消癌平對(duì)伊馬替尼在大鼠體內(nèi)外代謝的影響

黃曦 章利亞 鄭宇紅 夏迎春 黃笑夏

通關(guān)藤莖中含有以通關(guān)藤苷元甲、通關(guān)藤苷元乙、通關(guān)藤苷元丙、通關(guān)藤素為代表的4類C21甾體苷，具有抗腫瘤活性[1]。消癌平注射液是從通關(guān)藤的干燥藤莖中提煉且精制而成的中藥抗腫瘤注射劑，為單方制劑，自上市以來，廣泛用于各種惡性腫瘤的治療，如肺癌、肝癌、乳腺癌、鼻咽癌、胃癌、多發(fā)性骨髓瘤、急性髓細(xì)胞白血病等[2-8]。目前，臨床上中藥注射劑與其他藥物聯(lián)合使用的現(xiàn)象非常普遍。然而，市面上許多中藥注射劑說明書對(duì)藥物相互作用的描述過于簡(jiǎn)單、模糊，甚至缺乏[9]。細(xì)胞色素P450酶系是多數(shù)藥物的主要代謝酶，由此引發(fā)的潛在藥物相互作用已得到廣泛重視。甲磺酸伊馬替尼是治療慢性期、急變期或加速期慢性髓性白血病和復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性胃腸間質(zhì)瘤的一線用藥，在體內(nèi)主要經(jīng)肝微粒體細(xì)胞色素P450中的CYP3A4代謝，而CYP1A2、CYP2C9、CYP2D6和CYP2C19等代謝酶對(duì)伊馬替尼的代謝影響較小[10]。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，消癌平注射液能夠抑制CYP3A4的活性，但未見其對(duì)伊馬替尼代謝影響的相關(guān)報(bào)道。本研究先建立同時(shí)檢測(cè)大鼠血漿中伊馬替尼及N-去甲基伊馬替尼濃度的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS），再觀察消癌平注射液在體內(nèi)外對(duì)伊馬替尼藥代動(dòng)力學(xué)的影響，為其藥物相互作用的研究提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性健康SD大鼠16只，體質(zhì)量（250±50）g，由溫州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK（浙）2015-0009。

1.2 主要試劑 甲磺酸伊馬替尼（規(guī)格100mg，批號(hào)S102606，美國(guó)Selleck Chemicals LLC公司）；N-去甲基伊馬替尼對(duì)照品（規(guī)格10mg，批號(hào)241902，美國(guó)Sigma公司）；卡馬西平對(duì)照品（規(guī)格50mg，批號(hào)0142-9503，中國(guó)藥品生物制品檢定所）；消癌平注射液（規(guī)格20ml，批號(hào)201511061，中國(guó)南京圣和藥業(yè)有限公司）；人和大鼠肝微粒體（本實(shí)驗(yàn)室自制）；還原性輔酶Ⅱ（NADPH，規(guī)格1g，批號(hào)N041939-1G，瑞士羅氏公司）。

1.3 主要儀器 ACQUITY H-Class超高效液相色譜儀、Masslynx 4.1色譜工作站和XEVO TQD三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀（美國(guó) Waters公司）；TGL-16G高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；Milli-Q純水機(jī)（美國(guó)Millipore公司）；QL-866渦旋混合器（江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司）；FA2004電子分析天平（上海方瑞儀器有限公司）；DKZ-450B電熱恒溫振蕩水槽（上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 色譜條件 色譜柱為Waters ACQUITY UPLC BEH C18 Column（2.1×50mm，1.7μm，particle size，Waters Corp）；流動(dòng)相：乙腈-0.1%甲酸水溶液；梯度洗脫：0～0.5min，40%→85%乙腈，0.5～1.3min，85%乙腈，1.3～1.5min，85%→40%乙腈，1.5～2.5min，40%乙腈；流速：0.4ml/min，柱溫40℃

1.4.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子化源，正離子檢測(cè)模式。定量分析的離子反應(yīng)分別為伊馬替尼m/z 494.3/394.2，N-去甲基伊馬替尼m/z 480.2/394.2，內(nèi)標(biāo)卡馬西平m/z 237.1/194.2。毛細(xì)管電壓2kV；伊馬替尼、N-去甲基伊馬替尼、卡馬西平的錐孔電壓分別為55、40、40V，碰撞電壓分別為30、30、20V；離子源溫度150℃；去溶劑化溫度500℃；本儀器用氮?dú)庾魅ト軇┗瘹怏w（800L/h）及錐孔氣體（50L/h）。

1.4.3 體外試驗(yàn) （1）肝微粒體孵育體系：分別將2μl消癌平注射液和2μl消癌平注射液10倍稀釋液（對(duì)照組不加消癌平注射液），加入含0.024 7mg/ml伊馬替尼溶液和相應(yīng)濃度的微粒體孵育體系（0.5mg/ml鼠肝微粒體和0.632 5mg/ml人肝微粒體），200μl孵育體系見表1，每個(gè)濃度平行2管。將孵育體系置于37°C水浴恒溫振蕩器中預(yù)孵育5min，加入1mM的NADPH啟動(dòng)反應(yīng)。孵育30min后立即冷卻到-80°C終止反應(yīng)。（2）血漿樣品處理：反應(yīng)終止后，加入400μl乙腈溶劑沉淀蛋白，再加入內(nèi)標(biāo)1μg/ml卡馬西平甲醇溶液20μl，渦旋混勻2min，13 000r/min 離心 10min，取 100μl上清液與 100μl超純水1∶1稀釋混勻，2μl稀釋液進(jìn)樣檢測(cè)。

表1 肝微粒體孵育體系

1.4.4 體內(nèi)試驗(yàn) （1）給藥方法與樣品采集：將16只SD大鼠隨機(jī)分為兩組，即對(duì)照組和給藥組，每組8只。其中給藥組大鼠按7.5ml/kg腹腔注射消癌平注射液，1次/d，連續(xù)10 d。給藥組最后一次給予消癌平注射液后，兩組大鼠單次灌胃伊馬替尼（30mg/kg），分別于灌胃后的 0.25、0.5、1、2、4、6、8、12、24h 取 大 鼠 尾 靜 脈 血 樣0.5ml于1.5ml EP管中，13 000r/min離心10min，分離的血漿于-80℃冰箱保存待測(cè)。（2）血漿樣品處理：樣品解凍后，取100μl于EP管中，加入乙腈溶劑200μl來沉淀蛋白，再加入1μg/ml卡馬西平甲醇溶液20μl，并渦旋混勻2min，充分混勻后13 000r/min離心10min，取上清液100μl與超純水100μl（1∶1）稀釋混勻，2μl稀釋液進(jìn)樣檢測(cè)。

1.5 方法學(xué)考察 在正式實(shí)驗(yàn)前，參照體內(nèi)試驗(yàn)的血漿樣品處理方法進(jìn)行處理，并作質(zhì)譜分析，記錄伊馬替尼、N-去甲基伊馬替尼和內(nèi)標(biāo)峰面積，以伊馬替尼、N-去甲基伊馬替尼與內(nèi)標(biāo)的比值為縱坐標(biāo)，以伊馬替尼和N-去甲基伊馬替尼為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出兩者的線性回歸方程。伊馬替尼、N-去甲基伊馬替尼的濃度分別為 50、1 000、10 000 和 20、100、1 000ng/ml，取每種濃度樣品6份，參照體內(nèi)試驗(yàn)的血漿樣品處理方法進(jìn)行處理；同一天測(cè)定日內(nèi)精密度，連續(xù)3d作同樣操作，以測(cè)定日間精密度。取上述每種濃度樣品6份處理后檢測(cè)，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算檢測(cè)濃度，以檢測(cè)的峰面積直接與相應(yīng)濃度的伊馬替尼、N-去甲基伊馬替尼對(duì)照品溶液直接進(jìn)樣所得的峰面積進(jìn)行比較，計(jì)算提取回收率。將已處理空白血漿配制的上述濃度的伊馬替尼和N-去甲基伊馬替尼的標(biāo)準(zhǔn)品溶液峰面積與相應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品直接進(jìn)樣的峰面積比較，計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)。同時(shí)考察預(yù)處理樣品在室溫、自動(dòng)進(jìn)樣器、-20℃放置和反復(fù)凍融條件下的穩(wěn)定性。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料用表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。應(yīng)用DAS 3.0軟件對(duì)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 UPLC-MS/MS分析結(jié)果 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，內(nèi)源性雜質(zhì)峰不干擾測(cè)定，伊馬替尼、N-去甲基伊馬替尼與內(nèi)標(biāo)及血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)能得到良好的分離，結(jié)果見圖1。伊馬替尼和N-去甲基伊馬替尼的線性回歸方程分別為 y1=0.000 3 x1＋0.036 3（r2=0.999 2）和 y2=0.000 07 x2＋0.000 2（r2=0.999 5），血漿濃度分別在 20～10 000、1～1 000ng/ml時(shí)線性關(guān)系良好，定量下限分別為20、1ng/ml。伊馬替尼的日間、日內(nèi)精密度相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均＜15%，N-去甲基伊馬替尼的日間、日內(nèi)精密度RSD亦均＜15%。伊馬替尼低、中、高濃度的提取回收率分別為（88.11±7.15）%、（92.61±6.00）%、（87.67±5.08）%，基質(zhì)效應(yīng)分別為（86.44±10.29）%、（89.15±7.74）%、（97.06±7.27）%；N-去甲基伊馬替尼低、中、高濃度的提取回收率分別為（87.26±11.16）%、（97.66±5.77）%、（98.89±3.54）%，基質(zhì)效應(yīng)分別為（96.08±3.52）%、（101.64±3.25）%、（93.95±4.58）%。伊馬替尼和N-去甲基伊馬替尼分別在室溫放置12h、自動(dòng)進(jìn)樣器中放置12h、經(jīng)歷3次凍融（冷凍與解凍循環(huán)）、-20℃放置12d，穩(wěn)定性良好。該法可用于伊馬替尼和N-去甲基伊馬替尼的血漿測(cè)定。

2.2 消癌平在體外對(duì)伊馬替尼的作用 以伊馬替尼為底物，消癌平注射液和消癌平注射液10倍稀釋液在大鼠肝微粒體中的抑制作用分別達(dá)到了90.83%和50.73%，在人肝微粒體中的抑制作用分別達(dá)到了79.44%和28.77%。由此得出，消癌平在大鼠肝微粒體和人肝微粒體中對(duì)伊馬替尼均有明顯的抑制作用。

2.3 血藥濃度-時(shí)間曲線 兩組大鼠按30mg/kg單劑量灌胃伊馬替尼后，隨著時(shí)間的增加，伊馬替尼、N-去甲基伊馬替尼的血藥濃度曲線右移，見圖2-3。

圖1 伊馬替尼及N-去甲基伊馬替尼的UPLC-MS/MS色譜圖（a：空白血漿，b：伊馬替尼和N-去甲基伊馬替尼血漿對(duì)照品；c：血漿樣品）

圖2 兩組大鼠血漿伊馬替尼的藥-時(shí)曲線

圖3 兩組大鼠血漿N-去甲基伊馬替尼的藥-時(shí)曲線

2.4 藥動(dòng)學(xué)參數(shù) 伊馬替尼和N-去甲基伊馬替尼藥動(dòng)學(xué)數(shù)據(jù)經(jīng)過DAS 3.0軟件處理后，采用非房室模型統(tǒng)計(jì)矩計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，結(jié)果見表2～3。相比于空白對(duì)照組，大鼠按7.5ml/kg連續(xù)10d腹腔注射消癌平注射液后，血漿伊馬替尼達(dá)峰時(shí)間（Tmax）由2.500h延長(zhǎng)至5.143h，延后了105.72%；表觀分布容積（Vz/F）由2.682L/kg減少至2.018L/kg，減少了24.76%；AUC增加，峰濃度（Cmax）增大，清除率（CLz/F）減小。相比于空白對(duì)照組，大鼠按7.5ml/kg連續(xù)10d腹腔注射消癌平注射液后，血漿 N-去甲基伊馬替尼AUC(0-t)由 13 470.171μg/L·h減少至 10 591.962μg/L·h，減少了 21.37%；AUC(0-∞)由13 915.901μg/L·h 減少至 11 231.875μg/L·h，減少了19.29%；Tmax由4.667h延長(zhǎng)至5.067h，延后了35.70%；Cmax由1 112.462μg/L減少至889.847μg/L，減少了20.01%；Vz/F由14.723L/kg增加至21.405L/kg，增加了45.38%；CLz/F由2.241L/（h·kg）增加至2.968L/（h·kg），增加了32.44%；半衰期延長(zhǎng)，平均停留時(shí)間延長(zhǎng)。由此得出，消癌平注射液對(duì)伊馬替尼、N-去甲基伊馬替尼的藥代動(dòng)力學(xué)有一定的影響。

表2 兩組大鼠血漿伊馬替尼的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

表3 兩組大鼠血漿N-去甲基伊馬替尼的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

3 討論

伊馬替尼在體內(nèi)主要經(jīng)肝微粒體CYP3A4代謝生成N-去甲基伊馬替尼，它可能與多種藥物產(chǎn)生相互作用，如辛伐他汀、美托洛爾、利福平、環(huán)孢菌素、華法林等[10]。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，消癌平注射液能抑制CYP3A4的活性[11]。劉麗雅等[12]利用體外人肝微粒體孵育技術(shù)，從藥物代謝方面觀察消癌平注射液對(duì)CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6 和 CYP3A4/5 各亞酶的活性影響，結(jié)果表明除CYP2D6外，消癌平注射液對(duì)其他亞酶均有明顯的抑制作用。周靜雅[13]將消癌平注射液加入到體外人肝微粒體孵育體系中，探究其對(duì) CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1 和 CYP3A4 各亞酶的活性影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示消癌平對(duì)以上5個(gè)酶均有抑制作用，且對(duì)CYP3A4的半抑制濃度（IC50）為46 000ng/ml；同時(shí)進(jìn)一步開展了消癌平注射液和化療藥物多西他賽大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示消癌平注射液能夠抑制CYP3A4底物多西他賽在大鼠體內(nèi)的代謝過程。本研究以伊馬替尼為底物，消癌平注射液為抑制劑，消癌平注射液和消癌平注射液10倍稀釋液對(duì)伊馬替尼的抑制作用在大鼠肝微粒體中分別達(dá)到了90.83%和50.73%，消癌平注射液和消癌平注射液10倍稀釋液對(duì)伊馬替尼的抑制作用在人肝微粒體中分別達(dá)到了79.44%和28.77%；這說明消癌平注射液對(duì)伊馬替尼有明顯的抑制作用。

雖然肝微粒體體外溫孵法對(duì)反應(yīng)體內(nèi)代謝情況具有一定的價(jià)值，但考慮到藥物在體內(nèi)的代謝過程非常復(fù)雜，因此還需要體內(nèi)實(shí)驗(yàn)作進(jìn)一步研究?；隗w外實(shí)驗(yàn)結(jié)果，筆者又進(jìn)行了消癌平注射液與伊馬替尼在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)中，筆者建立了UPLCMS/MS，可同時(shí)檢測(cè)大鼠血漿中伊馬替尼及其活性代謝產(chǎn)物N-去甲基伊馬替尼濃度。相比于高效液相色譜，UPLC-MS/MS具有耗時(shí)短、進(jìn)樣量少、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，是一種檢測(cè)伊馬替尼及其活性代謝產(chǎn)物N-去甲基伊馬替尼濃度的有效手段。從動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，大鼠腹腔注射消癌平后，血漿伊馬替尼及其活性代謝產(chǎn)物N-去甲基伊馬替尼的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)發(fā)生了改變：相比于空白對(duì)照組，大鼠按7.5ml/kg連續(xù)10d腹腔注射消癌平注射液后，血漿伊馬替尼的Tmax延后了105.72%，Vz/F減少了24.76%；血漿N-去甲基伊馬替尼的AUC(0-t)減少了 21.37%，AUC(0-∞)減少了 19.29%，Tmax延后了 35.70%，Cmax減少了20.01%，Vz/F增加了45.38%，CLz/F增加了32.44%。由此得出，消癌平注射液對(duì)伊馬替尼、N-去甲基伊馬替尼的藥動(dòng)學(xué)有一定的影響。

筆者發(fā)現(xiàn)，體外實(shí)驗(yàn)中消癌平注射液對(duì)伊馬替尼代謝表現(xiàn)出明顯的抑制作用；但在大鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中消癌平注射液對(duì)伊馬替尼代謝未表現(xiàn)出明顯的抑制作用，考慮與體內(nèi)生理環(huán)境復(fù)雜且影響因素（吸收、分布、排泄等）較多有關(guān)。相關(guān)研究結(jié)果顯示，血漿伊馬替尼濃度與慢性粒細(xì)胞白血病[14]、胃腸間質(zhì)瘤[15]的療效息息相關(guān)，而個(gè)體間伊馬替尼的CLz/F又有40%的差異[16]，藥物相互作用對(duì)伊馬替尼血藥濃度的影響在個(gè)體間可能被放大，進(jìn)而導(dǎo)致治療失敗和不良反應(yīng)發(fā)生。由于消癌平注射液和伊馬替尼均為腫瘤科常用藥物，此實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有潛在的臨床意義。本實(shí)驗(yàn)為消癌平注射液與伊馬替尼合用的初步結(jié)果，且伊馬替尼為單次給藥。由于甲磺酸伊馬替尼臨床常用劑量為400～600mg/d，最大劑量可加至800mg/d，且需要長(zhǎng)期給藥，長(zhǎng)期聯(lián)合用藥的結(jié)果可能會(huì)產(chǎn)生更大的影響。

總之，本研究在人與大鼠肝微粒體體外孵育藥物的體系中，以伊馬替尼為底物，加入消癌平注射液，結(jié)果顯示其在相應(yīng)微粒體孵育體系中對(duì)伊馬替尼的代謝過程有明顯的抑制作用。結(jié)合消癌平注射液對(duì)伊馬替尼在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)的影響，在臨床同時(shí)應(yīng)用消癌平注射液和伊馬替尼時(shí)，應(yīng)密切關(guān)注患者的臨床癥狀及伊馬替尼血藥濃度Tmax。