探討DHEA對(duì)閉鎖卵泡形成的機(jī)制

張海甄，翁嘉敏，史惠媚，吳佳琳，朱文俊，高梓博，楊舒含，梁卓潼，陳家旭*

（暨南大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510000）

目的:本研究重點(diǎn)著重于對(duì)比小鼠的體重、卵巢形態(tài)、卵巢體積和相對(duì)質(zhì)量、卵巢組織學(xué)變化、發(fā)情周期變化、小鼠性激素水平和卵巢組織學(xué)變化作為指標(biāo)，并采用C56 BL/6小鼠結(jié)合DHEA皮下注射法建立小鼠閉鎖卵泡模型。根據(jù)受體蛋白的表達(dá)水平評(píng)價(jià)，以選擇合適的小鼠模型研究閉鎖卵泡。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

從廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（許可證號(hào)：SYXK(粵)2013-0034)購(gòu)入的32只28天齡雌性C57BL/6小鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)4天，至32天齡開(kāi)始注射。其中，將以10只為一組隨機(jī)分成實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)對(duì)照組和空白對(duì)照組。

1.2 DHEA建模法

實(shí)驗(yàn)組小鼠頸部皮下注射脫氫表雄酮(DHEA)6 mg/100 g+0.2 ml注射油，注射14天后處死并觀察結(jié)果。結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組在病理組織檢查下存在閉鎖卵泡。

1.3 小鼠血清性激素水平

使用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒中測(cè)量血清性激素水平。建模塊小鼠的典型激素變化是LH、FSH降低、LH/FSH升高。從而可見(jiàn)脫氫表雄酮能誘導(dǎo)高雄激素(AR)狀態(tài)，符合鹿特丹高雄激素的診斷標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)組小鼠P水平下降，提示無(wú)排卵，人閉鎖卵泡一致。在閉鎖卵泡中，LH升高是P介導(dǎo)的LH負(fù)反饋，DHEA實(shí)驗(yàn)組血清T升高，主要用于腎上腺雄激素源性雄激素所致的閉鎖卵泡。DHEA實(shí)驗(yàn)組的血液FSH水平適合于阻斷毛囊中高水平的雌激素。見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠血清中性激素水平對(duì)照

1.4 標(biāo)本的采集和處理

在第14天，稱(chēng)重所有小鼠，然后用眼球取血。將血清儲(chǔ)存在-80℃，從背面掏出雙側(cè)卵巢，用卡尺丈量長(zhǎng)度（A），寬度（B）和厚度（C）。卵巢的一側(cè)固定在4%多聚甲醛溶液中，另一側(cè)固定在卵巢。 用PBS沖洗并儲(chǔ)存在-80℃儲(chǔ)存。

1.5 卵巢組織學(xué)檢查

石蠟包埋小鼠卵巢最大平面作為待檢平面，每個(gè)蠟塊切兩次，厚度為4 μm一塊，以HE染色。

1.6 卵巢中受體蛋白檢測(cè)

采用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)雄激素受體（AR）和黃體生成素受體（LHR）在小鼠卵巢中的表達(dá)。Western blot檢測(cè)各組卵巢AR和LHR的相對(duì)表達(dá)。

2 結(jié) 果

（1）小鼠一般情況：正常組反應(yīng)以至身體機(jī)能正常；反之建模塊的小鼠反應(yīng)遲鈍，體毛正常，拉便稀。

（2）小鼠體重和發(fā)情周期的變化：DHEA實(shí)驗(yàn)組小鼠體重增加（P＞0.05），實(shí)驗(yàn)組小鼠發(fā)情周期變化非常不規(guī)律，執(zhí)行當(dāng)天發(fā)情周期沒(méi)有完全消失。

（3）卵巢的形態(tài)、組織學(xué)和相對(duì)質(zhì)量等變化：在DHEA實(shí)驗(yàn)組中，卵巢表面輪廓蒼白，卵泡泡囊突起不明顯。從組織學(xué)切片中可見(jiàn)實(shí)驗(yàn)組小鼠卵巢上有閉鎖卵泡形成。

（4）小鼠性激素水平的變化：DHEA實(shí)驗(yàn)組血清中T濃度和FSH濃度顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。

（5）受體蛋白在小鼠卵巢中的表達(dá):DHEA實(shí)驗(yàn)組小鼠卵巢AR的表達(dá)(P＜0.05)。

3 討 論

多囊卵巢綜合征（PCOS）是現(xiàn)今婦女常見(jiàn)的內(nèi)分泌疾病，具有高度異質(zhì)性。其涉及關(guān)系到遺傳學(xué)，內(nèi)分泌，糖脂代謝，蛋白質(zhì)代謝和局部卵巢調(diào)節(jié)因子等異常所致。多囊卵巢綜合征患者病人多見(jiàn)肥胖，表現(xiàn)為脂質(zhì)代謝紊亂。病理生理學(xué)和臨床表示多樣化，因此病因尚不明確。但其中特征可有組織學(xué)顯示多囊性卵巢改變，慢性無(wú)排卵的臨床表現(xiàn); 內(nèi)分泌學(xué)的特征在于雄激素過(guò)多癥和血清LH升高，頭發(fā)，痤瘡和不育的臨床表現(xiàn)。血清學(xué)上顯示其與高胰島素血癥和胰島素抵抗有關(guān)。其中亦可刺激雄激素(AR)分泌，提高雄激素利用率，可間接影響PCOS女性患者的生殖功能。臨床表現(xiàn)為胚胎植入和妊娠受損。PCOS的短期問(wèn)題是直接影響婦女生育，形成生殖障礙；長(zhǎng)久后不單會(huì)使婦女生殖出現(xiàn)障礙，更大的問(wèn)題是能使患者代謝紊亂。PCOS與糖尿病，高血壓和子宮內(nèi)膜癌等長(zhǎng)期并發(fā)癥有明顯的關(guān)聯(lián)，且損害亦為嚴(yán)重。由于目前病因不明，因此現(xiàn)今尚無(wú)明確有效的治療方法，這在婦科內(nèi)分泌領(lǐng)域一直是一個(gè)難點(diǎn)和熱點(diǎn)問(wèn)題。他們大多數(shù)都是根據(jù)藥物治療，幾乎沒(méi)有手術(shù)，臨床困難，并建立適當(dāng)?shù)膭?dòng)物。研究PCOS機(jī)制和診斷策略的模型是非常必要的。

由于PCOS的發(fā)病機(jī)制及機(jī)理尚不清楚，因此很難創(chuàng)設(shè)一種能夠模擬PCOS所有病理特征的動(dòng)物模型。PCOS的一些動(dòng)物模型只能從一個(gè)或多個(gè)方面模擬PCOS的病理特征，甚至一些模型似乎與PCOS的模型相反。因此，這些動(dòng)物模型并未很好地應(yīng)用在臨床方面。 選擇合適的動(dòng)物模型對(duì)于PCOS的研究非常重要。

3.1 PCOS模型中DHEA造模的理論依據(jù)

這種方法的原理是部分鎖定PCOS患者在青春期出現(xiàn)閉鎖卵泡的癥狀，即血清DHEA水平升高所致。推測(cè)DHEA升高可能是閉鎖卵泡的一個(gè)重要原因。DHEA是孕烯醇酮經(jīng)Δ5途徑轉(zhuǎn)化雄烯二酮的中間的產(chǎn)出物。其中能通過(guò)外源途徑提高DHEA程度，從而可以提高雄烯二酮水平，最后使高酮水平出現(xiàn)等血液病理學(xué)特征。

3.2 小鼠卵巢中受體蛋白的AR和LHR表達(dá)量與閉鎖卵泡之間的關(guān)系

閉鎖卵泡典型的內(nèi)分泌特征是高雄激素(AR)血癥和高血清促黃體生成素(LH)水平，其分別與卵巢中的受體蛋白AR和LHR結(jié)合。

活性濾泡小鼠的促性腺激素受體活躍是其中一個(gè)關(guān)鍵。LaPolt等提出該標(biāo)記的表達(dá)顯著降低其增殖和分化的能力，表現(xiàn)為顆粒細(xì)胞層的減少。

LHR主要分布在小鼠卵巢中顆粒細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和內(nèi)細(xì)胞以及外細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。動(dòng)態(tài)濾泡能使小鼠血清中LH水平上升從而增加濾泡細(xì)胞中的LHR的表達(dá)，導(dǎo)致顆粒細(xì)胞分化和卵泡發(fā)育阻滯，可作為連續(xù)性無(wú)排卵的指標(biāo)。

總括而言，從本次實(shí)驗(yàn)中可得出的結(jié)果提示AR和LHR均參與了小鼠卵巢多囊卵巢以及閉鎖卵泡的形成，由此可作為閉鎖卵泡模型中蛋白質(zhì)水平評(píng)價(jià)的指標(biāo)。