“芯片肺”的研究進展

王松 白義春 馬雅娜 劉聰 郭冰心 吉宏龍新鄉(xiāng)醫(yī)學院肺病與分子治療研究所453003;德克薩斯大學泰勒醫(yī)學研究中心細胞與分子生物學系,泰勒75708

呼吸系統(tǒng)疾病是嚴重危害人類健康的常見病、多發(fā)病?？諝馕廴?、吸煙以及人口老齡化等多種因素使呼吸系統(tǒng)疾病的流行病學和疾病譜分布正在發(fā)生改變。由于缺乏高效特異的藥物治療,肺移植是目前治療終末期呼吸系統(tǒng)疾病較為可靠的方法,但該方法卻受到供體缺乏以及免疫排斥反應等因素的限制[1]。所以,我們亟需一個高通量藥物篩選模型,進行更有效的藥物研發(fā)和篩選,這對發(fā)現(xiàn)新的精準治療措施至關重要?！靶酒巍笔且环N在微流控芯片上利用微加工技術制造出的仿生肺三維模型。它可以模擬肺臟氣血屏障的部分功能、肺部炎癥和肺水腫的發(fā)生過程,用于評估空氣中納米顆粒的吸收,以及評價新藥的安全性和有效性。此外,通過細胞共培養(yǎng)技術還可建立非小細胞肺癌模型,對肺癌的發(fā)生過程進行研究。本文將從 “芯片肺”的結構、研究進展等方面進行介紹。

1 “芯片肺”的結構及其作用原理

1.1 “芯片肺”的結構 哈佛大學維斯生物工程研究院的研究人員首次研制出可以模擬肺泡功能的 “芯片肺” (圖1),這種 “芯片肺”能夠精確的模擬人肺不同組織間的相互作用,在肺泡水平上重現(xiàn)肺的部分生理功能[2]。 “芯片肺”分為上下兩層,上層為氣體通道,模擬肺泡腔;下層為液體通道,模擬血管腔,中間由多孔的聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane,PDMS)薄膜 (10μm)將其分隔。在PDMS 薄膜的上、下表面均包被一層細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM),上表面培養(yǎng)暴露在空氣中的人體肺泡上皮細胞,下表面培養(yǎng)浸潤在液體中的血管內(nèi)皮細胞,在體外模擬人肺泡氣血屏障的主要結構、功能和力學性質(zhì)。細胞在接種到附有ECM 的PDMS薄膜對立面后,分別在各自的通道中形成緊密連接的單層細胞。之后,氣體通道中通入空氣,模擬在體狀態(tài)下肺泡上皮細胞生存的氣-液界面,液體通道中通入液體,模擬在體狀態(tài)下血管內(nèi)皮細胞生存的液體環(huán)境。氣體進入氣體通道后,肺泡上皮細胞分泌表面活性物質(zhì)增多,形成氣-液界面,增強了肺泡穩(wěn)定性;當液體通道通入液體后,血管內(nèi)皮細胞被重新排列。在 “芯片肺”的左右兩側(cè)存在兩個側(cè)室與兩個真空泵相連,通過規(guī)律地改變側(cè)室的壓力,引起PDMS薄膜規(guī)律的起伏,進而模擬肺的呼吸運動[3]。目前 “芯片肺”已成功地在體外模擬了肺氣血屏障的多項基本功能。

圖1 “芯片肺”結構示意圖[2]

1.2 “芯片肺”的作用原理 肺泡是肺的基本功能單位。平靜呼吸時,吸氣運動膈肌與肋間外肌收縮,胸廓擴大,外界大氣壓力高于肺內(nèi)氣壓,外界空氣流入肺泡,肺泡隨之擴大,使肺泡上皮細胞和肺泡毛細血管內(nèi)皮細胞伸展;呼氣運動膈肌和肋間外肌松弛,胸腔容積縮小,肺彈性回縮,肺內(nèi)壓也隨之升高,當高于大氣壓時,肺內(nèi)氣體排出肺泡,使肺泡上皮細胞和肺泡毛細血管內(nèi)皮細胞回縮?！靶酒巍蓖ㄟ^與兩個側(cè)室相連的真空泵的規(guī)律作用,引起兩個側(cè)室內(nèi)壓力的變化,進而引起PDMS 薄膜形變。與PDMS薄膜緊密相連的肺泡上皮細胞和血管內(nèi)皮細胞也隨之發(fā)生伸展和回縮,以此來模擬肺呼吸運動時產(chǎn)生的機械應力[3]。不同的是,肺呼吸運動時,肺泡與外界大氣之間的壓力差為肺通氣提供了直接動力,“芯片肺”模型中真空泵的規(guī)律變化引起的壓力差僅通過引起PDMS薄膜的彈性形變來模擬肺泡在肺通氣過程中的起伏,并不能模擬呼吸肌運動提供的原動力。另外,“芯片肺”還不能實現(xiàn)人肺肺泡與血流之間的換氣功能。

呼吸道與外界相通,全身血液均流經(jīng)肺臟,故肺臟易遭受身體內(nèi)外微生物的侵襲。因此,肺臟除了主管呼吸功能外還具備非呼吸性的防御與免疫功能?！靶酒巍蹦Ｐ统丝梢阅M呼吸運動外,還能模擬肺臟免疫功能。通過在“芯片肺”的氣體通道和液體通道中分別加入炎癥因子和免疫細胞,模擬體內(nèi)肺炎等呼吸疾病發(fā)生時的免疫過程。腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)刺激肺泡毛細血管內(nèi)皮細胞使細胞間黏附分子-1 (intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)表達增強,促進了中性粒細胞的黏附。中性粒細胞黏附于血管內(nèi)皮細胞扁平化,由血管內(nèi)皮細胞間隙滲出,通過PDMS薄膜出現(xiàn)在肺泡上皮細胞。在 “芯片肺”中加入免疫細胞,可以實時監(jiān)控循環(huán)的免疫細胞在疾病發(fā)展中的作用[4-5]。除循環(huán)的免疫細胞外,肺部駐留的免疫細胞在肺部疾病發(fā)展中也起著重要作用[6],不足的是,“芯片肺”無法模擬駐留的免疫細胞在肺部疾病發(fā)展中的具體作用。

2 “芯片肺”與細胞模型和動物模型的差別

2.1 “芯片肺”與細胞模型的差別 通常新藥的藥效及毒性測試實驗在細胞模型及動物模型中進行,單一細胞的靜態(tài)培養(yǎng)是組織病理學、藥效學和藥代動力學最常用的細胞模型。但其無法模擬各種肺細胞間的相互作用和呼吸運動。另外,呼吸運動產(chǎn)生的機械力和血流產(chǎn)生的剪切力對肺細胞的生長、修復、損傷、炎癥、表面活性物質(zhì)的釋放以及組織的發(fā)育有著強烈的影響[7],所以單一細胞的靜態(tài)培養(yǎng)無法準確的模擬體內(nèi)細胞生長和藥物代謝真實環(huán)境[8-10]?！靶酒巍蹦軌蚰M呼吸運動產(chǎn)生的機械力和血流產(chǎn)生的剪切力,使細胞的生長、分化的力學條件更接近人體。在“芯片肺”的氣-液界面培養(yǎng)的肺泡上皮細胞與靜態(tài)細胞培養(yǎng)相比增大了通過細胞層的電阻和屏障功能,表現(xiàn)出與肺相似的蛋白通過率[3,11]。

2.2 “芯片肺”與動物模型的差別 動物實驗,尤其是嚙齒類動物已經(jīng)在生理學和病理生理學方面做出了極大的貢獻,并且能夠反映完整個體中的藥物代謝情況。但耗時長、價格昂貴,動物模型與人類在呼吸系統(tǒng)生長發(fā)育、結構功能、細胞比例和疾病的特征等方面不盡相同[12-13],導致藥物研發(fā)多在臨床試驗階段失敗。此外,動物模型存在一系列的倫理問題[9-10,14-15]。綜上所述,動物模型已經(jīng)無法滿足更為精確的實驗需求?！靶酒巍蹦軌蚰M肺的主要功能、肺在體內(nèi)生長分化所需微環(huán)境以及肺和所處微環(huán)境之間的相互作用[16]。每一種具體的 “芯片肺”模型都能通過人為主觀地改變某種條件,使其更接近肺在體或疾病發(fā)展的相應狀態(tài),并且能夠研究該變化在疾病發(fā)展和治療過程中的作用。因此,“芯片肺”或在肺部疾病的防治方面發(fā)揮重要作用。

3 “芯片肺”在呼吸疾病研究中的應用

3.1 “芯片肺”在肺炎中的研究 肺炎是指由病原微生物、理化因素、免疫損傷、過敏及藥物所致的終末氣道,肺泡和肺間質(zhì)的炎癥。細菌感染是引起肺炎的主要因素之一,研究表明,當將大腸桿菌加入 “芯片肺”的氣體通道后,ICAM-1表達明顯增強,血管內(nèi)皮細胞對中性粒細胞的黏附作用增強。隨后,中性粒細胞激活、遷移、滲出,最終到達肺泡上皮表面,并吞噬大腸桿菌。此外,研究人員在 “芯片肺”模型氣體通道中加入TNF-α以及IL-8等炎癥因子,中性粒細胞出現(xiàn)了與在氣體通道中加入細菌相同的結果。該結果與臨床上肺炎時中性粒細胞的遷移一致,證明 “芯片肺”模型能夠重現(xiàn)人體內(nèi)病原微生物以及炎癥因子等引起的肺炎發(fā)生以及免疫應答過程[3,17]。

大量研究表明吸入納米顆粒可引起肺炎[18-20]。將直徑12 nm 的二氧化硅納米顆粒加入 “芯片肺”的氣體通道,納米顆粒通過激活肺上皮細胞產(chǎn)生促炎因子,同時活化血管內(nèi)皮細胞表達ICMA-1從而引起肺炎,這與臨床試驗相符。運用 “芯片肺”模型同時發(fā)現(xiàn),機械牽張在此過程中起著非常重要的作用。活性氧 (reactive oxygen species,ROS)是調(diào)節(jié)炎癥反應的重要信號分子,研究人員以ROS的產(chǎn)生量為指標,定量測定機械牽張對吸入納米顆粒引起肺炎的影響。結果顯示,僅用納米顆粒而無機械牽張作用時,“芯片肺”產(chǎn)生很少或不產(chǎn)生ROS。而在有機械牽張時,相同條件下的納米顆粒則能引起ROS的穩(wěn)定增長。進一步研究表明,ROS的產(chǎn)生量與機械牽張強度成正比,而且長期受到二氧化硅納米顆粒的作用時,即使沒有機械牽張的參與,仍然會產(chǎn)生大量的ROS[3,16-17]。在 “芯片肺”上的研究結果表明,機械牽張能顯著增強由納米材料導致的肺炎發(fā)生,這種效應在小鼠模型上已經(jīng)得到驗證[3]。

3.2 “芯片肺”在肺水腫中的研究 肺水腫可能是由于多種疾病或限制劑量的藥物毒性引起的毛細血管靜水壓或微血管通透性增加所致[21]。研究人員向 “芯片肺”的血管通道中加入IL-2,觀察到大量培養(yǎng)液從液體通道中滲漏,直至氣體通道完全充滿積液。臨床上使用IL-2進行治療惡性黑色素瘤或轉(zhuǎn)移性腎細胞癌時的確能夠引起肺水腫[22],說明 “芯片肺”能在體外模擬肺水腫的發(fā)生[2]。

研究人員利用 “芯片肺”模型進行實驗發(fā)現(xiàn),呼吸運動產(chǎn)生機械牽張能夠放大IL-2 引起血管通透性增高的效應。僅用IL-2處理內(nèi)皮細胞而無機械牽張作用時,肺毛細血管屏障功能受損不嚴重,當有機械牽張作用時,等劑量的IL-2會引起肺毛細血管屏障功能嚴重受損[21,23]。在 “芯片肺”上進一步實驗發(fā)現(xiàn),機械牽張通過激活瞬時感受器電位離子通道4 (transient receptor potential vanilloid 4,TRPV4)增大了細胞間隙,導致毛細血管通透性增加和肺血管滲漏,從而放大了IL-2 引起血管通透性增高的效應[24]。

有數(shù)據(jù)表明TRPV4通道阻滯劑能夠抑制機械牽張引起的效應,研究人員在 “芯片肺”模型上利用TRPV4 通道阻滯劑 (GSK2198374) 驗證了這一推斷。使用GSK2198374完全抑制了IL-2與機械牽張引起肺水腫的效應,該實驗結果與心力衰竭致肺水腫動物模型實驗結果相吻合。除GSK2198374 外,血管緊張素1 (angiotensin 1,Ang-1)與IL-2聯(lián)合使用加入 “芯片肺”的血管通道時,也能有效的抑制內(nèi)皮細胞的滲漏。由此可見,“芯片肺”模型不僅可以模擬臨床上肺水腫的發(fā)生,而且可以用于篩選預防和治療肺水腫的藥物,這為臨床預防和治療肺水腫提供了可靠的依據(jù)[21,23]。

3.3 “芯片肺”在非小細胞肺癌中的研究 肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一,非小細胞肺癌約占肺癌的80%,嚴重危害人類健康[25]。研究人員在 “芯片肺”技術的基礎上采用細胞共培養(yǎng)技術建立了非小細胞肺癌模型。結果發(fā)現(xiàn),呼吸運動產(chǎn)生的機械牽張并沒有促進癌細胞的生長,反而抑制了癌細胞的生長。該結果表明呼吸運動減弱可能會促進肺癌的進展。Hassell等[26]發(fā)現(xiàn)原機械牽張作用明顯降低表皮生長因子 (epidermal growth factor receptor,EGFR)的表達,而大大增強了EGFR Y845、Y998 和Y1068幾個位點的磷酸化,導致相同的抗癌藥物在傳統(tǒng)細胞模型較 “芯片肺”模型敏感性更高。有數(shù)據(jù)表明,細胞間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化因子 (cellular-mesenchymal to epithelial transition factor,c-MET)蛋白的過表達與多種癌癥的發(fā)生以及對癌癥晚期患者產(chǎn)生抗藥性有關。在藥物敏感性降低的非小細胞肺癌 “芯片肺”模型上c-MET 也出現(xiàn)了過表達現(xiàn)象,二者相吻合[27-29]。

3.4 “芯片肺”在氣道疾病中的研究 Benam 等[30]在“芯片肺”技術的基礎上利用小氣道上皮細胞建立正常小氣道模型,并成功的模擬小氣道的多項生理功能。使用IL-13處理該模型模擬哮喘的發(fā)作,觀察到哮喘發(fā)作的典型特征,如杯狀細胞增生,黏液分泌增多,粒細胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor,G-CSF)和粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子 (granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)產(chǎn)生和分泌增強,氣道纖毛擺動頻率降低[31]。使用高劑量的托法替尼處理哮喘模型,觀察到上述現(xiàn)象消失或減輕,與藥物臨床應用效果相符。此外,使用病毒復制時產(chǎn)生的雙鏈RNA 類似物聚胞苷酸[polycytidine acid,poly(I:C)]處理該模型成功模擬了病毒感染引起的哮喘急性發(fā)作[5]。

另外,Benam 等[32]利用COPD 患者小氣道上皮細胞建立COPD 模型,并觀察到COPD 患者的多項特征。他們使用細菌的細胞壁成分脂多糖 (lipopolysaccharide,LPS)和poly(I:C)處理正常小氣道模型和COPD 模型,發(fā)現(xiàn)僅使用poly(I:C)處理COPD 的模型時,才會出現(xiàn)巨噬細胞集落刺激因子 (macrophage colony stimulatory factor,M-CSF)的大量分泌。所以,M-CSF 可以作為病毒引起的COPD 急性加重的特異性標志物[5,32]。利用氣道上皮細胞建立的氣道模型檢驗電子香煙對肺組織產(chǎn)生的影響,結果表明,電子香煙氣溶膠能產(chǎn)生與香煙類似的影響[33]。

3.5 “芯片肺”在肺血栓栓塞中的研究 Jain 等[34]在“芯片肺”的基礎上利用原代肺泡上皮細胞建立肺泡模型,該模型用于研究肺血栓栓塞及其藥物的研究。結果發(fā)現(xiàn),LPS直接活化血管內(nèi)皮細胞不會引起血小板聚集以及血栓形成,而是通過活化肺泡上皮細胞間接引起血栓形成。parmodulin-2 (PM2)是一種潛在的蛋白酶激活受體-1 抑制劑,具有抗炎抗凝作用。使用PM2 提前處理該模型,30 min后再用LPS 處理,發(fā)現(xiàn)血小板聚集的現(xiàn)象明顯降低,說明該模型能有效地評估抗血栓藥物的效果。

4 小結與展望

“芯片肺”可部分代替動物實驗在體外進行研究,能夠較準確地模擬肺的在體狀態(tài),對于呼吸系統(tǒng)疾病的病變特征及機制研究有著重要作用;“芯片肺”可有效的評估新藥的作用效果,對于呼吸系統(tǒng)疾病和藥物的研究具有重要意義。此外,“芯片肺”呼吸運動的動力變化可以通過主觀控制,能夠觀測和研究各種疾病發(fā)展過程中呼吸運動帶來的影響,這在靜態(tài)細胞培養(yǎng)模型和動物模型上是無法進行的。然而 “芯片肺”的發(fā)展還處于起步階段,存在許多不足。例如,真實的氣血屏障由液體層、肺泡上皮細胞層、上皮基膜層、基質(zhì)層、毛細血管基膜層和內(nèi)皮細胞層構成,比“芯片肺”復雜。在模擬肺水腫的 “芯片肺”模型中使用的肺上皮細胞,是從肺癌患者中分離出來的,因此 “芯片肺”不可能完全模擬人體肺泡上皮屏障功能[17,21]。此外,PDMS的機械強度較差,在體外模型的尺寸上限制了 “芯片肺”的開發(fā)與應用;而且PDMS薄膜還會影響到疏水物質(zhì)的吸收,所以在物質(zhì)吸收方面也不能完全與肺相同[35-38]。肺在體內(nèi)并非單一獨立的器官,而是與其他系統(tǒng)相互關聯(lián)的,因此 “芯片肺”雖然能夠在一定程度上模擬肺的生理功能,但是僅限于肺泡水平,而不能模擬肺臟的整體功能以及肺臟與個體的相互作用與聯(lián)系,因此未來的研究重點將會轉(zhuǎn)向人工智能控制的多個器官聯(lián)系的 “多器官芯片”模型甚至 “人體芯片”模型[39-41],從而使我們的研究更加精確的模擬完整個體。

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