維生素C對存儲紅細胞的影響

楊麗麗，李旭研，孫明玥，李 姝，張麗華，魏春華，蘇 燕

(包頭醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，內(nèi)蒙古 包頭 014040)

體外存儲的紅細胞(red blood cells，RBCs)是臨床輸血的主要來源，隨著血液存儲時間延長，RBCs會發(fā)生一系列形態(tài)、功能、生物化學(xué)等方面的變化，即RBCs存儲損傷。氧化應(yīng)激通過促進蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的氧化損傷，導(dǎo)致儲存RBCs的生理學(xué)改變[1]，是RBCs儲存損傷的主要原因，向儲存RBC中添加適量抗氧化劑具有減輕氧化損傷的潛力[2]。維生素C是一種水溶性的抗氧化劑，J.S.Raval等的研究表明8.78 mmol/ L(生理濃度的150倍)的維生素C可以顯著降低存儲紅細胞脆性和溶血，但對生化參數(shù)沒有影響[3]。而Sean R.Stowell等的研究發(fā)現(xiàn)，3.6-10.8 mmol/L的維生素C可以改善鼠輸血后恢復(fù)、同時減少微粒形成和同種異體免疫[4]等。但尚未見維生素C對存儲期紅細胞血紅蛋白狀態(tài)影響的報道。本研究擬向存儲紅細胞中加入維生素C注射液(終濃度10.8 mmol/L)，利用血氣分析儀分別檢測存儲0 d、7 d、14 d、21 d、28 d、35 d紅細胞血氣指標的改變，為研究RBCs存儲損傷及紅細胞保護提供理論及實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1血液的來源與制備 本研究經(jīng)包頭醫(yī)學(xué)院倫理委員會審核批準，招募乙肝病毒、丙肝病毒、人類免疫缺陷病毒陰性，并無疾病家族遺傳史的健康志愿者6名，囑3 d內(nèi)清淡飲食、適量運動，于3 d后分別采集全血400 mL于山東威高的采血四聯(lián)袋內(nèi)，經(jīng)濾白器(四聯(lián)袋自帶)過濾白細胞后，4 795 g離心17 min，分離血漿和紅細胞。紅細胞與100 mL紅細胞保護液MAP充分混勻后，用無菌接管機分成實驗組和對照組，分好后準確稱量血液質(zhì)量并計算體積。對照組不做任何處理，實驗組加入維生素C注射液(pH=7.0)，終濃度為10.8 mmol/L。存儲紅細胞均放入4 ℃冰箱保存。

1.2試劑與儀器 維生素C注射液(瑞陽制藥)；一次性使用去白細胞塑料血袋(山東威高集團醫(yī)用高分子制品股份有限公司)；離心機(Heraeus Cryofuge 6000i，德國Thermo Fisher)；無菌接管機(TSCDII，泰爾茂)；血氣分析儀(ABL90，雷度)；全血細胞分析儀(sysmex800i)。

1.3方法 于儲存期0 d、7 d、14 d、21 d、28 d、35 d輕輕混勻血袋，從血袋小辮端無菌抽取RBCs 懸液2 mL，熱和封閉血袋接口后，分別進行血氣和血常規(guī)檢測。

2 結(jié)果

2.1維生素C對存儲期不同時間點紅細胞攜氧能力的影響 對實驗組和對照組紅細胞血氧值的各項指標數(shù)據(jù)分別進行獨立樣本t 檢驗比較，結(jié)果所示：隨著存儲時間的延長紅細胞血氧飽和度(SO2)、氧合血紅蛋白分數(shù)(FO2Hb)不斷降低，維生素C組高鐵血紅蛋白分數(shù)(FMetHb)、還原血紅蛋白分數(shù)(FHHb)不斷升高。維生素C組SO2在第14d(P=0.004)、21d(P=0.000)、28d(P=0.000)、35d(P=0.000)與對照組比明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；FO2Hb在第14d(P=0.005)、21d(P=0.002)、28d(P=0.000)、35d(P=0.000)與對照組比明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；而FMetHb在第28d(P=0.036)、35d(P=0.010)與對照組比明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；FHHb卻在第7 d(P=0.001)、14d(P=0.000)、21 d(P=0.000)、28 d(P=0.000)、35 d(P=0.000)與對照組比明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。詳見表1。

表1 維生素C對存儲期不同時間點紅細胞血氧值的影響

a為與對照組比較，P<0.05

2.2維生素C對存儲期不同時間點紅細胞代謝物濃度的影響 對實驗組和對照組紅細胞代謝物濃度的各項指標數(shù)據(jù)分別進行獨立樣本t 檢驗比較，結(jié)果所示：隨著存儲時間的延長紅細胞外葡萄糖(Glucose，GLU)濃度不斷降低，而乳酸(lactic acid，Lac)、總膽紅素(Total bilirubin，TBil)濃度不斷升高。維生素C組TBil濃度在7 d(P=0.009)、14 d(P=0.029)、21 d(P=0.033)、28 d(P=0.040)、35 d(P=0.043)與對照組比明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；GLU濃度卻在35 d(P=0.007)與對照組比明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；而Lac濃度維生素C組與對照組沒有差異。見表2。

表2 維生素C對存儲期不同時間點紅細胞代謝物濃度的影響

a為與對照組比較，P<0.05

2.3維生素C對存儲期不同時間點紅細胞外離子濃度及紅細胞平均體積(Erythrocyte mean corpuscular volume，MCV)的影響 對實驗組和對照組紅細胞外離子濃度及紅細胞平均體積的各項指標數(shù)據(jù)分別進行獨立樣本t 檢驗比較，結(jié)果所示：隨著存儲時間的延長紅細胞外Na+濃度不斷降低，Cl-濃度和MCV沒有顯著變化。維生素C組Na+濃度在7 d(P=0.379)、14 d(P=0.016)、21 d(P=0.005)、28 d(P=0.005)、35 d(P=0.012)與對照組比明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；Cl-濃度和MCV維生素C組與對照組沒有顯著變化。詳見表3。

表3 維生素C對存儲期不同時間點紅細胞外離子濃度及紅細胞平均體積(MCV)的影響

a為與對照組比較，P<0.05

3 討論

維生素C是一種水溶性化合物，易溶解于保護液但不易透過脂質(zhì)雙層進入細胞，但人類RBC膜本身似乎具有吸收維生素C及其氧化衍生物的機制[5]，Padayatty SJ等認為維生素C作為一種電子供體被氧化成脫氫抗壞血酸(dehydroascorbic acid，DHA)，RBCs通過DHA途徑獲得維生素C[6]。血液中維生素C可保護生物膜免受水相中的過氧化損傷，并使Hb維持在還原狀態(tài)。然而維生素C對RBCs的影響是濃度依賴性的，并且可以通過長期儲存期間從紅細胞釋放的各種化合物來調(diào)節(jié)，例如 Hb降解產(chǎn)物、細胞因子、蛋白酶和/或活性脂質(zhì)可以將其性質(zhì)從抗氧化變?yōu)榇傺趸痆8]。本研究結(jié)果表明，10.8 mmol/L維生素C組FMetHb、FHHb、TBil及細胞外Na+顯著高于對照組，而SO2、FO2Hb及GLU明顯低于對照組。維生素C作為一種還原劑，被存儲紅細胞外環(huán)境中的氧氣氧化成為DHA，使存儲紅細胞外環(huán)境中氧分壓降低，與血紅蛋白結(jié)合的氧解離，所以SO2、FO2Hb降低，而FHHb卻從第7 d開始顯著高于對照組，所以從存儲第7 d開始觀察到維生素C組的血液呈藍紫色。體外高濃度維生素C與紅細胞的相互作用引起膜的脂質(zhì)過氧化和血紅蛋白的氧化導(dǎo)致紅細胞氧化溶血[8-11]，釋放出非結(jié)合膽紅素，所以維生素C組TBil增加。血紅蛋白因遭到高濃度維生素C的氧化導(dǎo)致FMetHb高于對照組。存儲過程中由于腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)不足使ATP依賴性紅細胞Na+-K+-ATP泵失活，導(dǎo)致存儲RBCs外Na+濃度降低[12]。有學(xué)者[13]也證實在4 ℃的儲存溫度下，Na+/ K+泵失活性，導(dǎo)致Na+內(nèi)流。但Na+濃度在存儲的第7 d升高及存儲末期維生素C組的GLU濃度低于對照組的機制及原因還有待進一步的驗證。輸血治療的目的是恢復(fù)組織的供氧、血容量及血液粘度。因為從存儲3 h到14 d存儲環(huán)境中PO2保持恒定，而在整個存儲期間血氧飽和度卻持續(xù)增加，到第42 d達到99 %，這是由于ATP及2,3- DPG的消耗[14]使RBCs的氧親和力增加[15]。2,3- DPG為Hb的變構(gòu)效應(yīng)物，可以穩(wěn)定Hb的“脫氧”狀態(tài)，因此2,3- DPG的降低會增加Hb的氧親和力，使氧飽和度增加。而10.8 mmolL-1的vitC使存儲期RBCs的SO2、FO2Hb低于對照組，F(xiàn)HHb高于對照組，再加上存儲引起的Hb與O2的親和力增加，所以輸入這種血液以后，所以不利于恢復(fù)機體及組織的氧供。

4 結(jié)論

10.8 mmol/L維生素C實驗組的Vitamin C對存儲期紅細胞具有促氧化作用，并且使血紅蛋白脫氧。