p53激動劑nutlin-3對高糖培養(yǎng)的腎系膜細(xì)胞增殖的影響*

王金霞， 姚亞蘭， 任 琳， 王 坤， 吳永貴

(安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎臟內(nèi)科， 安徽 合肥 230032)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)患者最常見的微血管并發(fā)癥之一，是導(dǎo)致終末期腎病(end-stage renal disease，ESRD)的主要原因之一[1]。腎小球系膜細(xì)胞(mesangial cells，MCs)增生和細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)沉積是DN發(fā)生和發(fā)展的標(biāo)志性病理特征[2]。研究報(bào)道高糖可刺激MCs增生[3]，產(chǎn)生多種細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì), 合成并分泌細(xì)胞外基質(zhì)成分, 導(dǎo)致腎小球硬化[4]。早期干預(yù)可能會對DN發(fā)展起到延緩作用。p53具有DNA修復(fù)、抑制細(xì)胞增殖及促進(jìn)細(xì)胞凋亡等功能。然而p53在DN中的作用較少有研究涉及，通過p53調(diào)控細(xì)胞周期能否影響DN進(jìn)展的相關(guān)研究少有報(bào)道。Nutlin-3(Nut)是一種有效的選擇性鼠雙微體2(murine double minute 2, MDM2)拮抗劑，通過抑制p53的降解，導(dǎo)致p53通路激活，抑制細(xì)胞增殖。本實(shí)驗(yàn)通過nutlin-3干預(yù)MCs，觀察各組細(xì)胞p53的表達(dá)及其對高糖誘導(dǎo)的MCs的增殖、凋亡及ECM沉積的影響，探討p53對DN進(jìn)展的作用。

材 料 和 方 法

1 主要材料與試劑

小鼠腎系膜細(xì)胞株SV40(上海生工生物工程有限公司)；nutlin-3(Selleck)；低糖DMEM培養(yǎng)基(ORPN)；南美特級胎牛血清(Lonsera)；胰酶細(xì)胞消化液、青-鏈霉素、BCA試劑盒和CCK-8細(xì)胞活力試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)研究所)；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡試劑盒(上海貝博生物公司)；抗β-actin和p53抗體及相應(yīng) II 抗(武漢三鷹公司)；抗p-p53、Bax和Bcl-2抗體(Cell Signaling)；抗IV型膠原蛋白(collagen type Ⅳ，Col-Ⅳ)抗體(Affinity)；甘露醇(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)、二甲基亞砜(DMSO)和D-葡萄糖(Sigma)；檸檬酸(上海蘇懿化學(xué)試劑有限公司)；檸檬酸三鈉(天津市大茂化學(xué)試劑廠)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1實(shí)驗(yàn)動物及模型的建立 28～40 g雄性昆明小鼠購于安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，許可證號為SCXK(皖)2017-001。隨機(jī)取6只作為正常對照(control)組(腹腔注射等體積的檸檬酸鹽緩沖液)，其余用40 mg/kg STZ連續(xù)腹腔注射5 d，尾部取血監(jiān)測血糖。注射STZ后連續(xù)監(jiān)測3 d血糖，若隨機(jī)血糖≥16.7 mmol/L，并出現(xiàn)多飲、多食、多尿即糖尿病造模成功。檸檬酸鹽緩沖液由檸檬酸和檸檬酸三鈉配制成pH為4.0～4.5,濃度為0.1 mol/L。STZ需要現(xiàn)配現(xiàn)用，且在低溫條件下由檸檬酸鹽緩沖液溶解成STZ溶液。10周后取腎臟組織用于指標(biāo)測定，石蠟包埋、切片，行PAS及免疫組化染色。

2.2腎臟組織的PAS染色 腎臟切片為3 μm，切片常規(guī)脫蠟至水，PAS染色后光鏡觀察模型(DN)組和對照組腎組織病理形態(tài)學(xué)變化。

2.3免疫組化檢測腎組織中p53的表達(dá) 腎臟切片為3 μm，切片常規(guī)脫蠟至水，高壓修復(fù)，過碘酸消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，加入抗p53抗體(1 ∶50)4 ℃過夜，II 抗37℃ 20 min，DAB顯色，顯微鏡下觀察，陽性反應(yīng)為細(xì)胞漿呈棕色染色，不染色者為陰性。

2.4細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)分組 腎小球系膜細(xì)胞株SV40細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%青-鏈霉素雙抗的低糖DMEM中,呈貼壁生長,37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)傳代培養(yǎng)。細(xì)胞生長到70%～80% 時(shí)棄去原有培養(yǎng)基，PBS輕輕洗滌2次，胰酶消化，顯微鏡下觀察到細(xì)胞回縮變圓時(shí)終止消化，用移液器吹打，待細(xì)胞分散成單個細(xì)胞時(shí)離心，重懸，1 ∶3 傳代。當(dāng)細(xì)胞處于對數(shù)生長期時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。

為了觀察p53激動劑nutlin-3對高糖培養(yǎng)下腎系膜細(xì)胞活力和凋亡的影響，實(shí)驗(yàn)分為5組，分別加入含不同成分的培養(yǎng)基培養(yǎng)：正常糖濃度對照(normal glucose,NG)組(含5 mmol/L葡萄糖)、甘露醇(mannitol, Mtol)對照組(含5 mmol/L葡萄糖+25 mmol/L甘露醇)、高糖(high glucose,HG)組(含30 mmol/L葡萄糖)、HG+Nut組(含30 mmol/L葡萄糖+40 μmol/L nutlin-3)及Nut對照組(含5 mmol/L葡萄糖+40 μmol/L nutlin-3)。

2.5CCK-8法檢測腎系膜細(xì)胞活力的變化 復(fù)蘇的細(xì)胞傳3代之后處于對數(shù)生長期時(shí)，用胰酶消化后加培養(yǎng)基終止消化，4 ℃、1 000 r/min離心5 min，棄上清液，加培養(yǎng)基重懸，細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×108/L，每孔加100 μL該細(xì)胞混懸液，接種到96孔板，另設(shè)一組空白調(diào)零組(即無細(xì)胞，加等體積細(xì)胞培養(yǎng)基),邊緣用無菌PBS填充，放于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱過夜。第2天，棄去培養(yǎng)基，按照上述分組情況進(jìn)行處理。每孔加100 μL培養(yǎng)基，每組均設(shè)3個復(fù)孔。作用24后每孔加入10 μL CCK-8溶液，避光孵育4 h，酶標(biāo)儀450 nm處檢測吸光度(A)值。每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。觀察nutlin-3對高糖培養(yǎng)下的系膜細(xì)胞活性的影響。

2.6臺盼藍(lán)染色活細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn) 將處于對數(shù)生長期的SV40細(xì)胞以每孔1×105個接種于6孔板中，置于 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，第2天按照實(shí)驗(yàn)分組情況每組加含不同糖濃度和nutlin-3的培養(yǎng)基，于加藥24 h后，用胰酶消化貼壁細(xì)胞，采用臺盼藍(lán)染色，進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)。

2.7流式細(xì)胞術(shù)檢測腎系膜細(xì)胞凋亡 將處于對數(shù)生長期的SV40細(xì)胞以每孔1×105個接種于6孔板中,培養(yǎng)24 h后棄去孔內(nèi)的培養(yǎng)基，按照實(shí)驗(yàn)分組情況每組加含不同糖濃度和nutlin-3的培養(yǎng)基，置于 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，于加藥24 h后，收集各組漂浮的細(xì)胞，用不含EDTA的胰酶消化貼壁細(xì)胞，離心(1 500 r/min 離心4 min)收集細(xì)胞，預(yù)冷的PBS洗滌2次。按試劑盒說明書操作：400 μL 1×膜聯(lián)蛋白V(annexin V)結(jié)合液重懸細(xì)胞，在細(xì)胞懸浮液中加入5 μL以異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標(biāo)記的annexin V，輕輕混勻后于2～8 ℃避光孵育15 min后加入10 μL碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色液，輕柔混勻，于2～8 ℃避光孵育5 min，立即用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.8Western blot檢測nutlin-3干預(yù)后Col-IV、p53、p-p53、Bax和Bcl-2的表達(dá) 取對數(shù)生長期的腎系膜細(xì)胞，等細(xì)胞貼壁率達(dá)80%以上時(shí)，棄去上清液，胰酶消化制作單細(xì)胞懸液，然后進(jìn)行傳代，在傳代細(xì)胞生長融合至60%～70%時(shí)，按照實(shí)驗(yàn)分組情況每組加含不同糖濃度和nutlin-3的培養(yǎng)基，干預(yù)培養(yǎng)24 h后提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，按照每孔上樣量30 μg計(jì)算上樣體積，其中每100 μL總蛋白加入25 μL蛋白上樣緩沖液(5×)，煮沸10 min。按照實(shí)驗(yàn)分組依次將蛋白上樣，電泳恒壓55 V, 30 min后換成恒壓110 V約60 min，電泳至溴酚藍(lán)指示劑跑至分離膠底部，停止電泳。在250～300 mA恒流條件下轉(zhuǎn)膜約70～85 min。5%封閉液封閉2 h，PBST緩沖液洗膜3次，分別加入 I 抗β-actin(1 ∶35 000)、p53(1 ∶1 000)、p-p53(1 ∶1 000)、Bax(1 ∶1 000)、Bcl-2(1 ∶1 000)、Col-Ⅳ(1 ∶1 000)，4 ℃孵育過夜，洗膜3次，室溫?fù)u床上低速孵育II抗。將條帶在化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)中曝光，經(jīng)ECL顯影液顯色，運(yùn)用ImageJ軟件進(jìn)行半定量分析條帶灰度值。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用SNK-q法。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組小鼠腎組織病理學(xué)改變

PAS染色可見對照組系膜區(qū)未見明顯擴(kuò)張，腎小管間質(zhì)未見明顯損傷，DN組腎小球體積增大，系膜細(xì)胞增生擴(kuò)張，系膜基質(zhì)增多，見圖1。

Figure 1.The results of PAS staining in the kidney of mice(×400).

圖1小鼠腎PAS染色結(jié)果

2 各組小鼠腎組織中p53表達(dá)情況

免疫組化結(jié)果顯示，對照組腎組織染色顆粒較少，DN組小鼠腎臟組織則可見大量p53標(biāo)記的棕色顆粒，見圖2。

Figure 2. The results of p53 immunohistochemical staining in the kidney of mice (×400).

圖2小鼠腎組織p53的免疫組化染色結(jié)果

3 Nutlin-3對高糖培養(yǎng)下的系膜細(xì)胞增殖的影響

CCK-8法檢測細(xì)胞活力顯示，與NG組比較，HG組細(xì)胞活力明顯提高(P<0.05);與HG組比較，HG+nut組細(xì)胞活力顯著降低(P<0.05)。即高糖可以增強(qiáng)系膜細(xì)胞的活力，40 μmol/L nutlin-3可抑制高糖誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞的活力，見圖3A。

在臺盼藍(lán)染色計(jì)算活細(xì)胞數(shù)目的實(shí)驗(yàn)中，與NG組比較，HG組存活細(xì)胞數(shù)量增高;與HG組比較，HG+Nut組存活細(xì)胞數(shù)量明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3B。

4 Nutlin-3對高糖培養(yǎng)下的系膜細(xì)胞Col-Ⅳ蛋白表達(dá)的影響

Western blot 結(jié)果顯示，與NG組相比，HG組Col-Ⅳ蛋白表達(dá)升高(P<0.05)；而與HG組相比，HG+Nut組Col-Ⅳ蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，見圖4。

Figure 3.High glucose promoted the viability of MCs, and p53 agonist inhibited the viability of MCs under high glucose environment. A: the cell viability was detected by CCK-8 assay; B: the living cell counting was performed by the method of Trypan blue exclusion. Mean±SD.n=3.#P<0.05vsNG group;*P<0.05vsHG group.

圖3Nutlin-3對高糖培養(yǎng)下MCs增殖的影響

Figure 4.The expression of Col-Ⅳ in the MCs was detected by Western blot. Mean±SD.n=3.#P<0.05vsNG group;*P<0.05vsHG group.

圖4Westernblot檢測Col-Ⅳ蛋白的表達(dá)

5 Nutlin-3對高糖培養(yǎng)下的系膜細(xì)胞p53、Bax和Bcl-2等蛋白水平的影響

Western blot 結(jié)果顯示，與NG組相比，HG組p53、Bax和p-p53的蛋白水平均降低(P<0.05)，Bcl-2的蛋白水平升高(P<0.05)；而與HG組相比，HG+Nut組p53、Bax和p-p53的蛋白水平顯著升高(P<0.05)，bcl-2的蛋白水平降低(P<0.05)。此外，Bax/Bcl-2的比值大于1，見圖5。

6 Nutlin-3對高糖培養(yǎng)下的系膜細(xì)胞凋亡水平的影響

Mtol組、NG組、HG組、HG+Nut組、Nut組的凋亡率分別為(5.22±1.21)%、(6.12±1.06)%、(4.24±1.17)%、(10.50±2.45)和(7.71±1.70)%。與NG組比較，體外培養(yǎng)24 h后HG組腎系膜細(xì)胞凋亡率稍微降低，但是2組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性；HG+Nut組的凋亡率較HG組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖6。高糖可以使SV40細(xì)胞凋亡有所降低，而在高糖培養(yǎng)情況下，nutlin-3可以促進(jìn)其凋亡。

Figure 5.The protein levels of p53, p-p53, Bcl-2 and Bax in the MCs were detected by Western blot. Mean±SD.n=3.#P<0.05vsNG group;*P<0.05vsHG group.

圖5Westernblot檢測p53、p-p53、Bcl-2和Bax蛋白水平的變化

Figure 6. The apoptotic rate of MCs in each group was detected by flow cytometry.Mean±SD.n=3.*P<0.05vsHG group.

圖6流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

討 論

糖尿病患者腎損害病理類型包括腎小球基底膜增厚、系膜細(xì)胞活化伴系膜增生、細(xì)胞外基質(zhì)堆積和腎小球硬化[5]。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，高糖可以促進(jìn)MCs增殖以及纖連蛋白和Col Ⅳ的合成[6]。在STZ誘導(dǎo)的DN小鼠模型中，尿白蛋白顯著增加，系膜區(qū)擴(kuò)張[7]，腎小球纖連蛋白表達(dá)增多[8]。以上研究均表明，糖尿病早期血糖水平升高可使MCs活化，系膜細(xì)胞增生，由此引起的Col Ⅳ等ECM增多，促進(jìn)腎小球硬化。我們前期實(shí)驗(yàn)采用多次小劑量STZ成功誘導(dǎo)昆明小鼠DN模型[9]，取小鼠腎臟組織進(jìn)行PAS染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)建模后4周尿蛋白增多而病理改變并不明顯，10周后看到明顯的MCs增生、基質(zhì)增多等病理形態(tài)改變。MCs被認(rèn)為是分泌ECM的主要細(xì)胞類型，其增殖活化在DN早期發(fā)揮了重要的作用，抑制MCs增殖和ECM積聚可作為治療或延緩DN的研究方向。p53基因具有DNA修復(fù)功能，能夠抑制細(xì)胞增生及促進(jìn)細(xì)胞凋亡，我們對STZ誘導(dǎo)的DN小鼠腎組織采用免疫組化方法檢測p53的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DN小鼠腎組織中p53水平比對照組明顯升高，其病理表現(xiàn)為MCs明顯增殖活化，MCs增殖并未被p53有效阻抑，這與Lei等[10]的研究結(jié)果一致。我們推測可能是由于p53的促凋亡作用不足以抵消高糖環(huán)境導(dǎo)致的DN進(jìn)展。因此我們采用體外培養(yǎng)的方法觀察p53對MCs的細(xì)胞活力的影響。

我們在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，對培養(yǎng)的MCs中加入p53激動劑nutlin-3，結(jié)果顯示MCs的細(xì)胞增殖能力受到抑制，Col-Ⅳ蛋白的表達(dá)降低。Nutlin-3是一種有效的選擇性MDM2拮抗劑，能夠抑制MDM2-p53相互作用，導(dǎo)致p53通路激活，控制凋亡相關(guān)基因表達(dá)，如上調(diào)bax促凋亡基因、抑制bcl-2基因的表達(dá)[11-12]，從而抑制細(xì)胞的增殖。Lei等[10]研究發(fā)現(xiàn)高糖誘導(dǎo)的MCs中MDM2蛋白水平明顯升高，敲除MDM2基因能夠減緩MCs增殖、ECM積聚，但nutlin-3不能減輕DM小鼠的腎損害，也不能減輕高糖誘導(dǎo)的ECM積聚。而我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與HG組相比，HG+Nut組MCs細(xì)胞的活力受到抑制，Col-Ⅳ蛋白的表達(dá)降低，Bax蛋白表達(dá)顯著升高，Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)，Bax/Bcl-2比值大于1。流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，使p53活化能夠促進(jìn)高糖培養(yǎng)下MCs凋亡。Ju等[13]研究順鉑的腎毒性機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn)，順鉑能夠使p53活化，誘導(dǎo)系膜細(xì)胞凋亡，加入p53抑制劑能夠抑制順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。Shi等[14]研究發(fā)現(xiàn)，醛固酮能夠誘導(dǎo)小鼠MCs凋亡，腎皮質(zhì)p53蛋白高表達(dá)，體外研究發(fā)現(xiàn)，醛固酮處理組MCs凋亡增加，p53表達(dá)增加，運(yùn)用siRNA干擾敲除p53以后，醛固酮導(dǎo)致的MCs凋亡可以被抑制。以上研究均表明p53參與了MCs的增殖與凋亡的病理過程。p53能抑制高糖環(huán)境中MCs的增殖, 減少細(xì)胞外基質(zhì)的合成, 這可能是防治糖尿病腎小球硬化的重要機(jī)制之一。