活化的Treg細(xì)胞對(duì)NKT細(xì)胞遷移的調(diào)節(jié)作用

盧燕鳴 李亞琴 周文靜 李小燕 于 清

支氣管哮喘(簡(jiǎn)稱(chēng)哮喘)是一種兒童常見(jiàn)的慢性氣道炎癥性疾病，近年來(lái)因環(huán)境污染等因素的影響，其發(fā)病率逐年增高，給患兒及家長(zhǎng)帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)負(fù)擔(dān)。其病理機(jī)制的本質(zhì)是炎癥引起的氣道高反應(yīng)性和氣道重塑[1-2]。且目前普遍認(rèn)為，Th1/Th2失衡是哮喘發(fā)病的關(guān)鍵因素[3-5]。其中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell, Treg)和自然殺傷T細(xì)胞(natural killer T cell, NKT)是兩種重要的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞。Treg細(xì)胞以Foxp3為特征性的標(biāo)記，具有免疫抑制功能。大量的臨床及基礎(chǔ)研究顯示Treg細(xì)胞功能異常導(dǎo)致Th1/Th2失衡是支氣管哮喘發(fā)病的中心環(huán)節(jié)[6-7]。NKT細(xì)胞可同時(shí)表達(dá)NK細(xì)胞標(biāo)志和T細(xì)胞標(biāo)志，被CD1d呈遞的糖脂類(lèi)抗原激活后迅速分泌大量IL-4和IFN-γ。本實(shí)驗(yàn)早期對(duì)52例兒童NKT進(jìn)行分析，結(jié)果顯示支氣管哮喘的外周血NKT水平大幅下降；屋塵螨致敏哮喘小鼠模型中發(fā)現(xiàn)哮喘發(fā)病過(guò)程中脾臟NKT水平也下降；提示哮喘發(fā)病過(guò)程中有顯著的NKT細(xì)胞遷移，過(guò)敏性哮喘與NKT 細(xì)胞失調(diào)相關(guān)[8-9]。

有臨床研究顯示，過(guò)敏性哮喘中NKT可以殺滅Treg細(xì)胞，這可能是哮喘患者Treg細(xì)胞水平低下的原因之一[10]。Thorburn等[11]發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)Treg細(xì)胞可以抑制iNKT，進(jìn)而控制哮喘。我們?cè)趧?dòng)物哮喘實(shí)驗(yàn)中首次發(fā)現(xiàn)，通過(guò)Foxp3基因轉(zhuǎn)移可以活化Treg細(xì)胞，從而抑制iNKT的活化而減輕嗜酸性細(xì)胞的浸潤(rùn)和氣道高反應(yīng)(AHR)[12]。目前有限的數(shù)據(jù)顯示，Treg細(xì)胞和NKT細(xì)胞在哮喘發(fā)病中相互影響，但是二者之間的相互調(diào)節(jié)方式和調(diào)節(jié)機(jī)制尚不清楚?；卮疬@一科學(xué)問(wèn)題，不僅可以幫助我們更準(zhǔn)確地把握哮喘的免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制，而且有可能可以指導(dǎo)我們更精確有效地治療這種疾病。

結(jié)合以上實(shí)驗(yàn)背景及本實(shí)驗(yàn)室早期的研究，本文擬通過(guò)體外共培養(yǎng)Treg細(xì)胞和NKT細(xì)胞，并建立OVA致哮喘小鼠模型在體內(nèi)探索Treg細(xì)胞對(duì)NKT細(xì)胞的調(diào)控作用，尤其是調(diào)節(jié)NKT細(xì)胞遷移/體內(nèi)分布的可能性。

材料和方法

一、材料與試劑

1. 主要試劑: 卵清蛋白(OVA，Ⅴ級(jí))購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；IL-4、IFN-γ 、IL-10及TGF-β ELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司；熒光標(biāo)記抗體(CD4、CD25、CD3、CD161)購(gòu)自美國(guó)BD Bioscience 公司；Foxp3和α-tubulin抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司；RNeasy試劑盒及引物均購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)市售。

2. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物： 實(shí)驗(yàn)所用動(dòng)物為10周齡雄性健康清潔級(jí)BALB/c小鼠，由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作均經(jīng)仁濟(jì)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理及倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1. Treg細(xì)胞、NKT細(xì)胞分選及純化： 參照我們已建立的方法[12]，70目尼龍網(wǎng)分離小鼠脾細(xì)胞，采用免疫磁珠吸附陰性選擇方法，分離CD4+CD25+CD127low細(xì)胞作為T(mén)reg細(xì)胞，分離CD4+CD25-的T細(xì)胞為效應(yīng)T細(xì)胞(Teff細(xì)胞)。制備α-GalCer-CD1d-PE四聚體，而后用anti-PE和anti-TCRβ經(jīng)流式細(xì)胞儀分選表達(dá)CD1d和TCRβ的NKT細(xì)胞，所得NKT細(xì)胞用α-GalCer擴(kuò)增分離。

2. Foxp3修飾Treg細(xì)胞： 表達(dá)小鼠Foxp3的慢病毒由本實(shí)驗(yàn)室早期構(gòu)建成功[12]，用純化的重組慢病毒感染Treg細(xì)胞，Polybrene的濃度為6 μg/ml，細(xì)胞隨機(jī)分組：空白對(duì)照組(Ctrl)；空載體轉(zhuǎn)染組(Le-scr)；Foxp3轉(zhuǎn)染組(Le-Foxp3，MOI=0.5, 1, 2, 5, 10)。測(cè)定轉(zhuǎn)染效率后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析。

3. CFSE標(biāo)記法測(cè)定Treg細(xì)胞對(duì)Teff細(xì)胞增殖的抑制作用： Treg細(xì)胞和Teff細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)液重懸并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/ml。而后將Treg細(xì)胞(Le-scr或Le-Foxp3)和Teff細(xì)胞各100 μl加入包被抗CD3抗體(5 μg/ml)的48孔培養(yǎng)板中，并向每孔加入抗CD28抗體(2 μg/ml)，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)60 h。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組CFSE標(biāo)記的Teff細(xì)胞增殖率(PR)并評(píng)估Treg細(xì)胞對(duì)Teff細(xì)胞增殖的抑制作用。

4. INF-γ，IL-4及TGF-β，IL-10 的檢測(cè)： 各組細(xì)胞經(jīng)相應(yīng)處理后，IL-4、IFN-γ、IL-10及TGF-β的檢測(cè)依據(jù)美國(guó)eBioscience公司提供的ELISA試劑盒檢測(cè)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

5. Treg-NKT體外共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)： Treg細(xì)胞和NKT細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)液重懸并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/ml。24孔Transwell板下室中接種Treg細(xì)胞(Le-scr或Le-Foxp3)，5 μm孔徑的transwell insert中接種NKT細(xì)胞。將培養(yǎng)板置于37 ℃，含5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中混合培養(yǎng)72 h，共培養(yǎng)結(jié)束后將下室的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至流式管，抗體標(biāo)記(anti-CD3和anti-CD161)后經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)NKT細(xì)胞的數(shù)量。而后收獲上清液，檢測(cè)細(xì)胞因子的水平。

6. RT-PCR檢測(cè)Foxp3 mRNA的表達(dá)： RNeasy試劑盒抽提細(xì)胞內(nèi)RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后采用QuantiTect SYBR Green PCR的方法檢測(cè)Foxp3 mRNA的表達(dá)。引物購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司；以α-tubulin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法分析基因的相對(duì)表達(dá)量。

7. Western Blot實(shí)驗(yàn)： 用RIPA于冰上裂解收集細(xì)胞蛋白， BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，調(diào)整各孔上樣蛋白量并按1︰3的比例加入蛋白上樣緩沖液，100 ℃加熱5min變性后用SDS-PAGE進(jìn)行凝膠電泳。之后將蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜，用5%脫脂牛奶室溫條件下封閉90 min。依據(jù)說(shuō)明書(shū)要求先后孵育入一抗和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，撒化學(xué)發(fā)光液于暗室中顯影，定影后沖洗膠片。結(jié)果采用Image J行灰度半定量分析。

8. OVA致小鼠哮喘模型

參照本實(shí)驗(yàn)室已建立的方法制備OVA致小鼠哮喘模型[12]。取32只野生型BALB/c小鼠，按照隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(sham組，只接受PBS處理)、OVA模型組(OVA組)、OVA+Le-scr組(OVA模型小鼠在實(shí)驗(yàn)第15天經(jīng)尾靜脈注射2×106Treg/空載體細(xì)胞)和OVA+Le-scr組(OVA模型小鼠在實(shí)驗(yàn)第15天經(jīng)尾靜脈注射2×106慢病毒修飾的Treg/Foxp3細(xì)胞)。在實(shí)驗(yàn)的第24天收獲小鼠的外周血(麻醉后摘除眼球取血)、脾組織及肺組織，經(jīng)流式細(xì)胞儀分析NKT細(xì)胞的分布情況。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、慢病毒載體轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)

RT-PCR及Western blot 檢測(cè)結(jié)果顯示(圖1A和B)，轉(zhuǎn)染攜帶Foxp3的慢病毒載體可促進(jìn)Treg細(xì)胞中Foxp3的表達(dá)， MOI=2時(shí)，F(xiàn)oxp3的表達(dá)增加顯著(P<0.01)，結(jié)果說(shuō)明Le-Foxp3可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1Le-Foxp3轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)；注：A：RT-PCR檢測(cè)Treg細(xì)胞中Foxp3的表達(dá)；B：Western blot檢測(cè)Treg細(xì)胞中Foxp3的蛋白表達(dá)

二、表達(dá)Foxp3對(duì)Treg細(xì)胞功能的影響

Treg細(xì)胞主要通過(guò)調(diào)控效應(yīng)T細(xì)胞(Teff細(xì)胞)的功能來(lái)實(shí)現(xiàn)其維持機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)的作用，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)共培養(yǎng)表達(dá)Foxp3的Treg細(xì)胞和Teff細(xì)胞來(lái)檢測(cè)表達(dá)Foxp3對(duì)Treg細(xì)胞功能的影響。結(jié)果如圖2A所示，相較于Le-scr組；Le-Foxp3組Teff細(xì)胞的增殖指數(shù)降低， Treg細(xì)胞對(duì)Teff細(xì)胞的抑制率顯著增加。同時(shí)活化的Treg細(xì)胞可分泌細(xì)胞因子IL-10和TGF- β抑制免疫反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)中ELISA的結(jié)果顯示(圖2B)，相較于Le-scr組；Le-Foxp3組IL-10和TGF-β的水平顯著上升。結(jié)果說(shuō)明表達(dá)Foxp3可活化Treg細(xì)胞。

三、表達(dá)Foxp3的Treg細(xì)胞對(duì)NKT細(xì)胞體外遷移和活性的影響

體外共培養(yǎng)Treg細(xì)胞和NKT細(xì)胞，以探討Treg細(xì)胞對(duì)NKT細(xì)胞遷移及活化的調(diào)控作用。共培養(yǎng)結(jié)束后采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)下室中NKT細(xì)胞的數(shù)量。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染Foxp3后，遷移到下室的NKT細(xì)胞由Le-scr組的649.38±153.97減少至221.15±79.36(P<0.05)。RT-PCR和ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上清中IL-4和IFN-γ的水平，結(jié)果顯示(圖3)：相較于Le-scr組，Le-Foxp3組共培養(yǎng)體系上清液中IL-4和IFN-γ的水平顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2表達(dá)Foxp3對(duì)Treg細(xì)胞功能的影響；注：A：CFSE標(biāo)記法檢測(cè)Treg細(xì)胞對(duì)Teff細(xì)胞的增殖抑制作用；B：ELISA檢測(cè)細(xì)胞因子IL-10和TGF- β的水平

圖3RT-PCR(A)和ELISA(B)檢測(cè)表達(dá)Foxp3的Treg細(xì)胞對(duì)NKT細(xì)胞胞內(nèi)因子IL-4和IFN-γ分泌的影響

四、OVA致哮喘小鼠模型中Treg細(xì)胞對(duì)NKT細(xì)胞體內(nèi)分布的影響

本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步引入OVA致哮喘小鼠模型，檢測(cè)哮喘發(fā)病過(guò)程中表達(dá)Foxp3后Treg細(xì)胞對(duì)NKT細(xì)胞體內(nèi)分布的影響。結(jié)果顯示(圖4)，相較于OVA組， OVA+Le-Foxp3組小鼠肺組織中NKT的數(shù)量顯著降低，而外周血及脾臟中NKT的數(shù)量顯著升高。因?qū)嶒?yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，OVA組和OVA+Le-scr組結(jié)果不具有顯著差異，故結(jié)果中未顯示OVA+Le-scr組數(shù)據(jù)。

圖4OVA哮喘模型中Treg細(xì)胞對(duì)NKT細(xì)胞體內(nèi)分布的影響

討 論

本文首先檢測(cè)了體外構(gòu)建的Foxp3病毒載體的轉(zhuǎn)染效率，結(jié)果顯示Treg細(xì)胞中轉(zhuǎn)入Foxp3病毒載體后Foxp3的表達(dá)顯著升高，證明所構(gòu)建的載體可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。Foxp3是Treg細(xì)胞的特征標(biāo)志，也是其最重要的功能分子，大量研究表明高表達(dá)的Foxp3與Treg細(xì)胞免疫抑制功能之間有良好的相關(guān)性[13-14]。本文進(jìn)一步檢測(cè)了直接通過(guò)病毒載體表達(dá)Foxp3對(duì)Treg細(xì)胞功能的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)表達(dá)Foxp3可提高Treg細(xì)胞對(duì)Teff細(xì)胞的增殖抑制率，同時(shí)促進(jìn)Treg細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IL-10和TGF- β。結(jié)果提示通過(guò)體外構(gòu)建Foxp3表達(dá)載體可直接活化Treg細(xì)胞，促進(jìn)其功能的發(fā)揮。

早期有研究提示Treg細(xì)胞及NKT細(xì)胞在哮喘發(fā)病過(guò)程中存在相互調(diào)控作用[10-11]。故而本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外共培養(yǎng)Treg細(xì)胞和NKT 細(xì)胞，研究Treg細(xì)胞對(duì)NKT細(xì)胞功能的影響。Transwell共培養(yǎng)的結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染Foxp3后，遷移到下室的NKT細(xì)胞數(shù)量明顯減少，提示活化的Treg細(xì)胞可抑制NKT細(xì)胞的遷移；此外RT-PCR和ELISA的檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染Foxp3后，共培養(yǎng)體系上清液中IL-4和IFN-γ的水平顯著降低，結(jié)果提示活化的Treg細(xì)胞可抑制NKT細(xì)胞的活化。這些結(jié)果直接證實(shí)了Treg活化后可負(fù)調(diào)控NKT細(xì)胞，與前期的研究具有一致性。此外，哮喘發(fā)病過(guò)程中存在NKT細(xì)胞在不同組織器官之間的遷移/重新分布[15-18]，但目前尚不清楚這一現(xiàn)象是否與Treg細(xì)胞有關(guān)。為進(jìn)一步觀(guān)察在哮喘發(fā)病過(guò)程中Treg細(xì)胞對(duì)NKT細(xì)胞的調(diào)控作用，本實(shí)驗(yàn)研究引入OVA致哮喘小鼠模型，體內(nèi)研究Treg細(xì)胞對(duì)NKT細(xì)胞體內(nèi)分布的影響。結(jié)果顯示，表達(dá)Foxp3可顯著減少OVA致哮喘小鼠肺組織中NKT的數(shù)量，而增加外周血及脾臟中NKT的數(shù)量。提示活化Treg細(xì)胞可調(diào)控哮喘小鼠體內(nèi)NKT細(xì)胞的分布。但是Treg細(xì)胞調(diào)控NKT細(xì)胞的具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步深入的研究。

綜上所述，F(xiàn)oxp3病毒載體修飾可活化體外培養(yǎng)的Treg細(xì)胞，而活化的Treg細(xì)胞可抑制NKT細(xì)胞的活化及體外遷移并影響OVA哮喘模型小鼠NKT細(xì)胞的體內(nèi)分布。