Cx43在造血調(diào)控及重建中的作用*

張陽(yáng)敏， 羅筱衍， 徐燕霞， 周東明， 張立瑩， 傅晉翔

(蘇州大學(xué)附二院血液科， 江蘇 蘇州215004)

間隙連接(gap junction，GJ)是普遍存在的包含細(xì)胞內(nèi)通道的特殊胞膜區(qū)域，是細(xì)胞間連接方式的一種，由間隙連接蛋白(connexin，Cx)所構(gòu)成[1]。相鄰細(xì)胞間通過(guò)間隙連接所介導(dǎo)的細(xì)胞間隙連接(gap junction intercellular communication，GJIC)進(jìn)行信息和能量物質(zhì)交換，參與細(xì)胞間物質(zhì)交換的代謝偶聯(lián)和電信號(hào)傳遞的電偶聯(lián)，對(duì)細(xì)胞的新陳代謝、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、增殖和分化等生理過(guò)程起著重要的調(diào)控作用[2]。完整GJ是由相鄰胞膜上2個(gè)半通道相互作用而形成的細(xì)胞間空間，由不同Cx組成的GJ具有不同的通透特性，目前已證實(shí)人類(lèi)細(xì)胞共表達(dá)21種Cx，而骨髓中僅表達(dá)3種Cx分子，即Cx31、Cx43和Cx45。造血細(xì)胞則以表達(dá)Cx43為主[3]，小鼠敲除Cx43基因后，通常因心臟發(fā)育異常在出生后數(shù)小時(shí)內(nèi)死亡而不利于進(jìn)一步研究[4-5]。本研究使用Cx43 loxP/loxP和Lyz-Cre/+轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行雜交，篩選出僅在造血系統(tǒng)條件性敲除Cx43基因(Cx43-/-)的小鼠作為動(dòng)物模型，并對(duì)骨髓和髓外造血器官及外周血進(jìn)行鑒定，進(jìn)一步研究Cx43在維持造血細(xì)胞自我更新及功能穩(wěn)定中的作用，為臨床用藥提供理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)及繁殖

Cx43 loxP/loxP 小鼠購(gòu)自美國(guó)Jackson實(shí)驗(yàn)室；Lyz-Cre/+小鼠購(gòu)自江蘇省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。引種后置蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)院無(wú)特定病原體級(jí)動(dòng)物房中進(jìn)行飼養(yǎng)，室內(nèi)溫度18～24 ℃，濕度40%～60%。小鼠籠盒每周進(jìn)行1次消毒處理，墊料、飼料均經(jīng)過(guò)[60Co-γ]照射滅菌處理，飲水經(jīng)過(guò)高溫高壓滅菌處理。繁殖采用雌雄比例2 ∶1同籠的方式進(jìn)行，每籠3只小鼠，每胎平均約產(chǎn)6～8只幼鼠，幼鼠出生23～30 d(體重10～12 g)后進(jìn)行斷奶、分籠。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1小鼠的基因型鑒定 小鼠基因型的鑒定參考報(bào)道[6]的方法選用小鼠尾部組織，出生7 d編號(hào)后剪取尾尖 1 cm，置無(wú)菌試管中，液氮保存，備用。按北京天根生化科技有限公司生產(chǎn)的組織基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)抽提DNA，并測(cè)量吸光度(A)值，后采用常規(guī)PCR法分析其基因型。檢測(cè)的引物如下, loxP的上游引物序列為5’-CTTTGACTCTGATTACAGAGCTTAA-3’，下游引物序列為5’-GTCTCACTGTTACTTAACAGCTTGA-3’；Cre的上游引物序列為5’-CCCAGAAATGCCAGATTACG-3’，下游引物序列為5’-CTTGGGCT -GCCAGAATTTCTC-3’。loxP純合僅有580 bp條帶，loxP雜合則有580 bp和490 bp 2條條帶，野生型(Cx43+/+，即不含loxP位點(diǎn))僅有490 bp條帶，即loxP/loxP=580 bp，wt/wt=490 bp，wt/loxP=490 bp+580 bp；基因組有Cre插入則出現(xiàn)700 bp的條帶，否則沒(méi)有條帶。

2.2小鼠不同組織中Cx43基因表達(dá)變化的檢測(cè) 分別收集Cx43-/-小鼠(KO組)和雜合子小鼠(loxP組)外周血、骨髓、肝臟、脾臟、腎臟和心臟等組織，按RNeasy Mini Kit 試劑盒(Qiagen)操作步驟抽取總MRNA。按SensiScript RT Kit 試劑盒(Qiagen)操作步驟逆轉(zhuǎn)錄cDNA第一鏈。取1 μL 逆轉(zhuǎn)錄的cDNA產(chǎn)物，用β-actin引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，取擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈(GelDoc1000，Bio-Rad)下觀測(cè)，確定cDNA是否逆轉(zhuǎn)錄成功。Cx43的上游引物序列為5’-CCCACCTTTGTGTCTTCCAT-3’，下游引物序列為5’-TTGCCTCCCTGATGCTAACT-3’；GAPDH的上游引物序列為5’-GGTGGTCTCCTCTGACTTCAACA-3’，下游引物序列為5’-GTGGTCGTTGAGGGCAATG-3’。qPCR檢測(cè)不同組織Cx43的表達(dá)。qPCR總反應(yīng)體系(20 μL)：SYBR(GenePharma)10 μL，cDNA 2 μL，上、下游引物各0.4 μL，無(wú)核酸酶水7.2 μL。每個(gè)樣本重復(fù)做3次，反應(yīng)條件為95 ℃ 3 min ；95 ℃ 12 s、62 ℃40 s， 45個(gè)循環(huán)；以GAPDH作為內(nèi)參照，由公式2-ΔΔCt計(jì)算Cx43 mRNA在KO組和loxP組小鼠中的相對(duì)表達(dá)量。

2.3小鼠骨髓造血細(xì)胞分離及鑒定 6～8周齡Cx43-/-及Cx43+/+小鼠各8只，體重18～20 g，經(jīng)眼球取血，處死后置于75%乙醇中消毒,無(wú)菌條件下分離雙側(cè)股骨。股骨經(jīng)反復(fù)沖洗后，所得細(xì)胞懸液通過(guò)4號(hào)針尖，使其成為單個(gè)細(xì)胞懸液。所得骨髓細(xì)胞用PBS液洗滌2次。所得細(xì)胞經(jīng)計(jì)數(shù)及臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞存活率后備用。

2.45-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)處理及骨髓細(xì)胞分析 6～8 周齡Cx43-/-及Cx43+/+小鼠各10只，體重18～20 g，取2種小鼠各5只按125 mg/kg分別從尾靜脈注入溶于生理鹽水的5-FU，另5只為對(duì)照組，僅予同等量的生理鹽水。在化療前及化療后第5和10及15 天經(jīng)眼球后取血100 μL，測(cè)定其白細(xì)胞、血小板及血紅蛋白。

2.5骨髓移植實(shí)驗(yàn)Cx43-/-及Cx43+/+小鼠各10只，體重18～20 g，分別給予7.5 Gy(60Co-γ)的致死量照射，劑量率1 Gy/min，照射后6 h分別予事先準(zhǔn)備就序的骨髓細(xì)胞，按每只3×106的數(shù)量尾靜脈注入。2周后處死小鼠檢測(cè)造血及免疫細(xì)胞的重建情況。收集血液，并分離股骨和脛骨，除少量固定后切片外，收集其骨髓細(xì)胞，所有細(xì)胞經(jīng)NH4Cl處理溶解紅細(xì)胞，并與抗Fcg II和III受體(CD16/32，clone 2.4G2，Pharmingen)共同孵育15 min后，經(jīng)無(wú)鈣、鎂PBS洗滌后，與PE、FITC或APC標(biāo)記的單抗孵育30 min后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。選用單抗如下：CD45R(clone RA3-6B2)、 Gr-1(clone RB6-8C5)、CD4(clone GK1.5)、CD8a(clone 53-6.7)、TCRαβ(clone H57-597)、 Mac-1(clone M1/70)、抗sIgM、TER119(Ly-76)、 Sca-1(clone D7)及CD117(clone 2B8)，單抗及對(duì)照均購(gòu)自Pharmingen。

2.6體外造血細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn) 分離上述移植小鼠骨髓細(xì)胞，采用甲基纖維素半固體培養(yǎng)，簡(jiǎn)述如下：將預(yù)制的2%甲基纖維素、2倍濃度RPMI-1640培養(yǎng)基、30%胎牛血清及2×109/L小鼠骨髓細(xì)胞充分混均，使其成終濃度為1%甲基纖維素、15%胎牛血清及2×108/L細(xì)胞的混合物，加入細(xì)胞因子如下：CFU-GM所用細(xì)胞因子為GM-CSF(20 μg/L)、SCF(100 μg/L)、IL-3(20 μg/L)；CFU-E 所用細(xì)胞因子為EPO、IL-3(20 μg/L) 。接種于6 孔板, 每孔2 mL，置含5 % CO2、飽和濕度、37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)第14 天 計(jì)數(shù)集落數(shù)，細(xì)胞數(shù)≥50為集落。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，行Mann-WhitneyU檢驗(yàn)和Student’st檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 Cx43基因敲除小鼠的繁殖及鑒定

親代Cx43 loxP/loxP小鼠與Lyz-Cre/+小鼠交配產(chǎn)生的F1代小鼠經(jīng)PCR共檢出2種基因型，即Cx43 loxP/-_Lyz-Cre/+和Cx43 loxP/-，各占約50%。Cx43 loxP/-_Lyz-Cre/+小鼠與Cx43 loxP/loxP小鼠雜交，其子代經(jīng)PCR鑒定共有4種基因型，即 Cx43 loxP/loxP_Lyz-Cre/+、Cx43 loxP/-_Lyz-Cre/+、Cx43 loxP/loxP和Cx43 loxP/-，各占約25%。子代中Cx43 loxP/loxP_Lyz-Cre/+為純合子，即Cx43-/-小鼠，見(jiàn)圖1，Cx43 loxP/-_Lyz-Cre/+為雜合子小鼠，均可為今后進(jìn)一步研究骨髓中Cx43基因作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。

2 Cx43基因敲除對(duì)小鼠其它器官的影響

對(duì)Cx43-/-小鼠其它組織或器官進(jìn)行分析顯示，本研究采用的條件性基因敲除技術(shù)可選擇性敲除造血系統(tǒng)中Cx43基因的表達(dá)，其中外周血細(xì)胞中無(wú)Cx43表達(dá)，骨髓中仍有極少量的Cx43表達(dá)，可能是骨髓中的非造血細(xì)胞污染所致，而參與造血的脾臟和肝臟中Cx43的表達(dá)也顯著下調(diào)(P<0.01)。心臟Cx43表達(dá)則無(wú)影響，腎臟Cx43則有所上調(diào)，見(jiàn)圖2。

3 Cx43-/-小鼠經(jīng)5-FU處理后造血恢復(fù)緩慢

造血系統(tǒng)Cx43基因敲除的小鼠成年后外周血象分析并無(wú)明顯異常，但化療后小鼠的造血恢復(fù)顯著減緩，受損明顯。在藥物作用后10 d，野生型小鼠的血象已開(kāi)始恢復(fù)，至15 d時(shí)已接近正常水平，而Cx43-/-小鼠則無(wú)明顯的恢復(fù)跡象，其血紅蛋白、白細(xì)胞及血小板仍處低位，2者差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01)，見(jiàn)圖3。體外集落實(shí)驗(yàn)也證實(shí)Cx43-/-小鼠造血干/祖細(xì)胞增殖能力下降，其CFU-GM或CFU-E集落數(shù)均明顯少于野生型小鼠(P<0.01)，提示Cx43-/-小鼠骨髓造血細(xì)胞增殖受損，造血系統(tǒng)應(yīng)急能力下降，從而使造血重建延緩，見(jiàn)圖4。

Figure 1. The expression ofCx43 gene in hybrid mice as determined by PCR assay. M: marker; Cre: products ofCregene; loxP: products ofloxPgene. The number represented for the mice screened in this study.n=138.

圖1PCR法篩選和鑒定Cx43-/-和Cx43+/+小鼠

Figure 2.The relative mRNA expression of Cx43 from different tissues ofCx43-/-andCx43+/+mice determined by qPCR.Mean±SD.n=6.**P<0.01vsCx43+/+group.

圖2qPCR法檢測(cè)Cx43-/-小鼠不同組織中Cx43表達(dá)

4 Cx43-/-小鼠免疫細(xì)胞發(fā)育異常

Cx43-/-小鼠在骨髓移植后其外周血細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)分析提示其免疫細(xì)胞發(fā)育異常，外周血中CD4+CD8+雙陽(yáng)性細(xì)胞比例較野生型小鼠增多(P<0.05)，但CD4+T細(xì)胞則顯著減少(P<0.01)，尤其是TCRαβ亞群細(xì)胞減少最為明顯(P<0.01)。同樣，B細(xì)胞發(fā)育也受影響，外周血中CD45R+sIgM-細(xì)胞亞群比例與野生型小鼠相比顯著減少(P<0.01)，見(jiàn)圖5。

Figure 3.The peripheral blood cell counts ofCx43-/-andCx43+/+mice before and at different time points post 5-FU administration. Mean±SD.n=10.**P<0.01vsCx43-/-group.

圖3Cx43-/-和Cx43+/+小鼠經(jīng)5-FU處理后不同時(shí)點(diǎn)的血象變化

5 Cx43-/-小鼠經(jīng)5-FU處理或骨髓細(xì)胞移植后骨髓造血細(xì)胞減少

與野生型小鼠對(duì)比，Cx43-/-小鼠無(wú)論化療或移植后其骨髓造血功能重建均延遲，14 d時(shí)骨髓切片及涂片均證實(shí)其骨髓中造血細(xì)胞增生程度明顯低于野生型小鼠，脂肪組織顯著增多，見(jiàn)圖6。Cx43-/-小鼠骨髓細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其骨髓中Lin-/c-Kit+/Sca-1+細(xì)胞亞群與野生型小鼠相比差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，其T、B淋巴細(xì)胞與外周血檢測(cè)結(jié)果相似，但B系CD45R+sIgM-細(xì)胞亞群和CD4+T細(xì)胞亞群則顯著減少(P<0.01)，提示敲除造血細(xì)胞Cx43基因后，盡管造血/干祖細(xì)胞數(shù)量未見(jiàn)明顯減少，但其增殖明顯減緩，致使造血重建延遲并使其體液和細(xì)胞免疫功能受損。

Figure 4.Colony-forming-unit (CFU) content of bone marrow cells inCx43-/-andCx43+/+mice at 14 d post bone marrow transplantation. Mean±SD.n=6.**P<0.01vsCx43-/-group.

圖4移植后第14天Cx43-/-和Cx43+/+小鼠骨髓中集落形成變化

Figure 5.The proportion changes of T and B lineage cells subgroups inCx43 knock out/wild type mice. Mean±SD.n=8.*P<0.05,**P<0.01vsCx43-/-group.

圖5Cx43-/-和Cx43+/+小鼠外周血中T和B淋巴細(xì)胞數(shù)量變化

討 論

已確認(rèn)人類(lèi)不同組織中表達(dá)數(shù)十個(gè)不同亞型的Cx，不同基因缺陷可導(dǎo)致不同的疾病[7]。Presley等[8]結(jié)果顯示Cx43對(duì)正常造血的支持尤為重要，是骨髓基質(zhì)參與調(diào)控造血干/祖細(xì)胞生長(zhǎng)的重要環(huán)節(jié)。在本研究中，我們采用條件性基因敲除技術(shù)選擇性敲除造血細(xì)胞中Cx43基因表達(dá)，經(jīng)篩選建立獲得Cx43基因表達(dá)缺失的小鼠模型，采用qPCR證實(shí)Cx43-/-小鼠骨髓造血細(xì)胞不表達(dá)該分子，且參與造血的相關(guān)組織如肝臟和脾臟中Cx43基因表達(dá)也顯著下調(diào)，其它部位Cx43表達(dá)與對(duì)照相似，提示采用本方案所獲Cx43-/-小鼠模型是可靠的。

Figure 6.Bone marrow biopsy with HE staining at 14 d post bone marrow transplantation ofCx43-/-andCx43+/+mice.

圖6移植后第14天Cx43+/+和Cx43-/-小鼠骨髓切片HE染色的形態(tài)學(xué)變化

現(xiàn)有的研究[9-11]發(fā)現(xiàn)Cx43在多種腫瘤細(xì)胞中呈高表達(dá)，并與細(xì)胞的遷移和藥物敏感性相關(guān)。我們先前的研究也發(fā)現(xiàn)Cx43分子通過(guò)與骨髓基質(zhì)細(xì)胞的相互作用影響多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞遷移、增殖和耐藥性[12-14]。盡管有證據(jù)[15]表明Cx43表達(dá)是維持正常造血所必需，但骨髓中何種細(xì)胞表達(dá)的Cx43發(fā)揮關(guān)鍵作用尚未確定。本研究采用Cx43-/-小鼠模型，在化療及移植層面分別觀察了Cx43基因敲除對(duì)骨髓造血重建的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該類(lèi)小鼠成年后外周血無(wú)異常，但經(jīng)5-FU處理后，其血象恢復(fù)緩慢，提示其造血應(yīng)急能力減弱。移植實(shí)驗(yàn)也有相似結(jié)果，有趣的是該類(lèi)小鼠骨髓細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)分析并未發(fā)現(xiàn)其造血干/祖細(xì)胞亞群即Lin-/ c-Kit+/Sca-1+較野生型小鼠有明顯減少。同時(shí)，體外集落試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Cx43-/-小鼠骨髓細(xì)胞CFU-GM或CFU-E集落數(shù)均明顯少于野生型小鼠，提示Cx43-/-小鼠骨髓造血細(xì)胞增殖受損，從而使造血重建延緩。Foss等[16]采用Cx43基因敲除的雜合子小鼠(Cx43-/+)進(jìn)行研究時(shí)也有相似發(fā)現(xiàn)。本研究結(jié)果證實(shí)造血細(xì)胞表達(dá)的Cx43分子與骨髓微環(huán)境中其它細(xì)胞形成的GJ在維持造血細(xì)胞增殖、分化中具重要作用。

免疫系統(tǒng)發(fā)育成熟是機(jī)體抵抗外源微生物入侵的重要保障，本研究證實(shí)Cx43分子在免疫細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中具重要作用，Cx43-/-小鼠經(jīng)化療或移植后其外周血免疫細(xì)胞異常，與野生型小鼠相比，其CD4+T細(xì)胞顯著減少，尤其是TCRαβ亞群細(xì)胞減少最為明顯，但CD4+CD8+雙陽(yáng)性細(xì)胞則增多。對(duì)B細(xì)胞的分析也有類(lèi)似結(jié)果，外周血中CD45R+sIgM-細(xì)胞亞群比例與野生型小鼠相比顯著減少。研究證實(shí)[17-19]骨髓基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)Cx43，而表達(dá)Cx43的造血干/祖細(xì)胞可與基質(zhì)細(xì)胞相互作用，通過(guò)旁分泌或自分泌的形式調(diào)節(jié)造血干/祖細(xì)胞的增殖與分化，并最終影響免疫細(xì)胞的發(fā)育與成熟。鑒此，本研究結(jié)果證實(shí)敲除造血系統(tǒng)中Cx43基因后，盡管造血干/祖細(xì)胞數(shù)量未見(jiàn)明顯減少，但增殖明顯減緩，應(yīng)急能力減弱，致使造血重建延遲的同時(shí)尚可使其免疫功能受損。