結(jié)腸癌組織中STC1的表達及其與腫瘤微環(huán)境的關(guān)系*

張 健， 趙素平， 王宗艷， 劉瑞廷, 陳 倩， 呂颯美， 史麗萍， 王國榮

(陜西省人民醫(yī)院 1消化內(nèi)二科， 2普外一科， 陜西 西安 710068)

結(jié)腸癌是常見的消化道腫瘤，是第3大最常見的惡性腫瘤，具有高侵襲性和高死亡率等特點。而目前針對結(jié)腸癌的治療，主要是手術(shù)聯(lián)合術(shù)后輔助化療和靶向治療的方式，但治療效果不盡如人意，因此鑒定開發(fā)新的結(jié)腸癌治療靶標具有重大意義[1]。斯鈣素1(stanniocalcin 1，STC1)是一類糖蛋白，最初在硬骨魚中發(fā)現(xiàn)，在多種組織中普遍表達，參與機體多種生理過程[2]。先前的研究發(fā)現(xiàn)，STC1在肝癌、肺癌和乳腺癌的發(fā)展過程中發(fā)揮重要的作用[3-4]，而目前關(guān)于STC1在結(jié)腸癌中的研究還鮮有報道，同時有研究發(fā)現(xiàn)缺氧和炎癥等結(jié)腸腫瘤組織微環(huán)境是影響結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的重要因素[5]。大量的報道證明在實體瘤中普遍存在缺氧，而缺氧還能夠通過調(diào)控大量靶基因參與結(jié)腸癌的耐藥過程[6]。同時值得注意的是，大量的研究表明炎癥組織存在轉(zhuǎn)化為腫瘤的可能，尤其在結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展過程中炎癥更是扮演著重要的角色。本研究探究STC1在結(jié)腸癌中表達的意義及其與患者預(yù)后的關(guān)系，并進一步分析STC1與結(jié)腸癌腫瘤微環(huán)境的關(guān)系，為結(jié)腸癌的診斷與治療提供理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 細胞株及標本

人結(jié)腸癌細胞株HT-29購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(American Tissue Culture Collection，ATCC)，并由供應(yīng)商進行鑒定。結(jié)腸癌及癌旁臨床標本來自我院2010年1月～2015年6月外科手術(shù)切除的結(jié)腸癌組織及遠切端結(jié)腸黏膜組織，同期我院結(jié)腸鏡檢查術(shù)中活檢所取正常結(jié)腸黏膜標本為對照，標本采集后迅速置于液氮中速凍，后儲存于超低溫冰箱保存?zhèn)溆?。取樣前，患者均未進行化療、放療及其它治療手段。標本的采集事先獲得病人同意，并簽署病人知情同意書。

2 主要試劑

McCoy’s 5A 細胞培養(yǎng)基購自Thermo；胎牛血清、青霉素和鏈霉素購自Gibco；RNA提取試劑TRIzol購自Roche；cDNA第一鏈合成試劑盒和RT-qPCR試劑盒均購自上海翊圣生物技術(shù)有限公司；熒光定量PCR引物根據(jù)引物設(shè)計網(wǎng)站(http://primer3.ut.ee/)設(shè)計，并由上海生工有限公司合成，引物序列見表1；缺氧誘導(dǎo)化學(xué)試劑CoCl2購自Selleck；抗STC1和GAPDH抗體以及辣根過氧化物酶標記的 II 抗均購于武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；其它化學(xué)試劑均購自國藥化學(xué)試劑有限公司。

表1RT-qPCR引物序列

Table 1.The sequences of the primers for RT-qPCR

NamePrimer sequence (5-3)Product (bp)STC1Forward AGCACAATCAGAGACAGCCT206 Reverse TGGGATGTGCGTTTGATGTGGAPDHForward GGATTTGGTCGTATTGGGCG240Reverse ATCGCCCCACTTGATTTTGG

3 主要方法

3.1組織中總RNA 的提取 組織中總RNA的提取過程如下：組織中加入2 mL的RNA提取試劑TRIzol，經(jīng)充分勻漿后，置于-80 ℃凍融1次，促進細胞裂解，加入2 mL 的氯仿，上下劇烈振蕩1 min，室溫靜置15 min，12 000 r/min于4 ℃離心20 min。取上清于新的離心管中，加入等量體積預(yù)冷的異丙醇，振蕩30 s，室溫靜置 10 min，12 000 r/min于4 ℃離心20 min，白色沉淀即為提取的總RNA。吸去上清，加入75% 乙醇 (DEPC處理過的去離子水)清洗2次，置于超凈工作臺風(fēng)干。加入經(jīng)DEPC處理的去離子水50 μL，測定RNA濃度，保證RNA純度。

3.2RT-qPCR實驗 cDNA第一鏈的合成采用的是cDNA第一鏈合成試劑盒，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系的配制如下：總RNA(1 μg)，2×HifairTMSuperMix (10 μL)，補充RNase free ddH2O至20 μL。反應(yīng)程序為 25 ℃ 5 min、50 ℃ 60 min、85 ℃ 5 min。反應(yīng)結(jié)束后，測定產(chǎn)物濃度，進行qPCR。采用HieffTMqPCR SYBR? Green Master Mix(High Rox Plus)試劑盒，反應(yīng)體系冰上配制：逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 (100 ng), 正反向引物 (0.2 μmol/L)，SYBR? Green Master Mix(25 μL)，補足RNase free ddH2O至50 μL。充分混勻后低速離心，進行PCR反應(yīng)。預(yù)變性：95 ℃，2 min；循環(huán)程序 (循環(huán)數(shù)40)： 95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s;熔解曲線：95 ℃ 15 s、 60 ℃ 60 s、95 ℃ 15 s。數(shù)據(jù)分析采用2-ΔΔCt方法計算。

3.3UALCAN數(shù)據(jù)庫分析 UALCAN數(shù)據(jù)庫是用于分析腫瘤轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的開放式網(wǎng)絡(luò)資源[7]。使用UALCAN(http://ualcan.path.uab.edu/index.html)分析STC1 mRNA在結(jié)腸癌組織中的表達情況進行預(yù)后分析, 分析的結(jié)腸癌樣本來源于TCGA數(shù)據(jù)庫。

3.4Oncomine數(shù)據(jù)庫分析 利用包含大量腫瘤樣本數(shù)據(jù)的Oncomine數(shù)據(jù)庫(https://www.oncomine.org)分析STC1 mRNA在結(jié)腸癌組織中的表達水平，結(jié)合UALCAN數(shù)據(jù)庫，確認STC1基因的mRNA表達在結(jié)腸癌組織及其正常組織中的表達差異。

3.5細胞培養(yǎng) HT-29細胞培養(yǎng)在含有10%胎牛血清的McCoy’s 5A 細胞培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中添加1×105U/L的青霉素和100 mg/L的鏈霉素。正常培養(yǎng)條件設(shè)置為 5% CO2、37 ℃。

3.6構(gòu)建結(jié)腸癌細胞缺氧微環(huán)境 使用150 μmol/L化學(xué)誘導(dǎo)劑CoCl2處理結(jié)腸癌細胞6 h和12 h以及1% O2培養(yǎng)HT-29細胞6 h和12 h。誘導(dǎo)時間結(jié)束后，收集樣品：吸去培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS 緩沖液洗2次，提取細胞中總RNA，進行RT-qPCR，分析缺氧條件下STC1蛋白及mRNA的表達變化。

3.7脂多糖 (lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)結(jié)腸癌細胞炎癥反應(yīng) 使用100 μg/L的LPS分別處理結(jié)腸癌HT-29細胞 2、6和12 h，提取細胞總RNA，分析炎癥環(huán)境下，結(jié)腸癌細胞HT-29中STC1蛋白及mRNA的表達情況。

3.8TIMER數(shù)據(jù)庫分析 運用TIMER(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)[8]分析結(jié)腸癌組織中STC1mRNA表達水平與缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF1α)mRNA及其下游基因金屬蛋白酶組織抑制劑1(tissue inhibitor of metalloproteinase 1,TIMP1)mRNA的相關(guān)性；分析結(jié)腸癌組織中STC1 mRNA表達及其與炎癥免疫調(diào)節(jié)因子白細胞介素(interleukin,IL)-6、IL-8、IL-10、IL-1β、轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)、TGF-β2、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)及趨化因子CCL3和CCL4 mRNA表達的相關(guān)性。

3.9Western blot實驗檢測蛋白水平 收集細胞于離心管中，加入RIPA裂解液，振蕩數(shù)次，冰上裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，吸取上清，采用BCA法進行蛋白定量。制備好的樣品進行SDS-PAGE，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%的脫脂奶粉室溫封閉1 h后4 ℃下過夜孵育 I抗，TBST溶液洗滌3次，室溫孵育 II抗1 h。TBST 溶液再次洗滌3次，最后采用ECL增強發(fā)光液進行顯影檢測。蛋白表達定量采用Quantity One軟件。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

用GraphPad Prism 5統(tǒng)計軟件以及R語言軟件進行作圖分析。數(shù)據(jù)庫中結(jié)腸癌組織與正常結(jié)腸組織中STC1的mRNA表達，采用R包edgeR包來構(gòu)建表達矩陣，評估基因表達數(shù)據(jù)，表達數(shù)據(jù)取log2對數(shù)，兩組間差異采用雙尾法t檢驗；STC1基因表達水平與患者生存期分析采用Kaplan-Meier模型進行分析，兩組間生存率的比較采用Log-Rank檢驗，結(jié)腸癌組織中STC1基因與HIF1α等基因表達的相關(guān)性分析采用皮爾森相關(guān)性系數(shù)分析(Pearson’s correlation)，置信區(qū)間選擇95%；手術(shù)收集的20例結(jié)腸癌患者樣本以及缺氧、脂多糖誘導(dǎo)處理結(jié)腸癌細胞的RT-qPCR及Western blot數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，兩組間比較采用雙尾法t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 STC1在結(jié)腸癌組織中的表達

通過UALCAN數(shù)據(jù)庫，調(diào)取41例的正常結(jié)腸組織以及286例結(jié)腸癌組織，通過分析發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中STC1的表達顯著高于正常結(jié)腸組織(P<0.01)，見圖1A。進一步通過Oncomine數(shù)據(jù)庫調(diào)取Skrzypczak樣本信息，分析24例的正常結(jié)腸組織和36例結(jié)腸癌組織中STC1的表達，顯示結(jié)腸癌組織中STC1的表達是正常結(jié)腸組織的3.54倍(P<0.01)，見圖1B。對臨床收集的20例結(jié)腸癌患者組織行RT-qPCR實驗發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌組織(T)與對應(yīng)癌旁組織(N)中STC1的mRNA表達水平的比值(T/N)如下：T/N≥10的有6例，T/N≥5且<10的有4例(T/N≥5，癌組織的STC1顯著高于癌旁組織)；T/N≥1.25且<5的有6例(1.25≤T/N<5，被認為癌組織STC1表達顯著高于癌旁組織)；T/N≥0.75且<1.25的有2例(0.75≤T/N<1.25,被認為癌組織與癌旁組織中的STC1表達水平的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性)，T/N<0.75的有2例(T/N<0.75,被認為癌組織中的STC1的表達顯著低于癌旁組織)，見圖1C。同時，Western blot檢測了4例結(jié)腸癌患者組織中STC1的蛋白表達水平，發(fā)現(xiàn)在癌組織中STC1蛋白表達水平顯著高于癌旁組織(P<0.01)，這一結(jié)果與RT-qPCR的結(jié)果類似，見圖2。

2 STC1的表達與結(jié)腸癌的腫瘤分期和預(yù)后的關(guān)系

通過對TCGA結(jié)腸癌患者數(shù)據(jù)庫中41例正常人對照，45例1期患者，110例2期患者以及80例3期患者結(jié)腸組織的分析，發(fā)現(xiàn)不同分期的結(jié)腸癌組織STC1的表達都顯著高于正常的結(jié)腸組織(P<0.01)，而且通過分析比較發(fā)現(xiàn)，腫瘤分期越高,STC1的表達水平越高(P<0.05)，見圖3A。通過對TCGA數(shù)據(jù)庫440例結(jié)腸癌患者的生存期分析發(fā)現(xiàn)，STC1高表達組的生存期顯著小于STC1低表達組(P<0.05)，見圖3B。

3 缺氧條件下誘導(dǎo)STC1的表達

用CoCl2模擬體外缺氧環(huán)境，發(fā)現(xiàn)HT-29細胞STC1的mRNA水平和蛋白水平均顯著上調(diào)(P<0.01)，見圖4A、C。采用1% O2的條件培養(yǎng)HT-29細胞，發(fā)現(xiàn)STC1的表達也隨著缺氧誘導(dǎo)時間的延長而上調(diào)(P<0.01)，見圖4B、D。進一步通過TIMER數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，STC1的mRNA表達水平與HIF1α的mRNA表達水平呈正相關(guān)關(guān)系(相關(guān)系數(shù)為0.518)，而且HIF1α的下游基因TIMP1的mRNA表達與STC1的mRNA水平也存在一定的正相關(guān)關(guān)系(相關(guān)系數(shù)為0.393)，見圖5。

Figure 1.The mRNA level of STC1 was over-expressed in colon cancer tissues. The expression of STC1 was evaluated in TCGA samples (A) and Skrzypczak samples (B) in Oncomine. The mRNA expression levels of STC1 (C) in 20 paired collected colorectal cancer tissues and corresponding paratumor tissues from clinical surgery were determined by RT-qPCR T: tumor tissue; N: corresponding paratumor tissue. Mean±SD.**P<0.01vsnormal colorectal tissues.

圖1STC1mRNA在結(jié)腸癌組織中的表達水平

4 炎癥刺激條件下STC1的表達變化

脂多糖處理結(jié)腸癌HT-29細胞2、6和12 h，STC1的mRNA表達和蛋白表達水平顯著增加(P<0.01)，并且通過時間梯度的分析發(fā)現(xiàn)，炎癥刺激的條件下，結(jié)腸癌HT-29細胞中STC1的表達水平迅速變化，在誘導(dǎo)6 h后，STC1的蛋白及mRNA的表達達到最高水平，見圖6。

5 STC1與炎癥分子的表達和腫瘤組織中免疫細胞浸潤水平的關(guān)系

分析發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌組織中STC1的mRNA表達水平與多種炎癥免疫分子之間存在正相關(guān)的關(guān)系，STC1的mRNA表達水平與IL-6、IL-8、IL-10、IL-1β、TGF-β1、TGF-β2、TNF、CCL3和CCL4 mRNA水平的相關(guān)系數(shù)依次為0.568、0.454、0.327、0.357、0.389、0.449、0.267、0.452、0.462，見圖7。并且在結(jié)腸癌中，STC1的mRNA表達與腫瘤組織中免疫細胞(巨噬細胞、中性粒細胞和樹突狀細胞)的浸潤水平存在正相關(guān)的關(guān)系，其中STC1的mRNA表達水平與結(jié)腸癌腫瘤組織中巨噬細胞、中性粒細胞及樹突狀細胞的浸潤水平的相關(guān)系數(shù)分別為0.329、0.518和0.409，見圖8。

Figure 2.The protein expression of STC1. T: colon tumor tissue; N: corresponding paratumor tissue. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsN.

圖2STC1蛋白在結(jié)腸癌組織中高表達

討 論

斯鈣素是一類調(diào)節(jié)機體鈣、磷平衡，參與骨骼發(fā)育、應(yīng)激反應(yīng)等機體生理活動的糖蛋白[9-10]。目前關(guān)于STC1生物學(xué)功能的研究主要集中在惡性腫瘤領(lǐng)域。已有研究報道，STC1在肝癌、肺癌和乳腺癌等惡性腫瘤的發(fā)展過程中發(fā)揮重要的作用。Chan等[3]報道在肝癌中STC1的高表達與不良預(yù)后密切相關(guān)，并且能夠通過影響JNK信號網(wǎng)絡(luò)促進肝癌的轉(zhuǎn)移;Bai等[11]發(fā)現(xiàn)在前列腺癌中STC1能夠通過影響細胞周期促進增殖，并且STC1可以作為新的前列腺癌診斷的分子標志物；Chang等[4]發(fā)現(xiàn)在乳腺癌中STC1的表達水平與腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移能力存在緊密聯(lián)系；這些證據(jù)提示我們，STC1在多種惡性腫瘤中扮演著促癌分子的角色，介導(dǎo)腫瘤的多種生理過程，然而也有研究發(fā)現(xiàn)在宮頸癌中STC1可以抑制腫瘤的增殖轉(zhuǎn)移過程[12]，而STC1在結(jié)腸癌中的研究還鮮有報道。我們通過UALCAN和Oncomine等數(shù)據(jù)庫篩選發(fā)現(xiàn)，在結(jié)腸癌組織中，相對于正常結(jié)腸組織，STC1呈過度表達的狀態(tài)。為了進一步驗證數(shù)據(jù)庫篩選的結(jié)果，我們通過RT-qPCR和Western blot實驗檢測了臨床收集的20例結(jié)腸癌患者樣本，分析癌組織與癌旁組織中STC1的mRNA和蛋白表達水平，進一步證實STC1在結(jié)腸癌組織中高表達，其可能參與結(jié)腸癌的調(diào)節(jié)過程。

Figure 3.The mRNA expression of STC1 was closely correlated with the tumor (A) stage and prognosis (B) in colorectal cancer in TCGA database.**P<0.01vsnormal;#P<0.05vsstageⅠ.

圖3TCGA數(shù)據(jù)庫中STC1的mRNA表達與結(jié)腸癌患者腫瘤分期及預(yù)后密切相關(guān)

預(yù)后是惡性腫瘤治療過程中的一個重要方面，為治療方案的選擇及干預(yù)提供重要的參考[13]。本研究中發(fā)現(xiàn)STC1在結(jié)腸癌組織中存在過表達的情況，那么STC1的表達水平是否和結(jié)腸癌患者的預(yù)后水平存在聯(lián)系呢？我們通過對不同腫瘤分期的結(jié)腸癌患者STC1表達分析發(fā)現(xiàn)，隨著腫瘤分期的升高，STC1的表達水平也隨之上調(diào)，提示STC1可能介導(dǎo)結(jié)腸癌的發(fā)展。同時相對于正常結(jié)腸組織，即使是初期結(jié)腸癌患者組織中STC1的表達水平也顯著上升，因此STC1有可能成為結(jié)腸癌早期診斷的重要指標。本研究還通過對患者生存期的分析，發(fā)現(xiàn)STC1的過表達預(yù)示結(jié)腸癌患者的預(yù)后不良。因此STC1是一個新穎的結(jié)腸癌預(yù)后的分子診斷標志物，有可能為結(jié)腸癌的診斷和治療提供科學(xué)的理論支持。

腫瘤微環(huán)境是腫瘤細胞賴以生存的復(fù)雜環(huán)境，主要由細胞成分和非細胞成分組成，近年來，大量研究發(fā)現(xiàn)腫瘤微環(huán)境在腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移以及耐藥性方面扮演著重要的角色，其中缺氧和炎癥是腫瘤微環(huán)境最重要的2個方面[14]。本研究中發(fā)現(xiàn)，缺氧刺激條件下，STC1的表達顯著上升，而且STC1與HIF1α及其下游基因TIMP1的表達存在正相關(guān)的關(guān)系。而大量的研究報道組織缺氧環(huán)境能夠促進結(jié)腸癌的疾病進程[15]，這表明STC1可能在結(jié)腸癌腫瘤缺氧微環(huán)境中發(fā)揮重要的功能，而缺氧是如何誘導(dǎo)STC1表達的，還有待進一步深入的研究。炎癥免疫反應(yīng)是另一個非常重要的腫瘤微環(huán)境，炎癥細胞和免疫細胞是重要的腫瘤微環(huán)境細胞組成成分，而各種介導(dǎo)炎癥免疫的細胞因子和趨化因子是腫瘤微環(huán)境重要的非細胞成分[16]。本研究中我們發(fā)現(xiàn)脂多糖誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)條件下，結(jié)腸癌HT-29細胞中STC1會被大量誘導(dǎo)表達，并且通過分析TCGA結(jié)腸癌組織中STC1與炎癥調(diào)節(jié)分子IL-6、IL-8、IL-10、IL-1β、TNF-、CCL3和CCL4表達的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，STC1與多種炎癥免疫分子存在正相關(guān)關(guān)系。此外我們發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌組織中STC1的表達水平與腫瘤組織中免疫細胞的浸潤水平亦存在正相關(guān)關(guān)系。這些證據(jù)提示STC1可能在炎癥介導(dǎo)的結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在結(jié)腸癌中，STC1與炎癥免疫調(diào)節(jié)的具體方式和機制，以及兩者調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在結(jié)腸癌的增殖和轉(zhuǎn)移方面發(fā)揮著怎樣的作用，有待進一步的研究。

Figure 4.STC1 was over-expressed under hypoxia condition. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsnormoxia group.

圖4缺氧促進STC1的mRNA和蛋白表達

Figure 5.The mRNA expression of STC1 was positively correlated with the expression of HIF1α and TIMP1 in the 457 colon cancer tissues with analysis of TIMER database.n=457.

圖5TIMER數(shù)據(jù)庫中457例結(jié)腸癌組織的STC1mRNA水平與HIF1α和TIMP1之間存在正相關(guān)關(guān)系

Figure 6.LPS induced the expression of STC1 at mRNA (A) and protein (B) levels in the colon cancer HT-29 cells at the indicated time points. Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 h.

圖6脂多糖(LPS)處理不同時間對結(jié)腸癌HT-29細胞STC1表達的影響

Figure 7.The mRNA expression of STC1 was positively correlated with the expression of inflammatory factors in the 457 colon cancer tissues with analysis of TIMER database.n=457.

圖7TIMER數(shù)據(jù)庫中457例結(jié)腸癌組織STC1mRNA水平與炎癥基因的表達呈正相關(guān)關(guān)系

Figure 8.STC1 mRNA expression was positively correlated with the levels of tumor-infiltrating immune cells in 457 colon cancer tissues with analysis of TIMER database.n=457.

圖8TIMER數(shù)據(jù)庫中457例結(jié)腸癌組織的STC1mRNA表達與腫瘤組織免疫細胞的浸潤水平存在正相關(guān)關(guān)系

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)STC1在結(jié)腸癌組織中呈高表達，且STC1的過表達與結(jié)腸癌的分期和不良預(yù)后呈正相關(guān)的關(guān)系，STC1有可能是結(jié)腸癌早期診斷和不良預(yù)后的一個新的分子標志物。非常有意思的是，本研究還發(fā)現(xiàn)STC1與結(jié)腸癌腫瘤微環(huán)境，特別是與結(jié)腸癌的缺氧及炎癥免疫調(diào)節(jié)存在密切的調(diào)控關(guān)系。