上轉(zhuǎn)換介孔二氧化硅多功能肝癌診療納米復(fù)合體系的構(gòu)建*

楊涵，陳星濛，高俊瀟，武曉麗，常津

(天津大學(xué)，天津 300072 )

1 引 言

肝細(xì)胞癌(HCC)占原發(fā)性肝癌的75%～85%，居癌癥死亡率第四位，嚴(yán)重威脅人類健康[1-2]。臨床肝癌治療方法包括如下：肝部分切除術(shù)(PHx)，該方法多適用于早期肝癌患者的治療，且復(fù)發(fā)率較高[3]；化療，其應(yīng)用受限于化療藥物對機體的副作用和病灶部位濃度低[4]。而作為肝癌治療的唯一分子靶向藥物索拉菲尼(sorafenib，S)，也由于其多次給藥，造成多種器官不同程度退化或增生等副作用。鑒于此，迫切需要新的、更有效的肝癌治療方法[5]。

光熱治療(PTT)由于其針對性高，對正常部位附帶損傷少，近年來已廣泛應(yīng)用于腫瘤治療，并取得了較好療效[6-8]。在光熱治療中，近紅外(NIR)光通過納米材料被轉(zhuǎn)換成局部熱能，誘導(dǎo)癌細(xì)胞的凋亡或壞死[9-10]。吲哚箐綠(ICG)是FDA批準(zhǔn)的唯一近紅外波長區(qū)域試劑[11]，它可通過將吸收的光能轉(zhuǎn)化產(chǎn)生熱量、有毒化學(xué)物質(zhì)和單線態(tài)氧ROS，造成腫瘤組織的壞死和凋亡[12]。

介孔二氧化硅以其介孔結(jié)構(gòu)可控、比表面積高、生物相容性好等特性，被廣泛應(yīng)用于抗腫瘤治療[13-15]。此外，上轉(zhuǎn)換納米顆粒(UCNP)吸收NIR光之后發(fā)生電子的躍遷[16]，可實現(xiàn)高靈敏度高信噪比的熒光成像，這一特性也減少了傳統(tǒng)熒光納米顆粒成像需要用紫外光激發(fā)所造成的損傷[17],增加了安全性。

本研究利用負(fù)載ICG和S的上轉(zhuǎn)換包二氧化硅納米顆粒，用于肝癌治療。該復(fù)合納米系統(tǒng)同時集成了熒光成像，免疫調(diào)節(jié)藥物和光熱治療等功能。我們首先對(ICG +S)@ UCNPmSiO2納米顆粒的理化特征進行系統(tǒng)評估，隨后檢測了兩種物質(zhì)的負(fù)載率，藥物釋放效率及ICG的光熱效力。最后，利用HepG2細(xì)胞系在體外檢測該納米顆粒的生物安全性，及其被腫瘤細(xì)胞吞噬作用，最終探究其腫瘤殺傷效率，為該納米顆粒用于肝癌的治療提供了良好的理論依據(jù)。

2 材料和方法

2.1 實驗試劑

材料：吲哚箐綠 (ICG, 美國藥典(USP)參考標(biāo)準(zhǔn))，正硅酸乙酯 (TEOS, ≥99%), 十六烷基三甲基溴化銨 (CTAB, ≥99%), 氯化鈉 (NaCl,≥99.0%), 氫氧化鈉(NaOH, ≥98%),六水合氯化鉺(III) (ErCl3·6H2O, 99.99%), 氯化鐿(III)六水合物 (YbCl3·6H2O, 99.99%), 釓(III)氯六水合物 (GdCl3·6H2O), 油酸(90%), 十八烯(90%), 氟化銨(NH4F, 99.99%), 二甲基亞砜 (DMSO, 99.99%)，均購于Sigma-Aldrich.

2.2 實驗方法

2.2.1上轉(zhuǎn)換納米顆粒(UCNP)的制備 NaYF4：Yb，Er上轉(zhuǎn)換顆粒如下合成：將0.625 g NaOH，12 mL水，6 mL乙醇，24 mg GdCl3·6H2O，100 mg YbCl3·6H2O，12 mg ErCl3·6H2O，6 mL油酸和15 mL十八烯(ODE)在50 mL燒杯中混合。將溶液加熱至40℃，加入0.7 g NH4F并攪拌30 min。隨后將溶液在180℃下轉(zhuǎn)移至反應(yīng)釜中12 h。溶液自然冷卻后，用乙醇離心沉淀，環(huán)己烷洗滌3次。 最后，將上轉(zhuǎn)換顆粒重懸于2 mL環(huán)己烷中[18]。

2.2.2載藥介孔二氧化硅上轉(zhuǎn)換納米顆粒(S+ICG)@UCNPmSiO2的制備 將2.2.1制備的上轉(zhuǎn)換納米顆粒2 mL，與7 mL乙醇，0.09 g CTAB和70 μL NaOH溶液(2 M)共同溶解于18 mL水中，加熱至80℃攪拌30 min。迅速加入350 μL TEOS，在80℃下混合1 h后結(jié)束反應(yīng)，離心分離并使用乙醇純化。將產(chǎn)物分散于20 mL乙醇中，加入NaCl 0.65 g，70℃攪拌6 h后離心，并用ddH2O純化兩次。將介孔二氧化硅上轉(zhuǎn)換納米顆粒轉(zhuǎn)移至4 mL離心管中，在室溫下離心并分散于4 mL乙醇中。

將5 mg ICG加入5 mL UCNPmSiO2水溶液中。將S溶解于DMSO中，濃度為3 mg / mL。在室溫下攪拌24 h后，離心并用水洗滌3次。最后，將產(chǎn)物重新懸浮于4 L水中以供下一步使用。

2.2.3(S+ICG)@UCNPmSiO2納米顆粒表征及藥物緩釋檢測 利用zetasizer nano系列(Malvern儀器)在室溫下收集有效粒度分布和Zeta電位; 利用JEOL TEM 2010F透射電子顯微鏡上以明場模式在200 kV的操作電壓下，獲取該納米顆粒的形貌圖片。使用熒光分光光度計(AVANTES Co.Ltd AvaSpec-ULS2048-USB2(1501085U1))對納米顆粒的熒光發(fā)射光譜進行表征，使用UV-2450PC Shimadzu紫外-可見光分光光度計對納米顆粒的吸收光譜進行表征。

通過紫外-可見光分光光度計檢測0～0.1 mg/mL范圍內(nèi)不同濃度S和ICG溶液，根據(jù)其吸收峰值做標(biāo)準(zhǔn)曲線。隨后檢測測試(S+ICG)@UCNPmSiO2納米顆粒中S和ICG吸收峰，計算S和ICG的載藥量。

將(S+ICG)@UCNPmSiO2納米顆粒溶于不同pH條件，室溫下震蕩緩釋。不同的時間點收取相同體積的溶液，離心取上清，并測定上清中緩釋藥物峰值，計算藥物釋放量并繪制藥物緩釋曲線。

2.2.4(S+ICG)@UCNPmSiO2納米顆粒光熱效率表征 將不同組別樣品置于石英比色器中進行體外ICG光熱效率檢測。用1.6 W/cm2激光照射樣品10 min，同時用紅外熱成像相機(Ti27, Fluke, USA)每30 s記錄一次溫度變化，并繪制溫度曲線。

2.2.5(S+ICG)@UCNPmSiO2納米顆粒安全性、內(nèi)吞效率及殺傷性檢測 采用甲基噻唑啉四唑(MTT)為基礎(chǔ)體外實驗方法，對ICG、S和(S+ICG)@UCNP mSiO2納米顆粒生物安全性進行研究。HepG2細(xì)胞以1×104個細(xì)胞/孔的密度接種于96孔板中孵育24 h。添加ICG、S和(S+ICG)@UCNP mSiO2納米顆于完全培養(yǎng)基中37℃孵育24 h。每孔加入20 μL MTT溶液，繼續(xù)孵育4 h后加入DMSO溶解甲臜。每孔吸光度由微平板閱讀器(型號680,Biorad)檢測。與未處理的細(xì)胞(100%存活率)相比計算存活率。

選取適宜濃度的納米顆粒并檢測HepG2細(xì)胞中對其內(nèi)吞情況，利用熒光顯微鏡檢測其內(nèi)吞效率。PBS洗滌細(xì)胞，多聚甲醛固定(4%)，DAPI(4′，6-二氨基-2-苯基吲哚)染色，最后用倒置Olympus熒光顯微鏡(IX-51)觀察細(xì)胞攝取情況。

選取適宜濃度的ICG、S、UCNP mSiO2以及(S+ICG)@ UCNP mSiO2納米顆粒，同一時間激光照射后，用PBS沖洗細(xì)胞并染色。光熱處理的細(xì)胞毒性由鈣黃綠素/碘化丙啶染色，根據(jù)結(jié)果分析納米顆粒細(xì)胞殺傷功能。

3 實驗結(jié)果

3.1 (ICG+S)@UCNP m SiO2納米顆粒表征

(ICG+S)@UCNPmSiO2納米顆粒合成后，我們首先利用透射電子顯微鏡(TEM)探究其詳細(xì)形態(tài)特征。合成的UCNPmSiO2(見圖1A)和(ICG + S)@ UCNPmSiO2(見圖1B)均具有良好的單分散性和清晰的輪廓。動態(tài)光散射(DLS)測量結(jié)果顯示，UCNP，UCNPmSiO2，(ICG + S)@ UCNPmSiO2納米顆粒的流體動力學(xué)直徑分別約為41、148和149 nm(見圖1C)。負(fù)載ICG和S后，動態(tài)光散射粒徑大小顯示無明顯差異。此外，我們還測定了該納米顆粒中各物質(zhì)特征峰。ICG在約600～800 nm出現(xiàn)兩個連續(xù)峰譜，最大值為781 nm，S的紫外吸收峰峰值則出現(xiàn)在265 nm，而mSiO2顆粒在紫外無吸收峰(見圖1D)。在(ICG+S)@UCNP mSiO2納米顆粒的紫外吸收峰譜中，我們檢測到其在600～800 nm和265 nm具有ICG和S的特征吸收峰，從而證實ICG和S已成功負(fù)載到UCNP mSiO2納米顆粒。我們同時檢測了(ICG+S)@ UCNPmSiO2的熒光光譜。在980 nm光激發(fā)下，(ICG+S)@ UCNPmSiO2在525 nm和655 nm附近產(chǎn)生獨特的發(fā)射波峰(見圖1E)，與UCNP的發(fā)射波峰一致。

圖1AUCNP納米顆粒的TEM圖像;B. (ICG+S)@UCNPmSiO2納米顆粒的TEM圖像;C.不同納米顆粒粒徑;D.ICG、S、UCNPmSiO2和(ICG+S)@UCNPmSiO2的紫外-可見吸收光譜;E.UCNPmSiO2,ICG@UCNPmSiO2,S@UCNPmSiO2，(ICG+S) @UCNPmSiO2的熒光光譜

Fig1ATEMimagesofUCNPnanoparticles;B.TEMimagesof(ICG+S)@UCNPmSiO2nanoparticles;C.Particlesizeofdifferentgroupsaftereachmodification;D.TheUV-visabsorptionspectrumforICG,Sorafenib,UCNPand(ICG+S)@UCNPmSiO2;E.ThefluorescencespectrometerofUCNPmSiO2,ICG@UCNPmSiO2,S@UCNPmSiO2and(ICG+S)@UCNPmSiO2underUVlightexposure

3.2 (ICG+S)@ UCNP mSiO2納米顆粒中ICG和S的負(fù)載及緩釋

我們利用紫外-可見(UV-vis)光譜檢測了(ICG+S)@ UCNP mSiO2納米顆粒負(fù)載兩種藥物的效率。見圖2A，S和ICG的負(fù)載率分別達8.03%和10.21%。此外，通過在pH=7.4和pH=5.5兩種條件下的藥物釋放實驗，我們發(fā)現(xiàn)兩種物質(zhì)均隨時間升高，釋放比例升高。在接近體內(nèi)外周水平的pH=7.4時，96hICG和S釋放量分別達到35%和10%，而在接近腫瘤細(xì)胞內(nèi)部的pH=5.5情況下，ICG和S的釋放量顯著增加至41%和15%，見圖2B。

圖2A.(ICG+S)@UCNPmSiO2納米粒中S和ICG的載藥率；B.pH=7.4和pH=5.5時ICG和S的藥物釋放量

Fig2A.Thedrugloadingratesofthetwodrugsin(ICG+S)@UCNPmSiO2nanoparticles；B.drugreleaseofICGandSby(ICG+S)@UCNPmSiO2nanoparticlesinpH=7.4andpH=5.5,respectively

3.3 (ICG+S)@ UCNP mSiO2納米顆粒的光熱性能表征

由于腫瘤細(xì)胞的熱敏感性，即43℃的溫度可損傷腫瘤細(xì)胞。因此，我們擬利用ICG的光熱效應(yīng)實現(xiàn)肝癌腫瘤細(xì)胞殺傷，并檢測了不同組別(PBS對照，ICG和(ICG+S)@ UCNP mSiO2)的光熱效應(yīng)。見圖3A，808 nm近紅外激光激發(fā)后，PBS僅從26.8℃升高至約27.6℃，溫度未發(fā)生明顯的變化；ICG溶液的溫度隨照射時間持續(xù)迅速升高；而(ICG+S)@UCNPmSiO2納米顆粒溶液，在10 min內(nèi)溫度從28.2℃增加至50.8℃，見圖3A，其光熱性能較為溫和，可在殺死腫瘤細(xì)胞的同時，避免ICG組溫度迅速升高的不可控性。根據(jù)上述三組溫度變化，繪制溫度變化曲線，見圖3B。

圖3不同時間點PBS、ICG、(ICG+S)@UCNPmSiO2的光熱圖像及其溫度變化曲線

Fig3PhotothermalimagesofPBS,ICG, (ICG+S)@UCNPmSiO2indifferenttimepointsandtheirtemperatureprofiles

3.4 (ICG+S)@ UCNP mSiO2納米顆粒生物安全性，細(xì)胞攝取及殺傷功能研究

利用HepG2細(xì)胞系，通過MTT測定納米顆粒的生物安全性。見圖4，隨著納米顆粒濃度降低，細(xì)胞存活率升高。當(dāng)濃度為300 mg/L時，四個樣品組的存活率均高于70%，表明該濃度以下，(ICG+S)@ UCNP mSiO2納米顆粒具有較好的生物安全性。

利用倒置熒光顯微鏡觀察HepG2細(xì)胞對(ICG+S)@ UCNPmSiO2的攝取。將納米顆粒與HepG2細(xì)胞孵育4 h后，檢測該顆粒被內(nèi)吞的效果。圖5A顯示細(xì)胞在明場照射下的形態(tài)，紅色熒光顯示ICG的定位，見圖5B；綠色熒光顯示UCNP的定位，見圖5C；藍色熒光顯示DAPI標(biāo)記的HepG2細(xì)胞核，見圖5D。圖5E為熒光圖片的總merge圖，(ICG+S)@ UCNPmSiO2被HepG2細(xì)胞成功內(nèi)吞。

圖4用ICG、S、UCNPmSiO2和(ICG+S)@UCNPmSiO2納米顆粒處理HepG2細(xì)胞48h后的細(xì)胞存活率

Fig4RelativeviabilitiesofHepG2cellsaftertreatmentwithICG,S,UCNPmSiO2and(ICG+S)@UCNPmSiO2nanoparticlesfor48h

在培養(yǎng)基中加入不同濃度(S+ICG)@ UCNP mSiO2納米顆粒，ICG，S和UCNP mSiO2。其中，ICG和(S+ICG)@ UCNP mSiO2納米顆粒組進行808 nm激光照射，計算細(xì)胞凋亡率。見圖6，與對照組相比，UCNPmSiO2組沒有細(xì)胞殺傷效果，S組殺傷HepG2細(xì)胞效果顯著增加(P<0.01)。而在激光照射條件下，ICG由于其激光照射產(chǎn)生的光熱效應(yīng)顯示出優(yōu)異的細(xì)胞殺傷效果。 (ICG+S)@UCNPmSiO2納米顆粒同單一的細(xì)胞免疫治療與光熱治療相比，治療效果顯著增強。

圖5 (ICG+S)@UCNPmSiO2納米顆粒被HepG2細(xì)胞內(nèi)吞的熒光圖像

Fig5Fluorescenceimagesof(ICG+S) @UCNPmSiO2nanoparticlesendocytosedbyHepG2cells

圖6用ICG、S、UCNPmSiO2和(ICG+S)@UCNPmSiO2納米顆粒對HepG2細(xì)胞并進行激光照射后的細(xì)胞凋亡

Fig6PercentageofapoptosiscellsaftertreatmentofHepG2cellswithICG,S,UCNPmSiO2and(ICG+S)@UCNPmSiO2nanoparticlesandlaserirradiation

4 結(jié)論

我們成功地制備吲哚菁綠(ICG)和索拉菲尼(S)共載的上轉(zhuǎn)換介孔二氧化硅納米顆粒((ICG + S)@UCNPmSiO2)。將UCNP的熒光成像作用，ICG的熱效應(yīng)及S的分子靶向治療作用有機結(jié)合于介孔二氧化硅納米顆粒中，形成肝癌診療一體化納米復(fù)合體系。在本研究中，該體系表現(xiàn)出優(yōu)異的熒光穩(wěn)定性和靈敏的溫度響應(yīng)。此外，(ICG+S)@ UCNPmSiO2具有良好的生物安全性和腫瘤殺傷效果，是一種具有潛力的腫瘤診療一體化體系。