏者。根據(jù)以上納入排除標(biāo)準(zhǔn)，選取本院在2017年1月至2018年1月期間收治的56例AITP患兒作為研究對象(AITP組)，給予以甲潑尼龍琥珀酸鈉治療，并同期選擇56例健康體檢兒童作為健康組。兩組兒童性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性，見表1。

1.2方法

1.2.1治療方法 入院完善檢查后，均予以抗感染、鈣劑、防出血等綜合治療；AITP組患兒在常規(guī)治療基礎(chǔ)上予以甲潑尼龍琥珀酸鈉(國藥集團容生制藥有限公司40 mg注射劑，國藥準(zhǔn)字H20030727)5 mg·kg-1·d-1)靜脈滴注，病情控制后(本次研究所用時間為3～5 d)，予以潑尼松片(浙江仙琚制藥股份有限公司 5 mg，國藥準(zhǔn)字H33021207)1.5～2.0 mg·kg-1·d-1清晨口服，3～5 d后逐漸減量，直至停服，整個療程約3～4周。

表1 患兒一般情況

1.2.2外周血Tr細胞檢測 收集健康兒童外周血5 mL，以及AITP患兒治療前、后外周血各5 mL，經(jīng)肝素抗凝，用淋巴細胞分離液(由挪威Axis-shield公司提供)分離外周血單個核細胞，用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋細胞，細胞懸液濃度為1×106/mL，吸取200 μL細胞懸液加入EP管中，分別加入20 μL抗CD4-FITC、抗CD25-PE單克隆抗體，同型對照為IgG1-FITC，IgG1-PE，混勻后避光孵育約25～30 min，經(jīng)PBS洗滌2次，用0.5 mL PBS重懸細胞，混勻后經(jīng)流式細胞儀(美國Beckman Coulter公司CytoFLEXLX型)檢測。

1.2.3FoxP3基因表達水平檢測 采用RT-PCR檢測外周血單個核細胞FoxP3 mRNA表達水平；TRIzol法常規(guī)提取外周血單個核細胞總RNA，采用電泳檢測RNA質(zhì)量，定量后吸2 μg總RNA進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以β-actin(正向引物5′-CTC CAT CCT GGC CTC GCT GT-3′,反向引物5′-GCT GCT ACC TTC ACC GTT CC-3′)作為內(nèi)參行PCR反應(yīng)擴增 FoxP3 mRNA(正向引物5′-CAG CAC ATT CCC AGA GTT CCT C-3′;反向引物5′-GCG TGT GAA CCA GTG GTA GAT C-3′)，擴增目的基因后進行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)掃描；PCR反應(yīng)條件為94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s,56 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；72 ℃ 5 min。

1.3觀察指標(biāo) (1)治療效果評價：記錄AITP患兒治療后(即停藥時)外周血血常規(guī)血小板計數(shù)，出血點、瘀點、瘀斑等皮下出血情況；(2)記錄入組兒童流式細胞儀檢查的外周血T細胞亞群結(jié)果；(3)細胞因子檢測：記錄健康兒童外周血FoxP3基因表達水平，以及AITP患兒治療前、后FoxP3基因表達水平。

2 結(jié) 果

2.1患兒治療效果比較 AITP組患兒治療后血小板計數(shù)較治療前升高(134.18±50.12)×109/L，皮膚黏膜紫癜平均消退時間為(44.01±7.48)h;AITP組患兒治療過程中血壓、血糖、電解質(zhì)監(jiān)測均值波動在正常值范圍內(nèi)。

表2 健康組與AITP組治療前、后外周血Tr細胞亞群檢測結(jié)果

t1、P1：健康對照組與AITP組治療前比較；t2、P2：AITP組治療前、后比較

2.2入組兒童外周血T細胞亞群檢測結(jié)果 治療前AITP組患兒外周血CD4+CD25+Tr細胞、CD4+Tr細胞、CD25+Tr細胞、CD4+CD25+Tr細胞/CD4+Tr細胞水平低于健康組(P<0.05)，治療后AITP組患兒外周血CD4+CD25+Tr細胞、CD4+Tr細胞、CD25+Tr細胞、CD4+CD25+Tr細胞/CD4+Tr細胞水平高于治療前(P<0.05)。見表2。

2.3入組兒童FoxP3 mRNA表達情況 AITP組患兒FoxP3 mRNA表達水平低于健康組兒童(P<0.05)；AITP組患兒治療后FoxP3 mRNA表達水平高于治療前(P<0.05)。見表3。

表3 入組兒童FoxP3 mRNA表達情況檢測

a：P<0.05，與健康組比較；b：P<0.05，與AITP組治療前比較；-：此項無數(shù)據(jù)

3 討 論

AITP發(fā)病機制尚不明顯，臨床中主要表現(xiàn)為血小板減少，伴有不同程度骨髓巨核細胞增加。AITP為兒童人群中常見的一種自身免疫性疾病，既往研究認為是因自身抗體作用，破壞血小板，近年研究發(fā)現(xiàn)，AITP的發(fā)生，不僅與體液免疫機制有關(guān)，還與細胞免疫有關(guān)[7]。目前臨床中治療AITP首選糖皮質(zhì)激素，其可通過抑制巨噬細胞系統(tǒng)，降低毛細血管的脆性，并抑制血小板抗體形成，從而起到治療效果[8]。臨床中使用的糖皮質(zhì)激素主要包括潑尼松、地塞米松及甲潑尼龍琥珀酸鈉等，但臨床應(yīng)用研究發(fā)現(xiàn)，潑尼松短期療效尚可，遠期療效欠佳，并且長期服用，不良反應(yīng)發(fā)生風(fēng)險較高；地塞米松相比于潑尼松，其抗炎、抗過敏、抗毒作用更好，可降低鈉潴留發(fā)生風(fēng)險；甲潑尼龍琥珀酸鈉抗炎作用較強，鈉潴留作用較小，其在血液中的半衰期短，并且對于垂體腎上腺周的抑制作用較小，短期內(nèi)可大劑量使用[9-11]。

本次研究使用大劑量靜脈注射甲潑尼龍琥珀酸鈉(5 mg·kg-1·d-1)治療AITP，該劑量比高于常規(guī)用藥劑量，但低于沖擊治療劑量，基本與1 mg·kg-1·d-1地塞米松具有等效抗炎作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AITP組患兒治療效果顯著，說明靜脈給予大劑量甲潑尼龍琥珀酸鈉治療AITP，療效顯著。本次研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)AITP患兒治療過程中未見不良反應(yīng)發(fā)生，說明甲潑尼龍琥珀酸鈉治療AITP具有較高安全性，但有研究報道，當(dāng)靜脈注射15～30 mg·kg-1·d-1甲潑尼龍琥珀酸鈉沖擊治療AITP，伴有心律失常、心臟停搏甚至虛脫等嚴重不良反應(yīng)[12]，與本次研究結(jié)果不一致，可能因本次用藥劑量較低，或與本次研究納入樣本數(shù)量較小有關(guān)，因此臨床中治療AITP避免采用高劑量甲潑尼龍琥珀酸鈉，高劑量甲潑尼龍琥珀酸鈉一般僅用于威脅患者生命的情況。

糖皮質(zhì)激素治療AITP的療效顯著，不良反應(yīng)發(fā)生率低，已成為臨床中治療AITP首選藥物。關(guān)于糖皮質(zhì)激素治療AITP的機制研究較多，多數(shù)學(xué)者認為糖皮質(zhì)激素治療效果顯著，與其能夠減少血小板自身抗體生成有關(guān)，減少單核-巨噬細胞系統(tǒng)對血小板的破壞，改善毛細血管通透性有關(guān)[13]。研究發(fā)現(xiàn)[14-15]，健康人群外周血中有5%～15%的CD4+Tr細胞持續(xù)高表達CD25而被稱作CD4+CD25+Tr細胞，該細胞為近年發(fā)現(xiàn)的一種專職抑制細胞，為T細胞亞群的一種，其通過T細胞抗原受體(TCR)介導(dǎo)信號刺激活化后，不僅可抑制CD4+、CD8+T細胞的活化與增殖，同時能夠抑制機體免疫功能，如抑制干擾素-γ(IFN-γ)的產(chǎn)生，且這種抑制性不具組織相溶性復(fù)合體(MHC)限制性，能夠抑制同種同型或同種異型T細胞增殖，在移植耐受、腫瘤免疫逃逸等過程中起著重要作用，在自身免疫疾病進展中也發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)[16-17]，在多種自身免疫性疾病中，Tr細胞的數(shù)量及功能存在不同程度異常，進一步研究證明Tr細胞參與自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展。目前研究普遍認為，F(xiàn)oxP3基因特異且穩(wěn)定地表達于胸腺及外周淋巴組織中的CD4+CD25+Tr細胞亞群中，可以作為Tr細胞的特異性標(biāo)志，也是維持Tr細胞具有免疫抑制功能的必備條件，F(xiàn)oxP3可能是CD4+CD25+Tr細胞中主要的調(diào)節(jié)基因[18-20]。臨床中根據(jù)ITP病程是否超過1個月，將其分為AITP、CITP。本次研究采用流式細胞術(shù)檢測AITP患兒外周血中Tr細胞的數(shù)量，采用RT-PCR檢查FoxP3基因表達情況，來分析Tr細胞及FoxP3 基因在AITP發(fā)生發(fā)展中的作用，以及糖皮質(zhì)激素的作用機制。

本次研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AITP患兒外周血Tr細胞數(shù)量、FoxP3基因表達水平低于健康兒童，說明AITP患兒免疫抑制功能低，而自身體液免疫可進一步破壞血小板，進而加重AITP患兒病情，增大出血風(fēng)險。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用甲潑尼龍琥珀酸鈉治療AITP患兒后，患兒外周血Tr細胞數(shù)量、FoxP3基因表達水平明顯升高，但仍低于健康兒童；結(jié)果說明Tr細胞與FoxP3基因在AITP的發(fā)生發(fā)展過程中起著一定作用，該研究的發(fā)現(xiàn)為研制AITP治療方法提供思路，同時為AITP的免疫治療提供臨床數(shù)據(jù)。

綜上所述，AITP患兒外周血CD4+CD25+Tr細胞數(shù)量、FoxP3表達水平明顯降低，甲潑尼龍琥珀酸鈉治療AITP效果顯著，可提高外周血CD4+CD25+Tr細胞數(shù)量及FoxP3表達水平。