釀酒酵母萌發(fā)突變株的篩選

邱盼盼， 高曉冬， 中西秀樹

（江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫 214122）

酵母細胞在缺乏氮源且遇到非發(fā)酵性碳源的情況下，酵母細胞就會進入減數(shù)分裂進行孢子生殖，將單倍體的染色體分到4個不同的子細胞中，形成孢子[1]。而孢子在遇到營養(yǎng)物質(zhì)如葡萄糖時，開始萌發(fā)、發(fā)生形變，出芽長成正常的營養(yǎng)細胞[2-3]。孢子萌發(fā)是孢子經(jīng)過休眠，非分裂性孢子的生長和進入有絲分裂的過程，而控制細胞進入有絲分裂的系統(tǒng)是個有序的選擇性系統(tǒng)，只有在遇到適合的情況才會退出休眠期進入有絲分裂[4]，該選擇性系統(tǒng)涉及一系列蛋白質(zhì)，影響到轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)的磷酸化、催化子和抑制子的穩(wěn)定性[5]。關于萌發(fā)機制則至今還未被詳細解析，因此本實驗對萌發(fā)機制的研究有理論意義。

孢子外層壁結(jié)構由里到外依次是甘露糖蛋白（mannoprotein），β-葡 聚糖 （β-glucan）， 殼 聚糖（chitosan），以及二酪氨酸（dityrosine）層[6-7]，而孢子最外層的二酪氨酸層對其乙醚抗性具有重要作用[8-9]，而正常的營養(yǎng)細胞對乙醚缺乏抗性，本研究利用這一特性篩選萌發(fā)缺陷型突變株。

本研究室首次利用孢子作為微膠囊[10]，建立2種新型固定化酶方法。其中一個方法是以孢子為載體[11]，利用二酪氨酸的阻擋作用，將酵母中分泌型的酶固定在孢子壁上，其特點是固定化酶的穩(wěn)定性高，能抵抗較高的溫度和培養(yǎng)環(huán)境水解酶的降解作用。另一種方法是將外層二酪氨酸層去除，使殼聚糖層暴露在孢子最外層形成殼聚糖球。利用殼聚糖層上的氨基，結(jié)合有效的化學方法將需要固定的外源酶共價交聯(lián)在殼聚糖層上，具有重復利用率高，熱穩(wěn)定性好等特點。該殼聚糖球還具有吸附性強的特點，可去除廢水中的金屬離子和帶負電荷的離子，達到凈化環(huán)境的目的。但是上述2種方法的不足之處在于孢子遇到營養(yǎng)物質(zhì)即開始萌發(fā)，不利于酶的固定化，為保證其重復利用性，本研究對釀酒酵母進行化學誘變，經(jīng)篩選獲得若干株具有萌發(fā)缺陷的突變株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 出發(fā)菌株釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）AN120由本實驗室保藏和提供。

1.1.2 培養(yǎng)基 YPAD培養(yǎng)基（g/dL）:2葡萄糖，2蛋白胨，1酵母提取物，0.003腺嘌呤，（固體培養(yǎng)基加2瓊脂）；預產(chǎn)孢液體培養(yǎng)基（YPACe）:2蛋白胨，1酵母提取物，2醋酸鉀；產(chǎn)孢培養(yǎng)基（KOAC）:2醋酸鉀，（固體培養(yǎng)基加2瓊脂）；萌發(fā)液體培養(yǎng)基YPA（g/dL）:2蛋白胨，1酵母提取物，0.003腺嘌呤；選擇性培養(yǎng)基（SD）（g/dL）:0.67不含氨基酸的酵母氮源，2瓊脂，2葡萄糖，2不含特定氨基酸的氨基酸混合物；大腸桿菌培養(yǎng)基（LB）（g/dL）:0.5 酵母提取物，1胰蛋白胨，1氯化鈉，2瓊脂。

1.1.3 化學突變試劑和緩沖液 本實驗采用甲基磺酸乙酯（EMS）[12]對酵母細胞進行突變，再使用5 g/dL滅菌的硫代硫酸鈉（Sigma）解除突變后的藥物毒性，緩沖液使用滅菌的0.1 mol/L磷酸鈉緩沖液，pH7.0。

1.1.4 儀器與設備 （Pipet Lite XLS）移液槍、（CF16RXⅡ）臺式高速冷凍離心機，購于德國Eppendorf；（BA210）光學顯微鏡，購于美國 GE 公司；（CV334）超聲破碎儀，購于南京新辰生物科技公司。

1.2 方法

1.2.1 突變以及用乙醚篩選突變株 突變參照Fred Winston[12]的方法進行誘變，每 3.0×108個細胞使用150 μL的突變化學試劑EMS在30℃震蕩處理1 h，然后加入100 mL 5 g/dL sodium thiosfate進行解毒處理。

乙醚篩選:產(chǎn)孢后，將孢子懸浮在液體YPAD培養(yǎng)基中于37℃搖床內(nèi)萌發(fā)14 h，滴加乙醚使其終體積分數(shù)13%，在30℃搖床中處理45 min，稀釋1 000倍后涂布在50個固體YPAD培養(yǎng)基上置于25℃恒溫箱內(nèi)4 d以進行后續(xù)實驗。

1.2.2 子囊孢子的制備以及萌發(fā)步驟 在YPAD培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)細胞，上述液體預產(chǎn)孢培養(yǎng)基YPACe培養(yǎng)24 h后，在產(chǎn)孢培養(yǎng)基KOAC中培養(yǎng)1~2 d，收集孢子，加入2 g/dL lyticase,置于30℃搖床中2~3 h,收集孢子，用去離子水洗滌2次，溶于5 mL體積分數(shù)0.5%TritonX-100，使用超聲破碎儀進行破壁處理5 min，用去離子水洗滌2次。在光學顯微鏡下可見97%以上的細胞均為單個的孢子。萌發(fā)的步驟如下:將孢子置于YPA液體培養(yǎng)基于30℃下30 min，再加入葡萄糖至總質(zhì)量濃度為2 g/dL。萌發(fā)率的計算則由每100個細胞計已萌發(fā)孢子數(shù)，測3次取平均值。

1.2.3 四分體孢子的分離 將新鮮的孢子，置于100μL的去離子水中，加0.5μL的lyticase置于30℃下15 min，將YPAD平板在邊緣處劃線，取10 μL的處理液置于一個線內(nèi)的YPAD上，在操作臺內(nèi)吹干處理液，將切孢的針用乙醇處理10 min，在顯微鏡下利用針尖將四分體的孢子分離開來置于該YPAD平板上。由于沒有添加裂解酶的四分體子囊孢子不能通過針尖取到，因此后續(xù)部分實驗處理子囊孢子時先將其分開再放置在一起。

2 結(jié)果與討論

2.1 突變方法的確立

突變流程見圖1，首先對細胞進行化學試劑突變處理，在細胞量回補后，經(jīng)過正常的產(chǎn)孢，在高溫下37℃下萌發(fā)，使得沒有高溫萌發(fā)缺陷的孢子萌發(fā)成正常的營養(yǎng)細胞，而有缺陷的孢子依然保持孢子的結(jié)構，經(jīng)過一定濃度的乙醚處理，將萌發(fā)后的營養(yǎng)細胞殺死，而保留對乙醚有抗性的孢子，然后置于25℃下，缺陷孢子開始萌發(fā)即得到萌發(fā)缺陷初選菌株。本實驗由于完全不能萌發(fā)的突變株不能被篩選到，因此本實驗假設突變株在高溫下不能萌發(fā)而在低溫下能萌發(fā)。其中測試乙醚篩選條件時，經(jīng)過一系列不同濃度乙醚測試，發(fā)現(xiàn)處理以13%終體積分數(shù)的乙醚在30℃下45 min能殺死所有的萌發(fā)細胞，而保留一定數(shù)量的孢子存活。本實驗獲取3×108個酵母細胞，經(jīng)過EMS誘變后，致死率約為50%~70%，最后經(jīng)過乙醚篩選得到300株左右菌株。實驗通過對突變條件的測試，確立了通過化學試劑對釀酒酵母進行突變，結(jié)合利用乙醚篩選突變株的方法，成功獲得了具有萌發(fā)缺陷的突變株。

圖1 突變流程Fig.1 Mutation procedure

篩選最終得到約300株初選菌株，為排除生長缺陷菌株，將此300株菌株置于37℃下培養(yǎng)，其中103株可以生長。而為方便研究萌發(fā)的缺陷，本文主要針對能產(chǎn)孢的菌株以方便后續(xù)的研究，故此排除產(chǎn)孢有缺陷或者單倍體菌株，最后得到32株菌株能產(chǎn)孢的雙倍體菌株。為進一步確認這32株菌株的確有萌發(fā)缺陷，對這些菌株再進行萌發(fā)處理，發(fā)現(xiàn)有明顯萌發(fā)缺陷的只有4株，分別命名為AN120-m5、AN120-m8、AN120-m10、AN120-m17。

表1 篩選量Table 1 Screening volume

2.2 突變株驗證

上述實驗已證明，4株突變株均可以正常產(chǎn)孢，為進一步確認這4株突變株是在萌發(fā)過程中有缺陷，并非生長缺陷突變株，對固體培養(yǎng)基亦做了生長缺陷測試。將野生型和突變株在37℃下培養(yǎng)，由圖 2 可看出 AN120-m8，AN120-m10，AN120-m17相對于野生型來說沒有明顯的生長缺陷，而AN120-m5則表示為輕微生長劣勢，但是能夠在37℃下生長。實驗表明，4株突變株都能在37℃下生長。

圖2 突變株37℃生長狀況Fig.2 Growth of mutants on YPAD plate in 37℃

為確認突變株在萌發(fā)過程中有缺陷，測試突變株在液體培養(yǎng)基內(nèi)的缺陷進行驗證。如圖3（a）所示，經(jīng)過8 h后，野生型孢子在37℃和25℃下均能正常萌發(fā)，而該4株突變株在25℃下和37℃下都有明顯的萌發(fā)缺陷，而尤其特殊的是AN120-m10突變株在25℃下和37℃下萌發(fā)率都極低，說明該突變株的萌發(fā)缺陷非常嚴重。之后，對突變株在固體培養(yǎng)基的缺陷進行驗證。將突變株單個孢子置于固體培養(yǎng)基上，將來自同一子囊的四個孢子放在一行，將6組單孢子組在固體YPAD于25℃中培養(yǎng)3～4 d后，4株突變體在固體培養(yǎng)基上萌發(fā)狀況如圖3（b）所示，能直觀的看到4株突變株在固體培養(yǎng)基上的萌發(fā)缺陷更為嚴重。而各突變株在37℃下除AN120-m17全不萌發(fā)，且AN120-m17萌發(fā)率也極低。并且野生型的單孢子在固體培養(yǎng)基上萌發(fā)只需2 d，而突變型則需要4 d。顯著觀察到的是AN120-m5的單個孢子在固體培養(yǎng)基上于任何溫度下都完全不萌發(fā)。結(jié)合上述實驗數(shù)據(jù)表明，4株突變株在產(chǎn)孢正常，也沒有生長缺陷的情況下，確實是在萌發(fā)過程中有缺陷，其孢子萌發(fā)時間較野生型更長。

圖3 驗證突變株在液體和固體培養(yǎng)基中的萌發(fā)率Fig.3 Germination efficiency of mutants in liquid medium and on solid medium

可見突變體AN120-m5的單個孢子在固體培養(yǎng)基中完全不能萌發(fā)，但是在液體培養(yǎng)基中，卻能夠萌發(fā)，考慮到在液體培養(yǎng)基中孢子的聚集性，于是將其子囊孢子的4個孢子緊緊貼近置于固體培養(yǎng)基YPAD上，發(fā)現(xiàn)萌發(fā)效率和單個孢子相比有所提高，如圖4，這可能是因為在AN120-m5中多個孢子聚集在一起，某種物質(zhì)的生成能誘發(fā)萌發(fā)的發(fā)生，而導致萌發(fā)率提高。

圖4 AN120-m5 4個緊湊挨近的子囊孢子在固體培養(yǎng)基上的萌發(fā)Fig.4 Germination on solid plate of tetrad spores of AN120-m5

2.3 萌發(fā)缺陷穩(wěn)定性驗證

為確保突變株的缺陷穩(wěn)定性，驗證是否單個基因突變發(fā)生在突變株中，對突變株的孢子進行分離，將其與自身突變株的單倍體進行交配，獲得自交雙倍體。測驗結(jié)果由圖5可知，突變體AN120-m8、AN120-m10和AN120-m17的自交后代AN120-m8C、AN120-m3C、AN120-m4D，在 37℃下萌發(fā)率為38%、14%、43%。而由于AN120-m5突變株不能得到單倍體，所以不能交配得到自交雙倍體。實驗顯示，在自交后，萌發(fā)缺陷依然存在，說明突變性狀是穩(wěn)定的。

圖5 自交雙倍體萌發(fā)率Fig.5 Germination efficiency of self-crossed mutant diploid cells

為了進一步驗證萌發(fā)缺陷的穩(wěn)定性，在和野生型單倍體雜交三代后，測試在液體培養(yǎng)基內(nèi)的萌發(fā)率，由圖6可知，同一個平板上切割的雜交雙倍體的孢子，為清楚確認生長良好的菌落確是來自于野生型，取生長良好菌落和野生型單倍體交配，發(fā)現(xiàn)其和野生型孢子萌發(fā)情況相同。實驗證明，萌發(fā)狀況良好的單菌落是來自野生型，而萌發(fā)狀況不良的單菌落則是來自突變型。由圖6可以明顯看到，每個四分體的2個突變型孢子在25℃下經(jīng)過三代雜交后萌發(fā)情況始終較野生型的2個孢子弱，呈現(xiàn)出萌發(fā)缺陷的性狀。由圖7可知AN120-m8、AN120-m10和AN120-m17的第三代雜交雙倍體AN120-G38、AN120-G310、AN120-G317在 37 ℃萌發(fā)率分別為45%、48%和53%，較原始菌株有所提高，但是始終低于野生型。實驗進一步證明，萌發(fā)缺陷穩(wěn)定存在突變型菌株中，不隨著產(chǎn)孢過程中遺傳物質(zhì)的分離3次后消失，顯著表現(xiàn)為野生型與突變型孢子的生長優(yōu)良狀況始終呈現(xiàn)出2∶2的狀態(tài)，進一步證明突變株是單基因突變菌株的可能性很大。

圖6 第三代雜交雙倍體切割孢子Fig.6 Dissection of the third gerneration hybrid diploid cells

圖7 第三代雜交雙倍體萌發(fā)率Fig.7 Germination of the third gerneration hybrid diploid cells

2.4 討論

本實驗室研究利用孢子作為載體進行酶的固定化，將酶固定在孢子壁外層二酪氨酸層內(nèi)以及利用化學方法將酶共價交聯(lián)在去除二酪氨酸層的殼聚糖球體上，得到新型固定化酶型孢子。但是經(jīng)過固定化的孢子其中一個缺陷是孢子遇到營養(yǎng)物質(zhì)將萌發(fā)，為了確保固定化酶的重復使用性，同時利于研究萌發(fā)機制，本研究通過化學試劑對釀酒酵母細胞進行誘變，旨在獲取萌發(fā)缺陷菌株。本實驗篩選方法的特征在于利用孢子對乙醚的抗性，保護了在37℃下未萌發(fā)的突變型孢子，再在25℃下得以萌發(fā)，經(jīng)過進一步篩選，成功地從3×108個細胞中篩選到約300株初選菌株，并且通過各種驗證，最終獲得了4株目的菌株。由于上述突變株在液體培養(yǎng)基中有嚴重的萌發(fā)缺陷，初步表明符合微膠囊的應用條件。

有研究者用切孢技術將四倍體孢子分離[13]，在本研究中，使用顯微鏡和針尖將孢子分離獲得突變體單倍體，不僅直觀看到在固體培養(yǎng)基上突變株的萌發(fā)缺陷更為明顯，并且明顯觀察到AN120-m5突變體單個孢子在固體培養(yǎng)基上完全不能萌發(fā)，這對于后續(xù)篩選突變基因具有重要意義。而該突變體在液體培養(yǎng)基中能萌發(fā)，但是其單個孢子不能在固體培養(yǎng)基上萌發(fā)，并且多個孢子聚集在一起時，其四分體孢子在固體培養(yǎng)基上萌發(fā)率提高，這可能是由于孢子分離的狀態(tài)影響了萌發(fā)的發(fā)生，該突變體的孢子可能只以子囊的形式萌發(fā)，其具體的原因待進一步探究。

為驗證突變株萌發(fā)缺陷的穩(wěn)定性，從而確認突變的來源是否來自單個基因上。在同時測試雜交雙倍體和自交雙倍體的萌發(fā)率后，實驗證明，在與野生型單倍體雜交三代后，其野生型孢子和突變型孢子生長優(yōu)劣狀況始終呈現(xiàn)2∶2的比例，缺陷依然存在，不隨著產(chǎn)孢后遺傳物質(zhì)的分離而消失，證明缺陷穩(wěn)定存在突變株內(nèi)，所以4株突變株是單基因突變菌株有很大的可能性。4株突變株性狀各有不同，而且特別顯著的是AN120-m5的性狀和其余3株有很大差異，至少說明經(jīng)過后續(xù)篩選我們可以獲得2個以上的突變基因。

3 結(jié) 語

本研究成功利用甲基磺酸乙酯進行突變處理，并利用孢子對乙醚的抵抗性確定了一種篩選萌發(fā)突變株的方法，并以此找到了4株在固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基同時具有萌發(fā)缺陷的突變株，并且萌發(fā)缺陷穩(wěn)定存在。由于單基因突變的可能性很大，后續(xù)實驗利用確定找到發(fā)生突變的基因，從而達到敲除突變基因獲得完全不萌發(fā)的突變菌株，并研究用于工業(yè)固定化酶的工程菌株以及為萌發(fā)機制。