新型導(dǎo)尿管超滑抗菌涂層的制備及生物安全性評價(jià)*

李育強(qiáng)，智倩倩△，王曉麗，王南南，韓超，孔曉穎

(1.青島明藥堂醫(yī)療股份有限公司，青島 266111；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，青島 266109)

1 引 言

據(jù)世界衛(wèi)生組織2005年統(tǒng)計(jì)，全球約有140萬院內(nèi)感染患者。院內(nèi)感染[1]將成為全球性日益嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題?？刂圃簝?nèi)感染的有效途徑是在醫(yī)療器械表面添加涂層。國外先進(jìn)技術(shù)通過光催化接枝的方法將超滑、抗菌涂層接枝到醫(yī)療器械表面，而國內(nèi)尚無此技術(shù)。為降低腔道插管造成的組織感染，同時(shí)面對國際市場的技術(shù)壟斷[2-3]，國內(nèi)科研工作者對功能性涂層也加大了研究力度。目前臨床醫(yī)療器械的抗菌成分多為納米銀，但研究表明納米銀會隨大鼠血液循環(huán)進(jìn)入腎臟、肝臟、脾臟、大腦和肺臟等重要器官內(nèi)，并在細(xì)胞內(nèi)外沉積，干擾細(xì)胞[4]。同時(shí)在國家對含銀醫(yī)療器械產(chǎn)品不予注冊的背景下，亟需研制一種對人體無毒害、無抗藥性的超滑抗菌涂層導(dǎo)管。

我們經(jīng)過對光催化接枝涂層的研究，深入探討關(guān)鍵技術(shù)要點(diǎn)，包括單體濃度、體系溫度、紫外接枝時(shí)間等，探索最佳制備工藝，制備出新型的硅膠超滑抗菌涂層[5]。本研究以導(dǎo)尿管為例，對新型超滑抗菌涂層進(jìn)行生物安全性能研究。細(xì)胞毒性試驗(yàn)[6]是公認(rèn)的可迅速地表征供試品對細(xì)胞新陳代謝的影響，其結(jié)果可直接反應(yīng)超滑抗菌導(dǎo)尿管是否安全可靠。按照《GB/T 16886醫(yī)療器械生物學(xué)評價(jià)》，超滑抗菌導(dǎo)尿管屬于黏膜接觸類產(chǎn)品，通過細(xì)胞毒性、黏膜刺激和皮下刺激等進(jìn)行生物安全性能評價(jià)試驗(yàn)。

2 材料與方法

2.1 新型超滑抗菌涂層的制備

選用純硅膠導(dǎo)尿管為基體材料，采用光催化接枝的方法制備出超滑抗菌硅膠導(dǎo)尿管[5]。將導(dǎo)尿管經(jīng)過丙酮預(yù)處理、醇洗、干燥、光催化劑處理、紫外接枝反應(yīng)、醇洗、水洗等工序，將丙烯酸及牡丹酚接枝到導(dǎo)尿管外表面制備出超滑抗菌涂層導(dǎo)尿管。

2.2 單因素分析

設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn)方案見表1，從單體濃度、體系溫度及紫外輻照時(shí)間考察涂層的外觀、厚度、體系反應(yīng)現(xiàn)象等，優(yōu)化涂層工藝。

表1 單因素試驗(yàn)方案

2.3 產(chǎn)品表征

2.3.1紅外光譜 采用美國尼高力公司的傅立葉變換紅外光譜儀Nicolet 510p對樣品結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，評價(jià)涂層接枝結(jié)果。

2.3.2掃描電鏡 采用掃描電子顯微鏡S-3400N進(jìn)行掃描分析樣品形貌及涂層厚度。

2.4 MTT法[6]

用DMEM完全培養(yǎng)液按照1∶5比例浸提超滑抗菌導(dǎo)尿管。取小鼠成纖維細(xì)胞L929細(xì)胞懸液接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，細(xì)胞鋪板濃度為4.5×104個(gè)/孔，放置于CO2培養(yǎng)箱(5%，37℃)培養(yǎng)18 h。棄除細(xì)胞培養(yǎng)液，分別將100 μL DMEM 完全培養(yǎng)基、高密度聚乙烯 DMEM 培養(yǎng)基、含5%二甲基亞砜(DMSO)的DMEM培養(yǎng)基、兩組樣品浸提液加到每個(gè)孔中，每組5孔平行樣。

培養(yǎng)72 h后取出培養(yǎng)板，鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。每孔加10 μL MTT，置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h后，棄去孔內(nèi)液體，加入150 μL DMSO，用酶標(biāo)儀測OD570nm的吸光度(A)值。計(jì)算得出平均A值，并計(jì)算細(xì)胞的相對增殖率(RGH)：RGH=實(shí)驗(yàn)組平均A值/對照組平均A值×100%。細(xì)胞毒性分級：0級，RGH≥100%；1級，RGH為75%～99%；2級，RGH為50%～74%；3級，RGH為25%～49%；4級，RGH為1%～24%；5級，RGH為0。

2.5 皮下刺激實(shí)驗(yàn)

取10只新西蘭兔，試驗(yàn)前4～18 h，徹底除去動物背部脊柱兩側(cè)背毛。分別用無菌生理鹽水、無菌棉籽油浸提取超滑抗菌導(dǎo)尿管。每只兔子背部兩側(cè)各選取8個(gè)注射點(diǎn)，左前側(cè)四點(diǎn)為無菌生理鹽水浸提液；左后側(cè)四點(diǎn)為無菌生理鹽水對照液；右前側(cè)四點(diǎn)為無菌棉籽油浸提液；右后側(cè)四點(diǎn)為無菌棉籽油對照液。每個(gè)注射點(diǎn)注射0.2 mL液體，并在注射后24、48和72 h觀察各注射部位狀況。根據(jù)國際標(biāo)準(zhǔn)化組織(ISO)制定的《醫(yī)用器械生物學(xué)評價(jià)和國際標(biāo)準(zhǔn)》(ISO10993：2002)評分標(biāo)準(zhǔn)對注射點(diǎn)進(jìn)行評分，判斷皮下刺激分?jǐn)?shù)。

2.6 黏膜刺激實(shí)驗(yàn)[7]

取6只新西蘭兔，4只為實(shí)驗(yàn)組(2雄2雌)，2只為對照組(1雄1雌)。將兔固定，提起兔尾巴使其陰道口/陰莖完全暴露，使用注射器，將1 mL浸提液，推入實(shí)驗(yàn)組新西蘭兔陰道/陰莖內(nèi)，用無菌脫脂紗布輕輕擦去溢出物，給藥后使動物維持臀高頭低位被動安靜3 min。每隔24 h重復(fù)給藥7 d后，無痛處死新西蘭兔后，取生殖道組織做HE染色病理檢查，觀察有無組織變性、壞死、炎細(xì)胞浸潤、血管充血、水腫等刺激性反應(yīng)并打分評價(jià)。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，分析數(shù)據(jù)間的顯著性差異。P<0.05(*)為有顯著性差異，P<0.01(**)為有極顯著性差異。

3 結(jié)果

3.1 單體濃度

對比分析涂層表面微觀及厚度優(yōu)化單體濃度，結(jié)果見圖1。根據(jù)結(jié)果可知，涂層厚度隨單體濃度的增高先增加后降低，但單體濃度過高使涂層表面變得粗糙。推測原因：當(dāng)單體濃度較低時(shí)，單體之間接觸和碰撞的幾率較小，不利于分子鏈的增長，聚合反應(yīng)慢，涂層較??；隨單體濃度的提高，反應(yīng)速度加快，利于分子鏈的增長，相對分子質(zhì)量增大，涂層厚度增加；但單體濃度過高時(shí)，反應(yīng)體系升溫過快，不利于熱量散發(fā)，聚丙烯酸易發(fā)生交聯(lián)現(xiàn)象，涂層表面出現(xiàn)結(jié)塊。單體濃度優(yōu)化為95 mM。

圖1單體濃度對涂層厚度的影響

Fig1Theinfluenceofmonomerconcentrationonthecoatingthickness

3.2 體系溫度

針對體系溫度單因素，分析涂層厚度及體系反應(yīng)前后變化，結(jié)果見圖2。根據(jù)結(jié)果可知，涂層厚度隨體系溫度的升高先增加后減小，但溫度過高使反應(yīng)體系黏度大大增加。體系反應(yīng)溫度升高利于反應(yīng)速度加快，有利于分子鏈的增長，相對分子質(zhì)量增大，涂層厚度增加；但體系溫度過高時(shí)，丙烯酸容易發(fā)生交聯(lián)現(xiàn)象，使得反應(yīng)體系黏度增加，不利于體系的重復(fù)利用。體系溫度優(yōu)化為35℃。

3.3 紫外輻照時(shí)間

通過涂層厚度及試樣性狀優(yōu)化紫外輻照時(shí)間，結(jié)果見圖3。根據(jù)結(jié)果可知，涂層厚度隨紫外接枝時(shí)間增加而增加，但涂層厚度過高造成試樣透明度降低，影響外觀。紫外輻照下產(chǎn)生自由基，輻照時(shí)間越長，產(chǎn)生的自由基數(shù)量越多，利于分子鏈的增長，相對分子質(zhì)量增大，涂層厚度增加。紫外輻照時(shí)間優(yōu)化為7 min。

圖2體系溫度對涂層厚度的影響

Fig2Influenceofsystemtemperatureoncoatingthickness

圖3紫外輻射時(shí)間對涂層厚度的影響

Fig3Effectofultravioletradiationtimeoncoatingthickness

3.4 產(chǎn)品表征

2.4.1紅外圖譜 對超滑抗菌導(dǎo)尿管進(jìn)行紅外光譜分析，如圖4紅外光譜圖對比所示，硅膠導(dǎo)尿管基材的特征峰包含788、1008、1258、2962 cm-1等，對比超滑涂層及超滑抗菌涂層導(dǎo)尿管可知，超滑涂層、抗菌涂層分別成功地引入特征峰1543、1716 cm-1，其中1716 cm-1是抑菌劑中酯基C=O雙鍵伸縮振動峰，說明超滑涂層及抑菌涂層均成功接枝到導(dǎo)尿管表面。

圖4 裸管、超滑導(dǎo)尿管、超滑抗菌導(dǎo)尿管紅外光譜圖

Fig4Infraredspectraofsiliconetube,superslidecatheter,superslideantibacterialcatheter

2.4.2掃描電鏡 圖5為單因素試驗(yàn)導(dǎo)尿管涂層表面及橫截面的掃描電鏡照片，對各試驗(yàn)條件下樣品的表觀及涂層厚度進(jìn)行分析。圖中，A-E表示不同單體濃度下制備的涂層表面照片，涂層表面隨單體濃度的增加，涂層表面由緊密平整逐漸呈現(xiàn)水流狀；濃度過高時(shí)，涂層表面出現(xiàn)結(jié)塊、不平整的現(xiàn)象。F-J、K-O分別為不同體系溫度及紫外輻射時(shí)間下導(dǎo)管橫截面照片，根據(jù)結(jié)果可以看出涂層厚度均隨體系溫度、紫外輻射時(shí)間的增加而增加。

圖5單因素試樣掃描電鏡照片

(A-E：不同單體濃度涂層表面；F-J：不同體系溫度導(dǎo)管橫截面；K-O：不同紫外輻射時(shí)間導(dǎo)管橫截面)

Fig5Scanningelectronmicrographesofsinglefactorsample

3.5 細(xì)胞毒性

新型超滑抗菌導(dǎo)尿管組浸提液細(xì)胞相對增殖率為94.9%～102.0%，無涂層硅膠導(dǎo)尿管細(xì)胞相對增殖率為97.2%～103.2%，細(xì)胞毒性均為1級。超滑抗菌導(dǎo)尿管與對照普通硅膠導(dǎo)尿管的相對增殖率平均值間的差異無顯著性意義(P<0.05)。各組細(xì)胞相對增殖率平均值見圖6。

圖6各組體外細(xì)胞相對增值率(RGH)

Fig6Cellrelativeproliferationrateofdifferentgroup

3.6 皮下刺激

皮下刺激24、48和72 h后，觀察實(shí)驗(yàn)組和對照組，精神狀態(tài)良好，無異常情況發(fā)生。整個(gè)觀察期間實(shí)驗(yàn)組注射點(diǎn)無紅斑、無水腫、無硬結(jié)，超滑抗菌導(dǎo)尿管皮下刺激分?jǐn)?shù)為0。

3.7 黏膜刺激

見圖7，超滑抗菌導(dǎo)尿管重復(fù)給毒7 d，對生殖道黏膜無刺激，給藥部位未出現(xiàn)糜爛、潰瘍等病變，對照組和實(shí)驗(yàn)組組織正常，均未出現(xiàn)炎癥反應(yīng)。

圖7兔子生殖道切片照片(400×)

Fig7Themicroscopeimagesofrabbittractusgenitalissection(400×)

4 討論

面對國內(nèi)外市場上含銀制品的潛在毒性，及近年來國家對含銀醫(yī)療器械監(jiān)管力度的加大，亟需對高生物安全性的超滑抗菌涂層材料進(jìn)行研究。市場上的含銀涂層導(dǎo)尿管直接與人體黏膜接觸，其細(xì)胞毒性較高[8]，將對機(jī)體細(xì)胞造成不可彌補(bǔ)的隱患。

牡丹酚來源于毛茛科植物牡丹皮，蘿藦科植物等，具有鎮(zhèn)痛、抗炎、抑菌等作用，尤其對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌具有顯著的抑菌效果，此外，牡丹酚可被人體迅速吸收、代謝和排泄[9]。課題組前期對硅膠光催化接枝牡丹酚涂層的體外抑菌實(shí)驗(yàn)效果顯著，制備成超滑抗菌導(dǎo)尿管后，其持續(xù)抗菌時(shí)間可達(dá)30 d以上[5]，可顯著降低插入導(dǎo)管相關(guān)性院內(nèi)感染。

我們對光催化接枝涂層進(jìn)行研究，深入探討關(guān)鍵工藝技術(shù)，包括單體濃度、體系溫度、紫外接枝時(shí)間。同時(shí)參考GB/T 16886.5-2017第5部分[10]、GB/T 16886.10-2005 第10部分[11]，對光催化接枝制備的超滑抗菌導(dǎo)尿管進(jìn)行了生物學(xué)評價(jià)。研究了新型超滑抗菌導(dǎo)尿管的體外細(xì)胞毒性、皮下刺激以及黏膜刺激。體外細(xì)胞毒性MTT實(shí)驗(yàn)法[8]通過檢測產(chǎn)品對活細(xì)胞數(shù)量及其新陳代謝的影響進(jìn)行評價(jià)，能快捷地反映產(chǎn)品對細(xì)胞造成的損害程度。新型超滑抗菌導(dǎo)尿管體外細(xì)胞毒性與普通導(dǎo)尿管相對增值率平均值間差異無顯著性意義(P>0.05)，細(xì)胞毒性級別均為1級。皮下刺激72 h后，實(shí)驗(yàn)組注射點(diǎn)無紅斑、無水腫、無硬結(jié)。黏膜刺激試驗(yàn)?zāi)芊从吵鰧?dǎo)尿管對黏膜腔道組織的潛在性刺激[7]。本研究試驗(yàn)中對動物重復(fù)給毒7 d后，超滑抗菌導(dǎo)尿管浸提液對黏膜無刺激，無炎癥現(xiàn)象出現(xiàn)，表明新型導(dǎo)尿管超滑抗菌涂層在使用過程中對黏膜無潛在性危害。

綜上，本研究超滑抗菌涂層優(yōu)化工藝分別為95 mM、35℃、7 min，其細(xì)胞毒性為1級，皮下刺激評分為0分，陰道刺激實(shí)驗(yàn)中，重復(fù)給毒7 d后對陰道黏膜無刺激，生物安全性良好，符合醫(yī)療器械生物學(xué)評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)要求。超滑抗菌涂層完全可以替代含銀涂層器械，為其臨床使用提供理論依據(jù)。該涂層技術(shù)不僅用于高端涂層導(dǎo)管系列產(chǎn)品，如氣管插管、胃管、引流管、留置針套管等，而且也可用于骨科植入器械、牙科植入器械和呼吸機(jī)等醫(yī)療設(shè)備，帶動高端醫(yī)療器械產(chǎn)品的開發(fā)。