miR-130b在膠質(zhì)瘤對(duì)替莫唑胺耐藥中的作用*

張 靜， 周永剛， 舒俊斌， 李曉波， 呂曉俊， 葉汝勇， 李正在

(1永康市第一人民醫(yī)院神經(jīng)外科， 浙江 金華 321300； 2浙江省腫瘤醫(yī)院腦外科， 浙江 杭州 310022)

目前國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的膠質(zhì)瘤有效的治療方案是根治性手術(shù)治療配合術(shù)后放化療，但即便接受正規(guī)的內(nèi)外科聯(lián)合治療，其中位生存期也不超過(guò)12個(gè)月[1-2]。替莫唑胺(temozolomide，TMZ)作為第2代烷化劑，可通過(guò)誘導(dǎo)鳥(niǎo)嘌呤殘基的甲基化從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，TMZ結(jié)合放療治療膠質(zhì)瘤較單獨(dú)放療可明顯改善膠質(zhì)瘤患者預(yù)后，目前已成為膠質(zhì)瘤治療中的標(biāo)準(zhǔn)化療藥物。但僅有不超過(guò)一半膠質(zhì)瘤患者對(duì)TMZ敏感，機(jī)體先天及獲得性耐藥是制約患者對(duì)TMZ化療效果的關(guān)鍵原因。因此，尋找能有效抑制膠質(zhì)瘤對(duì)TMZ耐藥的治療手段一直是當(dāng)前神經(jīng)外科領(lǐng)域的重要研究領(lǐng)域[3-4]。

微小RNA(microRMA，miRNAs，miR)作為一組內(nèi)生的非編碼序列，可通過(guò)與目的基因3’-UTRs的不完全配對(duì)從而誘導(dǎo)目的基因mRNA降解。當(dāng)前研究發(fā)現(xiàn),miRNAs所調(diào)控的靶基因在包括細(xì)胞增長(zhǎng)、分化及轉(zhuǎn)移在內(nèi)的多種病理生理過(guò)程中扮演著重要的角色[5]。近來(lái)研究表明,miRNAs在腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物耐藥中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，例如miR-873可通過(guò)靶向調(diào)控Bcl-2從而改善膠質(zhì)瘤對(duì)順鉑的耐藥性[6]，而miR-16可通過(guò)調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡從而改善膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)TMZ的耐藥性[7]，繼而表明miRNAs可作為一種有效改善膠質(zhì)瘤耐藥性的調(diào)節(jié)劑從而用于膠質(zhì)瘤臨床治療。目前miR-130b在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)以及與膠質(zhì)瘤耐藥性是否存在一定相關(guān)性尚未可知。本次研究將探討miR-130b與膠質(zhì)瘤對(duì)TMZ獲得性耐藥的關(guān)系及其可能的作用機(jī)制，為膠質(zhì)瘤的防治研究提供有益的實(shí)驗(yàn)參考，造福于膠質(zhì)瘤患者健康。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞和試劑

膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251、SHG-44和U87購(gòu)自上海細(xì)胞生物研究所。DMEM高糖培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自杭州四季青公司；含EDTA胰蛋白酶購(gòu)自中國(guó)吉諾公司；TMZ購(gòu)自Schering-Plough；Bay 11-7082購(gòu)自Sigma；LipofectamineTM2000購(gòu)自Life Technologies；miR-130b及內(nèi)參照U6的引物和探針由廣州銳博生物公司設(shè)計(jì)合成；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒購(gòu)自ABI；miR-130b mimics和miR-130b inhibitor及其陰性對(duì)照mimics NC和inhibitor NC均購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司；DMSO、CCK-8試劑盒和Annexin V/碘化丙啶(propidium iodide,PI)凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒和RIPA裂解液購(gòu)自北京中山生物工程公司；螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Promega；電泳遷移率變動(dòng)分析(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)試劑盒購(gòu)自Pierce；抗腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)和Bcl-2抗體購(gòu)自Epitomics；抗X連鎖凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein, XIAP)、survivin和β-actin抗體購(gòu)自Santa Cruz。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) U251、SHG-44和U87細(xì)胞均培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基中，DMEM培養(yǎng)基中均添加10%的胎牛血清，細(xì)胞均置于37 ℃、5% CO2的飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中，當(dāng)細(xì)胞貼壁鋪滿80%～90%視野時(shí)，使用0.25%含EDTA的胰蛋白酶消化傳代。

2.2不同濃度TMZ的配制 TMZ在pH<5時(shí)保持穩(wěn)定，而當(dāng)pH>7時(shí)易分解。TMZ為脂溶性，使用DMSO將TMZ溶解。將100 mg原藥TMZ加入10 mL的DMSO中，待其完全溶解后再經(jīng)0.22 μm的微孔濾膜過(guò)濾除菌后，配制成1 g/L的母液，避光保存于4 ℃冰箱內(nèi)，臨使用時(shí)將母液置于37 ℃水浴箱內(nèi)溶解后再添加DMEM培養(yǎng)基稀釋成所需濃度，控制DMSO終濃度保持在0.1%以下，該濃度對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)明顯影響。使TMZ梯度濃度為1 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、60 μmol/L、80 μmol/L和100 μmol/L，現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.3CCK-8法檢測(cè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞活力及測(cè)定IC50值 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的膠質(zhì)瘤細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液后接種于96孔板中，每孔2×104個(gè)細(xì)胞，并調(diào)整每孔接種細(xì)胞懸液量為100 μL，每組細(xì)胞設(shè)立5個(gè)復(fù)孔，加入含TMZ的DMEM完全培養(yǎng)基液(0～1 000 μmol/L)，將細(xì)胞培養(yǎng)板置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，于細(xì)胞孵育48 h后每孔加入CCK-8溶液10 μL，再次將培養(yǎng)板放置在細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1 h，最后在酶標(biāo)儀的490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(A)值。橫坐標(biāo)為不同濃度TMZ，縱坐標(biāo)為細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，繪制不同劑量-細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率曲線圖，通過(guò)SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件的Probit過(guò)程計(jì)算出IC50。

2.4建立對(duì)TMZ耐藥的膠質(zhì)瘤細(xì)胞株 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞，通過(guò)梯度遞增培養(yǎng)基中TMZ濃度，結(jié)合參考文獻(xiàn)中得出較為合理的TMZ耐藥性誘導(dǎo)濃度梯度為1 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、60 μmol/L、80 μmol/L和100 μmol/L，誘導(dǎo)期間每隔3 d 更換TMZ培養(yǎng)液1次。首先添加濃度為1 μmol/L的TMZ培養(yǎng)基，待細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定2周后開(kāi)始增加TMZ藥物濃度，每個(gè)濃度維持10 d 左右，6個(gè)月后即可誘導(dǎo)出對(duì)濃度為20 μmol/L的TMZ耐藥的細(xì)胞株，將其命名為U251/TR細(xì)胞株，為了維持U251/TR細(xì)胞的耐藥性保持穩(wěn)定，培養(yǎng)耐藥細(xì)胞的培養(yǎng)基為含20 μmol/L TMZ的完全培養(yǎng)基。U251/TR細(xì)胞株的耐藥指數(shù)(resistance factor, RF)=IC50(U251/TR)/IC50(U251)。

2.5細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期膠質(zhì)瘤細(xì)胞，用完全培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液并調(diào)整濃度為5×109/L，將細(xì)胞懸液接種至6孔板中，每孔100 μL，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，待細(xì)胞融合至70%～80%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。根據(jù)LipofectamineTM2000 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，實(shí)驗(yàn)分為4組：mimics NC組,每孔U251/TR細(xì)胞加入100 nmol的mimics NC及5 μL 轉(zhuǎn)染試劑；miR-130b mimics組,每孔U251/TR細(xì)胞加入100 nmol的miR-130b mimics及5 μL 轉(zhuǎn)染試劑；inhibitor NC組,每孔U251細(xì)胞加入100 nmol的inhibitor NC及5 μL 轉(zhuǎn)染試劑；miR-130b inhibitor組,每孔U251細(xì)胞加入100 nmol的miR-130b inhibitor及5 μL 轉(zhuǎn)染試劑。轉(zhuǎn)染后48 h收集細(xì)胞行RT-qPCR檢測(cè)，確定轉(zhuǎn)染效率后再進(jìn)行細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)。

2.6RT-qPCR檢測(cè)miR-130b 的表達(dá) 在轉(zhuǎn)染后的膠質(zhì)瘤細(xì)胞中用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA，RNA濃度由超微量分光光度計(jì)檢測(cè)，逆轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR過(guò)程嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，設(shè)置U6作為內(nèi)參照，通過(guò)2-ΔΔCt法計(jì)算miR-130b的相對(duì)表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

2.7流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U251/TR和U251細(xì)胞，經(jīng)冰PBS緩沖液洗滌3次，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106～1×107/L，加入50 μL Binding Buffer和2.5 μL Annexin V試劑(20 mg/L)在室溫下避光反應(yīng)30 min，再添加5 μL PI和100 μL Binding Buffer在室溫下避光反應(yīng)5 min，立即使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行定量檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

2.8螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè) 將重組螢光素酶報(bào)告載體Mut-psiCHECK-TNF-α-3’UTR和WT-psiCHECK-TNF-α-3’UTR共轉(zhuǎn)染入U(xiǎn)251細(xì)胞中，再分別將miRNA-130b inhibitor和inhibitor NC轉(zhuǎn)染至U251細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48 h后收獲細(xì)胞，按螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)提供的方法對(duì)樣品螢光素酶活性進(jìn)行檢測(cè)，每組樣本設(shè)5個(gè)復(fù)孔。螢光素酶相對(duì)活性=螢火蟲(chóng)螢光素酶發(fā)光強(qiáng)度/海腎螢光素酶發(fā)光強(qiáng)度。

2.9EMSA檢測(cè)NF-κB活性 按照EMSA試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)，使用細(xì)胞裂解液處理細(xì)胞后，再使用BSA法對(duì)各組細(xì)胞蛋白含量進(jìn)行測(cè)定。采用雙鏈寡核酸NF-κB序列探針(sense: 5’-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3’; antisense: 5’-GCCTGGGAAA-GTCCCCTCAACCTGA-3’)，6.5%非變性聚丙烯酰胺凝膠100 V預(yù)電泳60 min，待溴酚藍(lán)泳動(dòng)為3/4全長(zhǎng)時(shí)停止電泳，再將帶正電的尼龍膜和膠同時(shí)夾入電泳轉(zhuǎn)移槽進(jìn)行印跡轉(zhuǎn)移，反應(yīng)條件為380 mA轉(zhuǎn)移30 min。將膜置于濾紙上吸干水分后轉(zhuǎn)移至紫外燈下交聯(lián)15 min，在封閉液和平衡液中于室溫下分別反應(yīng)20 min，經(jīng)化學(xué)發(fā)光和X線曝光后拍照。用Quantity One 4.6.2軟件(Bio-Rad)對(duì)圖形進(jìn)行灰度掃描，灰度值越高表示NF-κB激活程度越高。

2.10Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá) 膠質(zhì)瘤細(xì)胞提取蛋白后經(jīng)按BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總蛋白，每份樣品使用20 μg蛋白質(zhì)，使用10% SDS-PAGE后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，在4 ℃下使用5%脫脂奶粉封閉過(guò)夜，硝酸纖維素膜經(jīng) I 抗和 II 抗反應(yīng)后滴加新鮮配制的ECL化學(xué)發(fā)光液顯色、曝光和顯影。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有本次實(shí)驗(yàn)所得的計(jì)量數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。采用單因素方差分析(one-way ANOVA)及SNK-q法分析總體及總體中兩樣本均數(shù)之間差異。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 不同濃度TMZ對(duì)不同膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用

CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力結(jié)果表明，TMZ對(duì)體外U251、SHG-44和U87細(xì)胞均有不同程度的生長(zhǎng)抑制作用，隨著TMZ濃度的增加，其生長(zhǎng)抑制作用更強(qiáng),見(jiàn)表1。通過(guò)Probit過(guò)程計(jì)算得出，TMZ對(duì)不同膠質(zhì)瘤細(xì)胞株(U251、SHG-44和U87)的IC50分別為54.8、94.8和149.6 μmol/L，選擇TMZ的IC50相對(duì)較低的U251細(xì)胞作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2 體外耐TMZ膠質(zhì)瘤細(xì)胞株(U251/TR)的建立

歷時(shí)6個(gè)月，經(jīng)過(guò)8個(gè)濃度梯度誘導(dǎo)，成功培養(yǎng)對(duì)TMZ耐藥的U251/TR細(xì)胞株，利用CCK-8法檢測(cè)TMZ對(duì)U251/TR細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用，檢測(cè)結(jié)果如表1。TMZ對(duì)U251/TR細(xì)胞的IC50為465.4 μmol/L，RF為8.1。

表1CCK-8法檢測(cè)不同濃度TMZ對(duì)不同膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用

Table 1.The viability of glioma cell lines was analyzed by CCK-8 assay after incubated with TMZ at increasing concentrations (Avalue. Mean±SD.n=5)

TMZ (μmol/L)U251 cellsSHG-44 cellsU87 cellsU251/TR cells01.485±0.3571.652±0.3431.581±0.4160.927±0.19651.047±0.2861.428±0.2411.286±0.3610.907±0.246500.915±0.2471.206±0.2491.207±0.2490.867±0.2181000.804±0.2480.987±0.2681.176±0.3130.843±0.1692500.517±0.1380.876±0.1960.954±0.2320.784±0.1585000.377±0.0860.547±0.1130.685±0.1270.724±0.1281 0000.261±0.0370.449±0.1240.559±0.1470.531±0.104

3 轉(zhuǎn)染miR-130b mimics和miR-130b inhibitor對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中miR-130b表達(dá)的影響

首先運(yùn)用RT-qPCR方法檢測(cè)miR-130b在體外U251細(xì)胞和U251/TR細(xì)胞中的表達(dá)，結(jié)果表明miR-130b在U251細(xì)胞中的表達(dá)較在U251/TR細(xì)胞中明顯上調(diào)，兩者相差7.51倍(P<0.01)，見(jiàn)圖1A。

將miR-130b mimics轉(zhuǎn)染至U251/TR細(xì)胞，同時(shí)將miR-130b inhibitor轉(zhuǎn)染至U251細(xì)胞48 h后，利用RT-qPCR檢測(cè)細(xì)胞中miR-130b的表達(dá)，結(jié)果表明miR-130b mimics組U251/TR細(xì)胞中的miR-130b表達(dá)明顯高于mimics NC組(P<0.01)，而miR-130b inhibitor組U251細(xì)胞中的miR-130b表達(dá)水平顯著低于inhibitor NC組(P<0.01)，見(jiàn)圖1B。

Figure 1.The levels of miR-130b in U251 and U251/TR cells (A) and the relative expression of miR-130b in glioma cells after transfected with miR-130b mimics, miR-130b inhibitor or their matched negative controls (B). Mean±SD.n=3.**P<0.01vsU251 cells;▲▲P<0.01vsmimics NC group;■■P<0.1vsinhibitor NC group.

圖1RT-qPCR檢測(cè)miR-130b在親代U251細(xì)胞和耐藥型U251/TR細(xì)胞中的表達(dá)差異

4 過(guò)表達(dá)/敲減miR-130b表達(dá)對(duì)體外膠質(zhì)瘤細(xì)胞TMZ治療反應(yīng)的影響

將U251/TR細(xì)胞接種于96孔板中，每孔5 000個(gè)細(xì)胞，分為mimics NC組、mimics NC+TMZ組和miR-130b mimics+TMZ組，TMZ作用濃度為100 μmol/L，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后使用CCK-8法檢測(cè)A值，mimics NC組、mimics NC+TMZ組和miR-130b mimics+TMZ組細(xì)胞的A值分別為0.945±0.368、0.849±0.231和0.337±0.085，miR-130b mimics+TMZ組的A值顯著低于mimics NC+TMZ組(P<0.01)；使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)3組細(xì)胞的凋亡率，結(jié)果顯示，miR-130b mimics+TMZ組的凋亡率顯著高于mimics NC+TMZ組(P<0.01),見(jiàn)圖2A。

將U251細(xì)胞接種于96孔板中，每孔5 000個(gè)細(xì)胞，分為inhibitor NC組、inhibitor NC+TMZ組和miR-130b inhibitor+TMZ組，TMZ作用濃度為100 μmol/L，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后使用CCK-8法檢測(cè)A值，inhibitor NC組、inhibitor NC+TMZ組和miR-130b inhibitor+TMZ組細(xì)胞的A值分別為1.462±0.428、0.823±0.247和1.448±0.367，miR-130b inhibitor+TMZ組的A值顯著高于inhibitor NC+TMZ組(P<0.01)；使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)3組細(xì)胞凋亡率，結(jié)果顯示, miR-130b inhibitor+TMZ組的凋亡率顯著低于inhi-bitor NC+TMZ組(P<0.01)，見(jiàn)圖2B。

Figure 2.Up-regulation of miR-130b promoted apoptosis induced by TMZ in U251/TR cells (A), while the apoptosis in U251 cells induced by TMZ was inhibited by down-regulation of miR-130b (B). Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmimics NC group;▲▲P<0.01vsmimics NC+TMZ group;■■P<0.01vsinhibitor NC group;●●P<0.01vsinhibitor NC+TMZ group.

圖2流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染miR-130bmimics或miR-130binhibitor對(duì)體外膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的影響

5 驗(yàn)證miR-130b的直接靶基因TNF-α

為了研究miR-130b在膠質(zhì)瘤細(xì)胞血管新生中的可能作用機(jī)制，通過(guò)檢索miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)獲得hsa-miR-130b序列，并通過(guò)運(yùn)用生物信息學(xué)工具RNAhybrid 2.1、TargetScan和PicTar對(duì)miR-130b的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)。結(jié)果顯示，發(fā)現(xiàn)TNF-α與hsa-miR-130b存在潛在的結(jié)合位點(diǎn)，見(jiàn)圖3A。為此，我們進(jìn)一步應(yīng)用螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)體外U251細(xì)胞中miR-130b對(duì)TNF-α的調(diào)控作用進(jìn)行驗(yàn)證。

螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)結(jié)果顯示，與共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-psiCHECK-TNF-α-3’UTR和inhibitor NC后細(xì)胞螢光素酶活性相比較，在U251細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-psiCHECK-TNF-α-3’UTR和miR-130b inhibitor后的螢光素酶活性值明顯升高(P<0.01)；而共轉(zhuǎn)染Mut-psiCHECK-TNF-α-3’UTR和miR-130b inhibitor后細(xì)胞螢光素酶活性值與共轉(zhuǎn)染Mut-psiCHECK-TNF-α-3’UTR和inhibitor NC后的細(xì)胞螢光素酶活性值相比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見(jiàn)圖3B。

將miR-130b mimics和miR-130b inhibitor分別轉(zhuǎn)染U251/TR和U251細(xì)胞后，應(yīng)用Western blot檢測(cè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中TNF-α蛋白的表達(dá)，結(jié)果表明miR-130b mimics組的U251/TR細(xì)胞中TNF-α的表達(dá)明顯低于mimics NC組(P<0.01)，而miR-130b inhibitor組U251細(xì)胞中的TNF-α表達(dá)水平顯著高于inhibitor NC組(P<0.01),見(jiàn)圖3C。以上結(jié)果表明，miRNA-130b可與TNF-α的3’-UTR結(jié)合，TNF-α是miR-130b的直接靶向基因。

Figure 3.Prediction and validation of the target gene of miR-130b. A: the putative miR-130b binding sequences in the 3’-UTR of TNF-α; B: the relative luciferase activity was measured in the U251 cells after co-transfection of TNF-α-3’-UTR-WT or TNF-α-3’-UTR-Mut with miR-130b inhibitor or appropriate negative control; C: the protein level of TNF-α was examined in the U251 cells by Western blot. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsinhibitor NC group;▲▲P<0.01vsmimics NC group.

圖3生物信息學(xué)工具預(yù)測(cè)及熒光素酶報(bào)告檢測(cè)系統(tǒng)驗(yàn)證miR-130b的靶基因

6 過(guò)表達(dá)/敲減miR-130b表達(dá)對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中NF-κB活性及Bcl-2、XIAP和survivin蛋白表達(dá)的影響

將miR-130b mimics和mimics NC轉(zhuǎn)染至U251/TR細(xì)胞，同時(shí)將miR-130b inhibitor和inhibitor NC轉(zhuǎn)染至U251細(xì)胞48 h后，利用EMSA檢測(cè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中NF-κB活性，結(jié)果顯示，miR-130b mimics組U251/TR細(xì)胞中NF-κB活性較mimics NC組明顯減弱(P<0.01)，而miR-130b inhibitor組U251細(xì)胞中NF-κB活性顯著強(qiáng)于inhibitor NC組(P<0.01)，見(jiàn)圖4A。

miR-130b mimics和miR-130b inhibitor轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細(xì)胞48 h 后，應(yīng)用Western blot法檢測(cè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中蛋白表達(dá)水平， 結(jié)果表明，miR-130b mimics組U251/TR細(xì)胞中的Bcl-2、XIAP和survivin的表達(dá)水平明顯低于mimics NC組(P<0.01)，而miR-130b inhibitor組U251細(xì)胞中Bcl-2、XIAP和survivin的表達(dá)水平顯著高于inhibitor NC組(P<0.01)，見(jiàn)圖4B。

7 NF-κB抑制劑Bay 11-7082對(duì)體外膠質(zhì)瘤細(xì)胞TMZ治療反應(yīng)的影響

將U251/TR細(xì)胞分為對(duì)照組、TMZ組和Bay 11-7082+TMZ組，TMZ作用濃度為100 μmol/L，Bay 11-7082作用濃度為5 μmol/L，藥物作用結(jié)束后使用CCK-8法和流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)3組細(xì)胞活力和凋亡。

對(duì)照組、TMZ組和Bay 11-7082+TMZ組細(xì)胞的A值分別為1.049±0.177、0.874±0.080和0.552±0.094，Bay 11-7082+TMZ組的A值顯著低于TMZ組(P<0.01)；如圖5所示，Bay 11-7082+TMZ組的凋亡率顯著高于TMZ組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

討 論

膠質(zhì)瘤患者術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移最主要的原因是由于惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞異?；钴S的增殖活性和高侵襲性引起。膠質(zhì)瘤細(xì)胞失去控制的過(guò)度增殖可升高顱內(nèi)壓，從而導(dǎo)致膠質(zhì)瘤患者嚴(yán)重的并發(fā)癥-腦疝，對(duì)患者生命安全造成嚴(yán)重影響。而隨著第2代烷化劑TMZ的出現(xiàn)，使得當(dāng)前膠質(zhì)瘤的治療取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步，然而，僅有不超過(guò)一半患者對(duì)TMZ等化療藥敏感，使得TMZ對(duì)膠質(zhì)瘤患者的生存延長(zhǎng)作用十分有限。血腦屏障和膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的獲得性耐藥是制約患者化療效果的關(guān)鍵原因。因此，膠質(zhì)瘤對(duì)TMZ耐藥是當(dāng)前化療急需解決的難題[8-10]。為研究膠質(zhì)瘤對(duì)TMZ耐藥的具體機(jī)制，本研究通過(guò)參考既往文獻(xiàn)[11]，利用梯度遞增濃度法建立體外耐TMZ膠質(zhì)瘤細(xì)胞株。所建立的耐藥型細(xì)胞株對(duì)TMZ的IC50值較其親代細(xì)胞明顯升高，其RI指數(shù)為8.1，屬中度耐藥；凍存后的U251/TR細(xì)胞經(jīng)復(fù)蘇后仍能保持生長(zhǎng)和傳代；同時(shí)U251/TR細(xì)胞在脫離TMZ作用后，該細(xì)胞株對(duì)TMZ的耐藥指數(shù)有所下降，但仍維持于80%～90%之間。以上結(jié)果均表明，本次研究所建立的耐藥細(xì)胞株的耐藥性較為穩(wěn)定，適合進(jìn)行下一步機(jī)制研究。

Figure 4.The EMSA analysis for determining NF-κΒ activation in miR-130b-overexpressing U251/TR cells and miR-130b-knockdown U251 cells (A), and Western blot results of endogenous Bcl-2, XIAP and survivin in glioma cells (B). Mean±SD.n=3.▲▲P<0.01vsmimics NC group;##P<0.01vsinhibitor group.

圖4轉(zhuǎn)染miR-130bmimics和miR-130binhibitor至膠質(zhì)瘤細(xì)胞后，EMSA檢測(cè)NF-κB活性，Westernblot法檢測(cè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中Bcl-2、XIAP和survivin蛋白表達(dá)

最新研究表明，miRNAs在腫瘤細(xì)胞耐藥過(guò)程中發(fā)揮了重要調(diào)節(jié)作用，但目前尚未有miR-130b與膠質(zhì)瘤耐藥的相關(guān)性研究報(bào)道。為此，本研究探討了miR-130b在親代膠質(zhì)瘤細(xì)胞和耐藥型膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的差異，檢測(cè)結(jié)果表明，miR-130b在U251/TR細(xì)胞中的表達(dá)較U251細(xì)胞明顯降低，這種表達(dá)差異提示miR-130b可能與膠質(zhì)瘤細(xì)胞獲得性耐藥存在一定聯(lián)系，但這種聯(lián)系究竟是通過(guò)何種作用方式來(lái)實(shí)現(xiàn)尚未可知，為此，下一步我們將特異性上調(diào)及下調(diào)miR-130b在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)來(lái)觀察miR-130b對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及凋亡的影響。

CCK-8結(jié)果表明，膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染miR-130b inhibitor可有效削弱TMZ對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。另外，而上調(diào)miR-130b在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)后可有效增強(qiáng)TMZ對(duì)體外膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用，提示miR-130b在體外膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。另外，進(jìn)一步研究miR-130b與體外膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，下調(diào)miR-130b在體外U251細(xì)胞中的表達(dá)可有效抑制細(xì)胞凋亡，而上調(diào)miR-130b的表達(dá)可增強(qiáng)TMZ對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用，從而表明miR-130b可能作為耐藥型膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)TMZ治療的增敏劑。然而，關(guān)于miR-130b調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞獲得性耐藥的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制尚不清楚。

Figure 5.The apoptosis in U251/TR cells induced by TMZ was promoted by the addition of Bay 11-7082. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsTMZ group.

圖5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Bay11-7082對(duì)TMZ誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的影響

TNF-α在大量良性疾病和惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中扮演著關(guān)鍵調(diào)節(jié)器的作用[12]；最新證據(jù)顯示，TNF-α在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平要顯著高于正常腦組織，同時(shí)與膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲密切相關(guān)[13]；TNF-α還可通過(guò)激活ERK、JNK、Akt和NF-κB等下游信號(hào)通路，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞耐藥[14]；另外，TNF-α還可誘導(dǎo)ABCG2 在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的抵抗作用[15]。然而，迄今為止尚未有miR-130b和TNF-α的生物學(xué)功能研究報(bào)道。在我們的研究中，下調(diào)miR-130b的表達(dá)可促進(jìn)TNF-α在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)，而TNF-α在miR-130b高表達(dá)的U251細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著降低。此外，螢光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，miR-130b直接靶向調(diào)控TNF-α。研究表明，NF-κB在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用，并且在人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，NF-κB 可以通過(guò)誘導(dǎo)MGMT等凋亡抑制蛋白的表達(dá)，從而誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)烷化劑耐藥[16]。TNF-α作為NF-κB的主要活化因子之一，TNF-α激活NF-κB的作用機(jī)制已有詳盡的研究[17]。本次研究表明，miR-130b在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的異位表達(dá)可抑制NF-κB活性，而敲除miR-130b的表達(dá)可增強(qiáng)NF-κB活性；此外，我們發(fā)現(xiàn)miR-130b的表達(dá)下調(diào)可增加NF-κB的下游蛋白，如Bcl-2、XIAP和survivin的表達(dá)，這些凋亡抑制蛋白與腫瘤細(xì)胞耐藥關(guān)系密切[18]；另外，使用Bay 11-7082特異性阻斷NF-κB信號(hào)通路可增強(qiáng)TMZ對(duì)耐藥型膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用，進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)NF-κB信號(hào)通路在膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)TMZ獲得性耐藥中的重要作用。至此，我們發(fā)現(xiàn)miR-130b調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞耐藥的調(diào)控機(jī)制是通過(guò)TNF-α/NF-κB這一信號(hào)通道來(lái)實(shí)現(xiàn)，TNF-α/NF-κB信號(hào)通道可誘導(dǎo)下游凋亡抑制蛋白的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞耐藥性，miR-130b/TNF-α/NF-κB信號(hào)通路可能在調(diào)控膠質(zhì)瘤對(duì)TMZ獲得性耐藥中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

在當(dāng)前研究背景下，我們發(fā)現(xiàn)在U251細(xì)胞中，miR-130b可直接靶向調(diào)控 TNF-α，從而進(jìn)一步調(diào)控NF-κB信號(hào)通道而控制膠質(zhì)瘤對(duì)TMZ的獲得性耐藥。從機(jī)理上看，下調(diào)miR-130b可促進(jìn)TNF-α的高水平表達(dá)，并有助于激活NF-κB并促進(jìn)其下游蛋白Bcl-2、XIAP和survivin的表達(dá)。但本文的不足在于僅用一種膠質(zhì)瘤細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，miR-130b是否在其它膠質(zhì)瘤細(xì)胞耐藥中發(fā)揮一定作用還未明確；同時(shí)TNF-α在調(diào)控體外U251/TR細(xì)胞耐藥中發(fā)揮主導(dǎo)作用還是部分作用尚未可知；另外，TMZ在誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞耐藥過(guò)程中是直接還是間接調(diào)控miR-130b還有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)明確?？傊琺iR-130b/TNF-α/NF-κB通路可能是未來(lái)膠質(zhì)瘤治療的具體作用靶點(diǎn)，從而在揭示膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制及治療上具有一定積極意義。